Ensayo Actividad locomotora para el Estudio de los ritmos circadianos y del sueño en los parámetros Drosophila

El objetivo general del siguiente experimento es caracterizar los fenotipos circadianos y de sueño en drosófila mediante el análisis de los ritmos diarios de actividad locomotora. Esto se logra generando moscas transgénicas, obteniendo mutantes específicos o realizando los cruces necesarios para preparar los animales experimentales. Como segundo paso, es necesario preparar tubos de vidrio de actividad que contengan una fuente de alimento, los cuales servirán como hábitat de las moscas durante el experimento.

A continuación, se colocan moscas de uno a cinco días de edad en tubos de actividad, que se cargan en monitores de actividad DAM para registrar los ritmos de actividad locomotora. Mediante el sistema DAM se obtienen resultados que mostraron defectos y variaciones en los parámetros circadianos y del sueño, basados en el análisis de los ritmos diarios de actividad locomotora utilizando software como far sex e insomniac. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología circadiana, como qué proteínas y mecanismos reguladores participan en la generación de ritmos adecuados, y por ejemplo, cómo factores ambientales como la luz y la temperatura modulan los ritmos conductuales a través de vías moleculares específicas.

El sistema de monitoreo de la actividad locomotora implica varios equipos, como dispositivos especializados de monitoreo, incubadoras ambientales con capacidad de control lumínico diurno, dispositivos de recolección de datos, computadoras y materiales periféricos como cables. Elija un cuarto oscuro con control de temperatura y buena ventilación para albergar el sistema de monitoreo de la actividad locomotora, a fin de evitar una carga excesiva en las incubadoras y posibles fallos para mantener la temperatura. Además, aísle el cuarto de fuentes de luz externas dentro del cuarto oscuro. No es necesario trabajar completamente a oscuras, ya que el sistema circadiano de las moscas de la fruta no es sensible a la luz infrarroja.

Por lo tanto, en los casos en los que necesitamos ver en la habitación oscura, simplemente utilizamos una linterna estándar cubierta con un filtro rojo, junto con una unidad de respaldo de alimentación ininterrumpida que tenga capacidad suficiente en vatios para alimentar los componentes del sistema de monitoreo de actividad. En caso de un pico de sobretensión o falla de energía en el edificio, conecte la unidad de respaldo de UPS al circuito de respaldo de emergencia del edificio, si está disponible. Si el sistema que controla la iluminación en la incubadora no está regulado directamente por la incubadora, entonces es suficiente conectar la incubadora a la energía de emergencia sin un UPS, ya que la pérdida de energía durante unos segundos no afectará la temperatura de la cámara.

A continuación, configure una computadora, PC o Macintosh dedicada completamente a la recopilación de datos o al control de los incubadores. Organice manualmente la red de líneas telefónicas de forma ordenada alrededor de los estantes de los incubadores con control ambiental para facilitar la conexión y desconexión de las actividades. Configure múltiples líneas telefónicas de manera que converjan en una línea principal y salgan del incubador para conectarse a la computadora; conecte los dispositivos de monitoreo dentro de los incubadores a la computadora mediante una unidad de interfaz de fuente de alimentación, que sirve para alimentar el monitor de actividad a través de la línea telefónica.

Finalmente, tape con cinta adhesiva o cubra con tela negra posibles fuentes de luz de los LED de dispositivos electrónicos o de una puerta de incubadora mal sellada. Para asegurar que se midan ritmos libres en ausencia de luz no deseada. Es fundamental evaluar estos fenotipos utilizando animales control adecuados que se críen en las mismas condiciones ambientales y que tengan la misma edad.

Además, existe un dimorfismo sexual en la ritmicidad circadiana. La práctica general consiste en utilizar moscas macho adultas para estos ensayos, criadas a 25 grados Celsius y con una edad comprendida entre uno y cinco días, ya que la actividad de puesta de huevos en las moscas hembra afectará la medición real de la actividad locomotora. Al examinar los parámetros circadianos y de reposo-sueño de moscas mutantes específicas de interés, es recomendable realizar un cruzamiento externo entre la cepa mutante y la cepa silvestre del mismo fondo genético.

