Evaluación de la respuesta estomática de las células bacterianas en vivo utilizando imágenes de Hoja Entera

En este procedimiento, la imagen de hojas se utiliza para evaluar el movimiento de las células guardianas en respuesta a células bacterianas vivas. Primero, se aclimatan las bacterias a partir de un stock de glicerol y se prepara un inóculo. Luego, se recolectan hojas jóvenes y sanas y se tiñen con yoduro de propidio.

Las hojas teñidas se cortan y los fragmentos de hoja se incuban sobre la superficie de una suspensión bacteriana. Finalmente, se observa la superficie de la hoja bajo el microscopio y se pueden medir las aberturas estomáticas. Los resultados obtenidos mediante microscopía de fluorescencia muestran cambios en la abertura estomática en respuesta a las bacterias.

La principal ventaja de este método frente a los métodos existentes, como el uso de láminas epidérmicas, es que la hoja en contacto con las bacterias permanece intacta, lo que simula las condiciones naturales para la penetración bacteriana en las hojas. Para comenzar este procedimiento, siembre semillas de Arabidopsis en una mezcla en proporción uno a uno, v/v/v, de sustrato de cultivo y vermiculita. Cultive las plantas en una cámara de crecimiento y riegue según sea necesario.

Las plantas estarán listas para usar en cuatro a seis semanas, cuando tengan hojas jóvenes completamente expandidas y antes de la floración. Dos días antes de comenzar el experimento, prepare el cultivo bacteriano por siembra. Inocule Pseudomonas syringae a partir del stock glicerolado en medio LB modificado e incube durante 24 horas a 28 grados Celsius.

Utilice un cultivo fresco para preparar el inóculo y siempre inicie las placas de cultivo a partir de stocks glicerolados. Dado que las bacterias pierden virulencia tras el subcultivo, use bacterias que crecieron en la placa para iniciar un cultivo líquido de 10 mililitros de pseudomona singe. Incube el cultivo durante la noche en un matraz erlenmeyer de 50 mililitros a 28 grados Celsius con agitación vigorosa hasta que alcance una densidad óptica o od a 600 nanómetros entre 0,8 y uno.

Mida la DO a 600 y recopile las células mediante centrifugación a 1.360 ×g durante 10 minutos. Resuspenda las células en agua destilada de modo que la DO final sea 0,2. Esta DO corresponde a 10 elevado a ocho unidades formadoras de colonias por mililitro.

Con las bacterias preparadas, proceda a preparar las hojas y realizar el ensayo para teñir las hojas. Primero, prepare una solución de yoduro de propidio, o PI, de 20 micromolar en agua. Son suficientes 10 mililitros de solución para teñir tres hojas pequeñas a la vez.

Retire las plantas de la cámara de crecimiento y, con pinzas, separe tres hojas jóvenes completamente expandidas. Sumerja las hojas enteras en la solución de yoduro de propidio (PI) durante cinco minutos. Luego, retire las hojas y enjuáguelas brevemente con agua destilada.

A continuación, coloque una hoja con la superficie inferior hacia abajo sobre un portaobjetos. Corte la hoja con una cuchilla de afeitar afilada en cuatro piezas, excluyendo la vena media para que la hoja quede plana sobre el portaobjetos e incube las bacterias con las hojas. Añada 300 microlitros de suspensión bacteriana debajo de los trozos de hoja sobre el portaobjetos, asegurándose de que la superficie inferior de la hoja esté en contacto con el inóculo.

Incube las muestras en las mismas condiciones ambientales que se utilizaron para cultivar las plantas. Cuando sea el momento de observar las hojas al microscopio, transfiera los trozos de hoja a un nuevo portaobjetos con la superficie inferior hacia arriba. Tenga en cuenta que no se utiliza un cubreobjetos al montar los portaobjetos.

La misma muestra de hoja puede ser imagenada varias veces durante la incubación, y un curso temporal puede establecerse según los objetivos de la investigación. Aquí, se utiliza un microscopio confocal de barrido láser para examinar las hojas, observar la superficie inferior de las hojas para detectar la fluorescencia de PI utilizando las mismas muestras de hoja, y capturar imágenes del estoma a lo largo del tiempo. Guarde las imágenes para medir el ancho de la abertura estomática.

Mida el ancho de la abertura estomática de al menos 60 estomas para cada tratamiento en cada punto de tiempo. Utilizando el navegador de imágenes LSM, calcule el promedio y el error estándar del ancho de la abertura estomática. La significancia estadística de los resultados se puede calcular utilizando una prueba t de Student emparejada de dos colas.

Este es un ejemplo típico de una imagen microscópica de la superficie de una hoja de Arabidopsis observada mediante microscopía confocal de barrido láser. En la vista de campo claro, el yoduro de propidio tiñe la pared celular de las células viables, aumentando la visibilidad de las células guardianes y permitiendo además la identificación de células no dañadas. En estas micrografías se puede observar una variedad de aperturas estomáticas, desde un estoma completamente cerrado hasta uno completamente abierto.

Los estomas completamente cerrados se identifican por la forma de las células guardianas. Para los estomas abiertos, el ancho de la abertura se considera cero micrómetros. El ancho de la abertura mostrado se mide utilizando una línea recta trazada a través de la zona más ancha del poro del estoma.

Estos son resultados experimentales típicos del ensayo de inoculación en hojas vivas. Las hojas de Arabidopsis se incubaron en la oscuridad con tres cepas diferentes de Pseudomonas Cy Ringe, y solo la bacteria P-S-T-D-C 3000 fue capaz de abrir los estomas cerrados en la oscuridad, según se midió por el ancho de apertura de 60 estomas seleccionados aleatoriamente por cepa bacteriana. Esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de las interacciones planta-bacteria exploren los mecanismos de respuesta temprana a patógenos en especies vegetales.