Evaluación de la respuesta estomática de las células bacterianas en vivo utilizando imágenes de Hoja Entera

En este procedimiento, se utilizan imágenes de hojas para evaluar el movimiento de las células protectoras en respuesta a células bacterianas vivas. En primer lugar, se preparan las bacterias cultivadas a partir de un caldo de glicerol y un inóculo. Luego, se recolectan hojas jóvenes y sanas y se tiñen con yoduro de propidio.

Las hojas manchadas se cortan y los trozos de hojas se incuban en la parte superior de una suspensión bacteriana. Finalmente, se observa la superficie foliar bajo el microscopio y se pueden medir las aberturas estomáticas. Los resultados obtenidos mediante microscopía de fluorescencia muestran cambios en la apertura estomática en respuesta a las bacterias.

La principal ventaja de este método sobre los métodos existentes como el uso de cáscaras epidérmicas, es que la hoja en contacto con las bacterias está intacta, imitando las condiciones naturales para la penetración bacteriana en las hojas para comenzar este procedimiento. Por lo tanto, las semillas de Arabidopsis en una mezcla de medio de cultivo uno a uno, a uno V a V a V. Encuentre la luz de la amita de vermiculita, cultive las plantas en una cámara de crecimiento y riegue según sea necesario.

Las plantas están listas para usar en cuatro a seis semanas cuando tienen hojas jóvenes y completamente expandidas antes de brotar. Dos días antes de comenzar el experimento, prepare la raya de cultivo de bacterias. Las Pseudomonas se unen a partir del caldo de glicerol en medio LB modificado e incuban durante 24 horas a 28 grados centígrados.

Utilice cultivo fresco para preparar el inóculo y siempre comience las placas de cultivo a partir de caldos de glicerol. A medida que las bacterias se vuelven menos virulentas después del subcultivo, use las bacterias que crecieron en la placa para comenzar un cultivo líquido de 10 mililitros de pseudomona singe. En un matraz Erlenmeyer de 50 mililitros, incubar el cultivo durante la noche a 28 grados centígrados con agitación vigorosa hasta que alcance una densidad óptica o un diámetro de 600 nanómetros entre 0,8 y uno.

Mida el OD a 600 y recoja las células por centrifugación a 1, 360 veces G durante 10 minutos. Resus suspende las células en agua destilada para que el OD final sea de 0,2. Este od corresponde a 10 a las ocho unidades formadoras de colonias por mililitro.

Con las bacterias listas, proceda a preparar las hojas y realice el ensayo con el fin de teñir las hojas. Primero, prepare una solución de propidio, yoduro o PI de 20 micromolares en agua. 10 mililitros de solución son suficientes para teñir tres hojas pequeñas a la vez.

Recupere las plantas de la cámara de crecimiento y, con pinzas, separe tres hojas jóvenes completamente expandidas. Sumerja las hojas enteras en la solución PI durante cinco minutos. Luego retire las hojas y enjuáguelas brevemente con agua destilada.

A continuación, coloque una hoja con la superficie inferior hacia abajo en un portaobjetos de microscopio. Corta la hoja con una cuchilla de afeitar afilada en cuatro piezas, excluyendo la vena media para que la hoja quede plana sobre el portaobjetos para incubar las bacterias con las hojas. Agregue 300 microlitros de suspensión bacteriana debajo de los trozos de hoja en el portaobjetos, asegúrese de que la superficie inferior de la hoja esté en contacto con el inóculo.

Incubar las muestras en las mismas condiciones ambientales que se utilizaron para cultivar las plantas. Cuando sea el momento de observar las hojas bajo el microscopio, transfiera los trozos de hojas a un nuevo portaobjetos con la superficie inferior hacia arriba. Tenga en cuenta que no se utiliza un cubreobjetos al montar las guías.

La misma muestra de hojas se puede obtener varias veces durante la incubación, y se puede establecer un curso de tiempo de acuerdo con los objetivos de la investigación. Aquí, se utiliza un microscopio confocal de barrido láser para examinar las hojas, observar la superficie inferior de las hojas para detectar la fluorescencia de PI utilizando las mismas muestras de hojas, capturar imágenes del estoma a lo largo del tiempo. Guarde las imágenes para medir la anchura de la apertura estomática.

Mida el ancho de la abertura estomática de al menos 60 estomas para cada tratamiento en cada punto de tiempo. Con el explorador de imágenes LSM, calcule el error medio y estándar para la anchura de apertura de los estomas. La significación estadística de los resultados se puede calcular utilizando estudiantes sabios emparejados de dos colas.

La prueba T aquí es una imagen microscópica típica de la superficie de una hoja de arabidopsis bajo un microscopio confocal de escaneo láser. En la vista de campo claro, el yoduro de propidio tiñe la pared celular de las células viables, lo que aumenta la visibilidad de las células protectoras, además de permitir la identificación de las células no dañadas. En estas micrografías se puede ver una variedad de aberturas de PO estomáticas, desde un estoma completamente cerrado hasta un estoma completamente abierto.

Los estomas completamente cerrados se identifican por la forma de las células protectoras. Se considera que el ancho de apertura es de cero micrómetros para el estoma abierto. La anchura de apertura que se muestra se mide mediante una línea recta trazada a través de la zona más ancha del poro del estoma.

Estos son resultados experimentales típicos del ensayo de inoculación de hojas vivas. Las hojas de Arabidopsis se incubaron en la oscuridad con tres cepas diferentes de pseudomonas Cy Ringe, solo la bacteria P-S-T-D-C 3000 pudo abrir el estoma clo oscuro medido por el ancho de apertura de 60 estomas seleccionados al azar por cepa bacteriana. Esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de las interacciones planificadas de bacterias exploren los mecanismos de respuesta temprana a los patógenos en las especies de plantas.