Por ejemplo, W 1118 o yw. Dado que no hay entrecruzamiento en los machos de drosófila, es preferible realizar el cruzamiento cruzando hembras mutantes con machos de tipo silvestre, sembrando tanto el control de tipo silvestre como las moscas mutantes al mismo tiempo. En alimento estándar para drosófila durante aproximadamente 10 a 14 días antes del experimento de ritmo de actividad locomotora, tras la eclosión de la descendencia, recolecte moscas macho de uno a cinco días de edad y resérvelas para usarlas en los experimentos.

Los tubos de actividad representan el hábitat de la mosca. Durante el experimento, son tubos de vidrio delgados de cinco milímetros que contienen sustancia alimenticia en un extremo y están tapados con hilo o un tapón de plástico en el otro extremo. Es preferible utilizar tubos de actividad recién elaborados.

Por lo general, se preparan desde unos días hasta una semana antes de comenzar el experimento. Dado que los tubos de vidrio para actividad se pueden reutilizar varias veces, los siguientes procedimientos de preparación describen el uso de tubos de actividad previamente utilizados y no limpios como punto de partida. Si está utilizando tubos de actividad nuevos, simplemente continúe con la autoclave de los tubos como se muestra más adelante.

Retire los tapones de los tubos de actividad usados y colóquelos en un vaso de precipitados de vidrio grande. El tubo debe llenar solo hasta la mitad del vaso. Llene el vaso con agua del grifo, asegurándose de sumergir completamente los tubos.

Caliente en el microondas el vaso de precipitados lleno con los tubos de vidrio hasta que el agua alcance una ebullición rápida y completa. Para fundir la cera y el alimento de agar, tenga cuidado ya que el agua está caliente. Retire el vaso de precipitados del microondas y agite los tubos con una espátula o de forma plástica.

Pipeta de 10 milímetros para permitir que la cera atrapada flote hacia la parte superior. A continuación, repita el paso de calentamiento en el microondas. Retire el vaso de precipitados del microondas y espere a que se enfríe.

Colocar el vaso de precipitados en la cámara fría acelerará el proceso. A medida que el agua se enfríe, la cera se acumulará en la superficie del agua y se solidificará gradualmente. Retire la cera solidificada manualmente.

Esto debería eliminar la mayor parte de la cera de los tubos. Transfiera los tubos de actividad a un nuevo vaso de precipitados con agua corriente fresca y repita el proceso de calentamiento en microondas y eliminación de cera. Dado que la mayor parte de la cera ya se eliminó en el paso anterior, no es necesario esperar a que la cera se solidifique.

Vierta simplemente el agua del vaso de precipitados y transfiera los tubos a un nuevo vaso. Tenga cuidado ya que el agua aún está caliente. Repita el proceso de microondas por última vez.

Vierta el agua fuera del vaso de precipitados y espere a que los tubos de actividad se enfríen. A continuación, coloque los tubos de actividad verticalmente en vasos de precipitados de vidrio de 250 mililitros o 500 mililitros. Asegúrese de que no estén demasiado apretados.

Esterilícelos utilizando un autoclave con un ciclo de secado o simplemente seque los tubos en una estufa de secado para preparar el alimento que se cargará en los tubos de actividad. Prepare una solución de 5% de sacarosa y 2% de agar Bact en agua destilada o del grifo y esterilice la solución en el autoclave. El alimento esterilizado en el autoclave puede usarse inmediatamente o almacenarse a cuatro grados Celsius durante un período prolongado.

Idealmente, el alimento debe estar alrededor de 65 grados Celsius al llenar los tubos de actividad. Utilice una pipeta de 10 mililitros para pipetear la solución líquida de alimento a lo largo de la pared interna del vaso de vidrio, llenando los tubos hasta que estén llenos hasta un tercio, desde el fondo hacia arriba. Gire suavemente el vaso para asegurarse de que todos los tubos se llenen de manera uniforme con la solución de alimento.

Espere a que la comida se solidifique completamente, ya sea a temperatura ambiente o a cuatro grados Celsius. Una vez que la condensación dentro de los tubos de vidrio desaparezca, los tubos pueden retirarse del vaso. Para retirar los tubos de actividad del vaso, empuje los tubos hacia el fondo del vaso y gírelos al mismo tiempo, de modo que la comida solidificada dentro de los tubos y el fondo del vaso se separen.

