Estimación de las tasas de producción de virus en los sistemas acuáticos

El objetivo general de este procedimiento es determinar la tasa a la que se producen virus en comunidades microbianas acuáticas. Esto se logra primero reduciendo la abundancia de virus libres en la muestra de interés, manteniendo al mismo tiempo la comunidad microbiana nativa. El segundo paso del procedimiento consiste en incubar muestras bajo condiciones que induzcan actividad y recolectar submuestras cada dos o tres horas durante un máximo de 10 horas.

El tercer paso del procedimiento consiste en enumerar los virus presentes en las submuestras recogidas de cada punto temporal. El paso final del procedimiento es determinar la tasa a la que aumentó la abundancia de partículas virales dentro de la muestra y calcular las tasas de producción viral. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren las tasas a las que se están produciendo virus dentro de la comunidad microbiana a partir de las enumeraciones, lo que permite a los investigadores inferir las tasas de mortalidad microbiana debida a la actividad viral.

Hola a todos. Mi nombre es Audrey Madison y trabajo en el laboratorio del Dr. Steven Milham y en el Departamento de Microbiología de la Universidad de Tennessee. Hoy, con la ayuda de Charles Budoff y Claire Campbell, les mostraremos un procedimiento para analizar las tasas de producción de virus en sistemas acuáticos.

Para hacer esto, reducimos la cantidad de virus libres en las muestras y enumeramos la tasa a la que vuelven a aparecer tras la lisis de microorganismos infectados por virus. Actualmente utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la ecología de los virus y cómo podrían moldear las comunidades microbianas. Ahora que los hemos presentado, sigamos adelante y comencemos.

Antes de que pueda comenzar este procedimiento, recolecte aproximadamente 20 litros de agua de mar de la manera más aséptica posible. Una vez recolectada la muestra, prefiltre el agua a través de un filtro de 0,8 micrones de diámetro de 142 milímetros. Para sistemas biológicamente productivos, se puede realizar previamente una filtración a través de un filtro de mayor tamaño de poro o de fibra de vidrio.

Para obtener agua ultrafiltrada, configure un sistema de ultrafiltración como el sistema AmCon M 12 con un cartucho de membrana enrollada en espiral para excluir todos los virus. Los virus en la muestra se eliminan y concentran entonces a aproximadamente el 25 % de la velocidad máxima con una presión de retroceso de 15 a 16 kilopascales. El retenido, de aproximadamente 500 mililitros, contiene la comunidad viral ahora concentrada, que puede guardarse para otros estudios, mientras que el permeado libre de virus se utilizará en ensayos de producción viral.

Después de cada día de uso, limpie el sistema Omicron M 12 para prevenir daños en la membrana del cartucho de filtro. Al trabajar con agua de mar, enjuague la membrana con al menos seis litros de agua Milli Q, seguido de un lavado con solución de hidróxido de sodio 0,1 molar durante 30 a 45 minutos. Luego, enjuague el cartucho con al menos seis litros más de agua Milli Q.

Una vez finalizado, el cartucho en espiral se puede almacenar en una solución de ácido fosfórico 0,05 molar a cuatro grados Celsius. Para iniciar el método de reducción viral, se colocan 500 mililitros de muestra de agua de mar del mismo lugar donde se obtuvo el agua libre de virus en una unidad de filtro estéreo con un filtro de baja unión a proteínas y tamaño nominal de poro de 0,2 micrómetros. En este momento, también se debe recolectar una submuestra para determinar la abundancia total de virus y bacterias en el agua inicial.

Presione suavemente la muestra al vacío a menos de 200 milímetros de mercurio mientras suspende continuamente la muestra mediante una pipeta estéril para transferencia, con el fin de inhibir que las células bacterianas se concentren en el filtro. Añada lentamente tres volúmenes de 500 mililitros del ultrafiltrado a la suspensión bacteriana para reducir la abundancia de virus libres en la muestra, manteniendo al mismo tiempo las poblaciones bacterianas a una densidad constante. Finalmente, diluya la fracción bacteriana nuevamente hasta 500 mililitros con agua ultrafiltrada libre de virus. A continuación, divídala en tres réplicas de 150 mililitros y coloque las réplicas en botellas de policarbonato transparentes de 250 mililitros.

Esto representa su conjunto de muestras en el tiempo cero. Tome muestras para estimar la abundancia bacteriana y viral a partir de sus muestras en el tiempo cero. Transfiera las muestras a viales criogénicos con una concentración final de 2,0 a 2,5 % de glutaraldehído estéril.

