Aislamiento de células endoteliales valvular

En este protocolo en video se demuestra el aislamiento de células endoteliales intersticiales residentes y específicas de cada lado de una válvula aórtica cardíaca. La cúspide valvular se extrae del corazón y se coloca en una solución salina fría. La capa endotelial se puede eliminar de ambos lados de la cúspide mediante una suave acción de cizallamiento del tejido sumergido en una solución de colagenasa con un hisopo de algodón; para el aislamiento específico por lado, la cúspide valvular se fija sobre un lecho de parafina de modo que la superficie endotelial quede expuesta.

A continuación, se añaden unas gotas de colagenasa fría a la valva, y las valvas se incuban durante cinco a 10 minutos. Tras la incubación con colagenasa, la capa endotelial específica de cada lado se elimina mediante una tracción suave del tejido. Con un hisopo, se recogen entonces las células endoteliales liberadas, se lavan y se siembran.

Los lefletes restantes se digieren luego durante la noche para aislar las células intersticiales, que se recolectan y lavan. Todas las células aisladas se cultivan y pueden utilizarse para comprender su papel en la reparación y remodelación de las válvulas cardíacas en respuesta a señales mecánicas y biológicas locales. Hola, me llamo Russell Gould.

Estoy aquí en la Universidad de Cornell, en el departamento de ingeniería biomédica, trabajando en el laboratorio de Butcher. Hoy les mostraré cómo aislar células endoteliales valvulares. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la comprensión de cómo las células V residentes reparan y remodelan constantemente en respuesta a señales mecánicas y biológicas.

Así que comencemos. Para empezar, obtenga un cerdo de su matadero local y trabaje de forma aséptica para excisar la raíz aórtica. Enjuague cuidadosamente la raíz aórtica para eliminar la sangre.

Con DPBS frío y estéril, es imprescindible eliminar todos los componentes sanguíneos lo antes posible para limitar la muerte de las células endoteliales valvulares o VEC y la contaminación bacteriana. No se recomiendan antibióticos ni antimicóticos en esta etapa, ya que podrían ser perjudiciales para las ecs. A continuación, aísle directamente desde la raíz tres.

Láminas valvulares de cada válvula. Sea conservador al aislar la lámina, ya que cualquier tejido anular contaminará la población celular. Coloque las láminas aisladas en un tubo cónico estéril de 15 mililitros lleno con 12 mililitros de DPBS frío.

Agite varias veces para eliminar los residuos y rellene con DPBS fresco. Finalmente, transporte las valvas valvulares de regreso al laboratorio sobre hielo. Al llegar al laboratorio, coloque el recipiente con el tejido bajo la campana estéril y proceda a aislar la capa endotelial; esterilice en autoclave lo siguiente en una bandeja de instrumentos con tapa: pinzas de tejido dentadas, tijeras de tejido y torundas de algodón.

Prepare también solución estéril de colagenasa, medio endotelial y medio intersticial. Como se detalla en el protocolo escrito adjunto. Llene un recipiente estéril de 35 milímetros con tres mililitros de solución fría de colagenasa por válvula, y coloque las tres cúspides del tubo de 15 mililitros en el recipiente.

Incube el tejido durante cinco a 10 minutos a 37 grados Celsius. A continuación, retire suavemente la capa endotelial de ambos lados del velo mediante la rotación de un hisopo estéril seco sobre la superficie. La dirección de la rotación y la cantidad de cizallamiento aplicado son fundamentales para la pureza de la muestra.

La rotación del hisopo se realiza en una dirección opuesta al movimiento lineal de la mano que sostiene el hisopo de algodón. Esto crea un cizallamiento controlado que desprende las células endoteliales del tejido. La cantidad de fuerza aplicada debe ser suficiente para sentir la resistencia del tejido, pero sin penetrar la membrana basal; sumerja ocasionalmente el hisopo en la solución de colagenasa para desprender las células de las fibras de la punta.

Tras completar el frotis, la textura de la capa endotelial debe sentirse ligeramente más suave que antes. Recolecte las células suspendidas en la solución de colagenasa y transfiera a un nuevo tubo estéril de 15 litros. Después de frotar las células endoteliales de las valvas, coloque inmediatamente las valvas en un tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de solución de colagenasa para el aislamiento de células intersticiales.

Centrifugar los tubos a 1000 RPM durante cinco minutos a temperatura ambiente para sedimentar cualquier célula aislada, aspirar el sobrenadante. Añadir tres mililitros de medio endotelial a los tubos de 15 mililitros. Centrifugar una segunda vez como antes y aspirar el medio.

Esta segunda centrifugación ayuda a filtrar algunos materiales no deseados, como las fibras de las puntas. Re-suspenda las células endoteliales en cinco mililitros de medio endotelial y siembre las células en un frasco T25 previamente recubierto con colágeno. Utilizando un frasco por tubo de centrífuga, deje crecer las células al menos de dos a tres días antes de cambiar el medio endotelial.

Esto ayuda a que las células se recuperen y se dividan. Dado que el proceso de aislamiento es bastante agresivo y el rendimiento celular puede ser bajo, es fundamental pasear las células cerca de la confluencia. Dado que la inhibición por contacto podría provocar la transformación celular, también se pueden aislar células endoteliales de un lado específico.