Saque los tubos del vaso de precipitados, preferiblemente todos juntos como un solo grupo. A continuación, limpie los tubos uno por uno con toallas de papel para eliminar el exceso de alimento de la superficie externa de los tubos. Coloque los tubos aparte en un recipiente limpio.

Tome un calentador de bloque de laboratorio general sin el soporte para tubos y cubra cuidadosamente el orificio de calentamiento. Con varias capas de papel de aluminio resistente, agregue pastillas de parafina al orificio de calentamiento forrado con aluminio para derretirlas, sostenga los tubos por el extremo no alimenticio y sumerja el extremo alimenticio en la cera derretida. Sumerja la porción con cera en un vaso de precipitados lleno de agua fría para acelerar la solidificación de la cera. Repita.

Sumergir brevemente los tubos de cera en agua evitará que se peguen entre sí. Los tubos pueden usarse inmediatamente o almacenarse en un recipiente hermético a cuatro grados Celsius para su posterior uso. Si se almacenan por más de una semana, el almacenamiento prolongado provocará un secado excesivo del alimento.

Si los tubos se almacenan a cuatro grados Celsius, déjelos a temperatura ambiente colocándolos sobre la mesa de trabajo antes de usarlos. Antes de introducir las moscas en los tubos de actividad, encienda los incubadores que se utilizarán para alojar los monitores de actividad. Ajuste la temperatura mediante los controles del incubador y configure el régimen de luz-oscuridad utilizando el controlador de luz del sistema DAM o el sistema de control de luz propio del incubador, según el diseño experimental deseado.

A continuación, anestesie las moscas con dióxido de carbono. Luego, utilizando un pincel fino, transfiera suavemente una mosca individual a un tubo de actividad. Sujete con pinzas finas la parte media de un trozo de hilo de aproximadamente medio pulgada de largo e inserte el hilo en el extremo del tubo de actividad que no contiene alimento, para tapar la abertura y evitar que la mosca escape durante el experimento.

A la vez que permite el flujo de aire hacia el interior del tubo, mantenga el tubo acostado de lado hasta que la mosca despierte. Para evitar que la mosca quede atrapada en el alimento, inserte los tubos en los monitores de actividad. Con el modelo más nuevo y compacto de los monitores Tri Kinetics, es necesario sujetar los tubos en su lugar con bandas de goma para asegurar que el haz de infrarrojos atraviese el tubo en la posición central. Finalmente, coloque los monitores de actividad en los incubadores y conéctelos al sistema de recolección de datos mediante los cables telefónicos para verificar.

Utilice el software de recolección del sistema DAM para verificar que todos los monitores estén conectados correctamente y que se esté recolectando datos de cada uno de ellos. Ahora que las moscas han sido cargadas en los tubos de actividad y el sistema de monitoreo de la actividad locomotora está listo, los datos ya pueden registrarse. Las moscas se sincronizan y se adaptan exponiéndolas al régimen deseado de luz, oscuridad o ciclo LD y temperatura durante dos a cinco días completos.

La condición de sincronización más comúnmente utilizada es un ciclo luz-oscuridad de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad a 25 grados Celsius. Para el estudio de los ritmos circadianos con respecto a este protocolo, el momento en que se enciende la luz en el incubador se define como el tiempo Zeitebeger (ZT) cero, y todos los demás tiempos son relativos a ese valor. Bajo condiciones estándar de luz-oscuridad 12:12, los *Drosophila melanogaster* típicamente exhiben dos periodos de actividad: uno centrado alrededor del ZT cero, denominado pico matutino, y otro alrededor del ZT 12, denominado pico vespertino. Los ritmos de actividad locomotora en condiciones libres se miden bajo condiciones constantes de oscuridad y temperatura, tras el periodo de sincronización.

La configuración del ciclo de luz puede cambiarse en cualquier momento durante la fase oscura del último día de LD, de modo que el día siguiente del experimento represente el primer día de DD. La recopilación de datos durante siete días de DD es suficiente para calcular el período circadiano y la amplitud o intensidad del ritmo de las moscas. En general, se requiere un tamaño de muestra de al menos 16 moscas para obtener períodos libres confiables para un genotipo determinado.