Como agente fijador, congele inmediatamente por inmersión en nitrógeno líquido estas muestras y almacénelas a menos 80 grados Celsius hasta su procesamiento. Alternativamente, puede utilizarse un sistema de flujo tangencial para concentrar los microbios marinos. Para emplear el método de filtración por flujo tangencial, obtenga aproximadamente 500 mililitros de la muestra natural.

Concentre esta muestra utilizando un sistema de filtración tangencial con un tamaño nominal de poro de 0,2 micrones cuando la fracción bacteriana se reduzca a aproximadamente 10 a 15 mililitros con agua ultrafiltrada libre de virus, como se describió para el método de reducción de virus, e incube las botellas resultantes en réplicas en condiciones de incitación. Utilizando cámaras ambientales en el mar, empleamos incubadores con agua de mar circulante conectados a una fuente de agua superficial que mantiene temperaturas ambientales. Los niveles de luz pueden ajustarse a las condiciones superficiales utilizando acrílico teñido de azul o una red de sombreado de densidad neutra para disminuir la intensidad lumínica.

Cuando se trabaje desde una estación de campo o laboratorio, o cuando no haya disponibilidad de agua de mar, se puede utilizar un incubadora de crecimiento con luz. Continúe recolectando submuestras cada 2,5 horas durante al menos 10 horas mediante el método realizado para la muestra en el tiempo cero. Además de las muestras para microscopía, algunos investigadores desearán recolectar agua para análisis de PCR cuantitativa de virus específicos.

Para muestras de QPCR, agregue cinco mililitros de la muestra a un vial criogénico sin agente fijador y congele inmediatamente mediante inmersión en nitrógeno líquido. Para la preparación de la microscopía de producción viral, descongele las muestras congeladas sobre hielo y prepare frescamente las soluciones según se describe en el protocolo escrito. Luego, coloque un disco de filtro de 25 milímetros con tamaño de poro de 0,02 micrones encima de un filtro de respaldo celulósico de 0,45 micrones. A continuación, agregue 850 microlitros de la muestra fijada sobre el filtro anadi y aplique vacío a menos de 20 kilo Pascales hasta que quede completamente seco.

Una vez que el filtro de disco ano esté seco, pipetee 100 microlitros de la solución trabajo de cyber green en una placa de Petri estéril. Y con el vacío aún encendido, retire cuidadosamente el disco ano de la torre de filtro y colóquelo sobre el cyber green. Incube las muestras a temperatura ambiente y en la oscuridad durante 20 minutos.

Retire cuidadosamente el filtro de la solución de verde cyber y seque la parte posterior del filtro con una toallita Kim para eliminar todo el colorante residual. Luego, agregue una pequeña gota de solución Antifa a un portaobjetos y coloque un cubreobjetos encima. Retire el cubreobjetos y agregue el filtro seco al portaobjetos.

Nuevamente, agregue una pequeña cantidad de solución Antifa sobre el cubreobjetos y colóquelo lentamente encima del filtro, asegurándose de eliminar cualquier burbuja que pueda formarse. Cuente los virus mediante microscopía de fluorescencia con un filtro azul amplio, contando al menos 20 campos de visión para cada filtro, y asegúrese de cuantificar el número total de virus de cada campo de la cuadrícula para garantizar una distribución uniforme de los virus a través de la membrana del filtro. Calcule las tasas promedio de recurrencia viral a partir de los tres réplicas independientes y determine la desviación estándar a partir de las tasas de producción. Finalmente, corrija estas tasas por la dilución de los microorganismos, desde la abundancia inicial hasta la abundancia diluida en la muestra con reducción de virus.

El conjunto principal de datos resultante de este estudio son las tasas de recurrencia de la abundancia viral en las submuestras procedentes de las incubaciones. Estos resultados forman regresiones independientes de la abundancia viral frente al tiempo para cada una de las muestras. La producción de partículas similares a virus se monitorizó durante una incubación de 10 horas en condiciones de luz interior utilizando microscopía de epifluorescencia.

Estas muestras se recolectaron durante una floración de fitoplancton frente a la costa de Nueva Zelanda en septiembre de 2008. Acabamos de mostrarle cómo estimar las tasas de producción de virus. Esto incluye el uso de diferentes sistemas de ultrafiltración y la realización de experimentos para medir las tasas de producción de virus.

Además, les mostramos cómo enumerar estos virus mediante microscopía de epifluorescencia. Al realizar este procedimiento, es importante recordar el uso de equipo limpio, manipular cuidadosamente los virus teñidos, reducir la exposición a la luz, procesar las muestras rápidamente y limpiar adecuadamente los cartuchos de ultrafiltración después de cada uso. Eso es todo.

Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.