Para ello, primero prepare una placa de Petri que contenga una línea de cama de parafina. Placas de Petri de vidrio de 60 milímetros con papel de aluminio. Calcule dos placas de vidrio por folíolo.

El papel de aluminio ayuda a eliminar la parafina para reutilizar la placa de Petri. A continuación, coloque perlas de parafina en las placas hasta aproximadamente la mitad y cúbralas para la autoclave. Una vez que finalice la autoclave y la parafina se haya fundido, traslade el conjunto de placas a una superficie plana fría.

A medida que el parafina se enfría, se endurece y forma una capa que soportará las punciones con aguja. Después de 60 minutos, el recipiente esterilizado puede utilizarse para inmovilizar el tejido del velo. Retire los velos aislados de la válvula de los tubos de 15 mililitros y colóquelos sobre el lecho de parafina.

Manipule los velos de manera que el lado ventricular quede hacia abajo sobre la superficie de parafina, dejando expuesto el lado con fibrosis. Fije los bordes del velo para exponer la capa endotelial. A continuación, coloque unas gotas de colagenasa fría sobre cada superficie endotelial expuesta hacia arriba e incube el tejido durante cinco a 10 minutos a 37 grados Celsius.

Una vez finalizada la incubación, retire suavemente la capa endotelial como antes, rotando un hisopo estéril seco sobre la superficie del velo. Ocasionalmente, toque ligeramente el hisopo dentro de la solución de colagenasa para desprender las células de las fibras de la punta. Tras completar el hisopado, la textura de la capa endotelial debe sentirse ligeramente más suave que antes.

Recolecte la suspensión celular y transfiera a un nuevo tubo estéril de 15 mililitros. Indique la especificidad lateral en las láminas etiqueta; las láminas procedentes de la misma válvula pueden agruparse conjuntamente. Enjuague la válvula inmovilizada utilizando unas gotas de DPBS frío para lavar cualquier célula o residuo restante.

Transfiera los levementes a un nuevo recipiente de cultivo de manera que ahora quede expuesta la cara ventricular y recoja las células endoteliales tal como se acaba de mostrar. Una vez completada la recolección de células endoteliales del levemente G, coloque inmediatamente los levementes en un tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de solución de colagenasa. Lave las células resus, suspéndalas y cultívelas como se indicó para el aislamiento no específico por lados de las células endoteliales.

Si el rendimiento celular es muy bajo, considere pasar a un matraz más pequeño o usar una placa de pocillos. Dado que la adhesión célula-célula promueve el crecimiento celular, recuerde pasear las células cerca de la confluencia. Dado que la inhibición por contacto podría provocar la transformación celular, inicie el aislamiento de células intersticiales mientras centrifuga las células endoteliales e incuba los tubos que contienen las valvas durante aproximadamente 12 a 18 horas.

En solución de colagenasa, agitando suavemente si se desea. Al final del período de incubación, utilice una pipeta serológica para mezclar suavemente el tejido digerido hasta que la suspensión celular se homogenice. Esta homogenización ayuda a desagregar el tejido y liberar las células intersticiales. Centrifugue y lave las células como se muestra para las células endoteliales.

Salvo que se utilicen cinco mililitros de medio intersticial resus, suspenda las células intersticiales del centrífugo en 15 mililitros de medio intersticial y siembre las células en un matraz T75, utilizando un matraz por tubo de centrífuga. Deje crecer las células al menos uno o dos días antes de cambiar el medio intersticial; espere más restos de tejido que con las células endoteliales. Además, las células intersticiales alcanzan la confluencia más rápido que las células endoteliales por naturaleza y proporcionan mayores rendimientos celulares en estas imágenes representativas.

La morfología de las células endoteliales valvulares cultivadas (V Cs) y frente a las células intersticiales valvulares se muestra a los dos o tres días. Las BECs exhiben una morfología endotelial típica en la que las células presentan un patrón de adoquines y comienzan a formar grupos.

El VS. Exhibe una morfología similar a la de los miofibroblastos, en la cual las células son generalmente en forma de huso y escasamente pobladas cuando se cultivan hasta confluencia; las ECS exhiben una morfología endotelial típica, en la que las células presentan un patrón de adoquín y su crecimiento está inhibido por contacto. Las VI CS exhiben una morfología similar a la de los miofibroblastos, en la cual las células son generalmente en forma de huso y no están inhibidas por contacto. Las características funcionales tanto de las VEC como de las VIC pueden inferirse a partir de la tinción. Para la captación de LDL marcada.

Las células VEC se asocian con altos niveles de captación de LDL acetilada. Mientras que las células VIC se asocian con bajos niveles de captación de LDL acetilada, aquí se muestran los marcadores celulares de VEC y VIC. Las células ECS se tiñen positivas para el factor de von Willebrand, mientras que vs.

No deben mostrar tinción de factor de von Willebrand. Además, las CVP se tiñen negativas para alfa actina muscular lisa, mientras que las CVP se tiñen positivas para alfa actina muscular lisa. Bueno, espero que hayan aprendido mucho de nuestras aislamientos de hoy.

Es importante recordar, sin embargo, que la membrana basal de la célula endotelial es muy frágil y cualquier alteración en la matriz subyacente suele liberar células contaminantes del resto del tejido. Para confirmar un aislamiento exitoso, la caracterización es fundamental para evaluar la pureza de sus aislamientos. Así que mucha suerte.