Al finalizar el experimento, los datos binarios brutos recopilados mediante el software del sistema DAM se descargan en un dispositivo portátil de almacenamiento de datos. Por ejemplo, una memoria USB. Los datos binarios brutos se procesan utilizando DAM file scan 1 0 2 x y se suman en intervalos de 15 y 30 minutos al analizar parámetros circadianos, o en intervalos de uno a cinco minutos al analizar el sueño.

Parámetros de reposo. Actualmente, cinco minutos contiguos de inactividad es la definición estándar de reposo asociado al sueño en Drosophila. Tras completar este protocolo, se puede utilizar el mismo conjunto de datos para comparar los parámetros circadianos y de sueño de los animales experimentales y de control respecto a los parámetros circadianos.

Se pueden generar gráficos de actividad que ilustran las actividades locomotoras diarias o las actividades promedio de las moscas durante varios días en condiciones de luz-oscuridad (LD) o de oscuridad total (DD) utilizando el sistema fast x oph. Drosophila melanogaster generalmente exhibe dos periodos de actividad: uno centrado alrededor de ZT cero, denominado pico matutino, y otro alrededor de ZT 12, denominado pico vespertino. Estos dos periodos de actividad están controlados por el reloj endógeno y pueden observarse incluso en condiciones libres de DD. Los cambios en el momento de estos picos de actividad pueden observarse fácilmente en los gráficos de inducción y podrían indicar una alteración en las propiedades del reloj endógeno.

Otra propiedad que indica un funcionamiento adecuado del reloj es el aumento anticipado de la actividad locomotora observado en ciclos LD, que ocurre antes de las transiciones reales de oscuro a luz o de luz a oscuro. Este comportamiento se observa claramente en moscas de tipo silvestre, pero está ausente y es arítmico en los mutantes per cero. En este mutante.

Los picos matutinos y vespertinos observados en LD son meramente respuestas de sobresalto debidas a cambios bruscos en las condiciones de luz y oscuridad. Las moscas sin reloj no anticipan los cambios ambientales, sino que simplemente reaccionan ante ellos. La pérdida de la ritmicidad conductual es mucho más pronunciada en DD y generalmente se manifiesta como la pérdida total de los picos matutinos o vespertinos de actividad locomotora, tal como se observa en moscas per cero.

Además de los gráficos de inducción, los datos de actividad locomotora pueden representarse como un doble actograma para cada mosca individual o genotipo de mosca, donde dos días de datos se trazan secuencialmente en cada línea, pero el perfil del último día comienza la siguiente línea de dos días de actividad. Por ejemplo, LD uno y dos se trazan en la primera línea del actograma. La siguiente línea comienza con una repetición de LD dos y continúa con LD tres, y así sucesivamente.

Tras seguir este formato, los datos de actividad locomotora que abarcan todo el experimento se ilustran en el actograma. Una ventaja de los actogramas frente a las gráficas de reducción es que un cambio en la duración del período de la actividad diaria es fácilmente observable, además de la generación de gráficas de inducción y actogramas.

Los datos de actividad locomotora de la condición DD se pueden enviar a far X para calcular la longitud del período utilizando varios programas diferentes, incluido cycle P para el análisis de los parámetros de sueño y reposo, que se define como cinco minutos contiguos de inactividad. Se pueden analizar los datos registrados a partir de los ensayos de actividad locomotora y examinar múltiples parámetros del sueño utilizando insomniac, un programa basado en MATLAB; el porcentaje de tiempo que las moscas pasan durmiendo se puede calcular en diferentes intervalos de tiempo. Por ejemplo, el porcentaje de sueño cada hora o cada 12 horas.

Otros parámetros de sueño más comunes que pueden examinarse incluyen la duración media de los episodios de reposo, que es una medida de cuán consolidado está el sueño y puede ilustrar la calidad del mismo. Otro parámetro es el conteo de actividad durante la vigilia, que mide la tasa de actividad cuando las moscas están despiertas. Este parámetro ayuda a diferenciar entre moscas que realmente presentan alteraciones en el sueño o en los comportamientos de reposo frente a aquellas que están enfermas o son hiperactivas.

Por ejemplo, las moscas que simplemente están enfermas pueden parecer dormir más porque no son tan móviles. En el caso de estas moscas, su actividad durante la vigilia será menor en comparación con los animales de control. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo caracterizar los fenotipos circadianos y de sueño en Drosophila mediante ensayos. Ritmos diarios de actividad locomotora.