Marcado específico del VIH-1 células positivas utilizando un vector lentiviral Ap-dependientes que expresan la proteína verde fluorescente
23 de septiembre de 2010
Hemos desarrollado un vector lentiviral que posee, además de la LTR-Tat respuesta, el elemento de respuesta Rev (RRE) que pueden regular la expresión del gen de una forma del VIH-1 Tat y Rev-dependiente. El vector permite la detección específica de la replicación del VIH en las células vivas a través de la expresión de GFP.
El objetivo general de este procedimiento es identificar células positivas para VIH mediante un vector lentiviral dependiente de una rev del VIH que porta la proteína verde fluorescente. Esto se logra primero produciendo partículas lentivirales dependientes de rev mediante coprotransfección. El segundo paso del procedimiento consiste en infectar células T CD4 humanas con el VIH-1.
A continuación, las células T CD cuatro humanas positivas para VIH se superinfectan con partículas lentivirales que portan el gen GFP. El último paso consiste en identificar las células positivas para VIH mediante la medición de células positivas para GFP por citometría de flujo. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran el porcentaje de células positivas para GFP mediante citometría de flujo.
Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de la infección por VIH debido al hecho de que el vector dependiente de rev también puede entregar y expresar selectivamente genes terapéuticos en células infectadas por VIH para inducir la muerte de células positivas para VIH. Quien demostrará el procedimiento será gi, un profesor asistente de investigación de nuestro laboratorio, para producir partículas lentivirales dependientes de rev. Las células HEK 293T se transfectan con tres plásmidos: el vector lentiviral dependiente de rev que expresa GFP, el constructo de empaquetamiento del VIH-1 y un plásmido que porta la glucoproteína VSVG. Un día antes de la transfección con los plásmidos, siembre 2 × 10⁶ células HEK 293T en 10 mililitros de medio.
En una placa de Petri de 100 milímetros, cultive las células durante la noche a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Al día siguiente, sustituya el sobrenadante de las células por cinco mililitros de medio fresco.
A continuación, continúe cultivando las células durante cuatro horas a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono. Prepare los reactivos de transfección antes del final de la incubación de cuatro horas. Las células HEK 293T se transfectarán con los tres plásmidos en una proporción de 10 microgramos del vector lentiviral GFP dependiente de rev, 7,5 microgramos del constructo de empaquetamiento de VIH-1 y 2,5 microgramos de la glucoproteína VSVG.
Primero, premezcle los tres ADN plasmídicos en la proporción deseada. Luego prepare dos tubos de poliestireno de cinco mililitros. Añada 480 microlitros de tampón HBS dos veces concentrado al primer tubo y al segundo tubo.
Añada 60 microlitros de tampón de cloruro de calcio dos molar a los ADN plasmídicos y al tampón de transfección hasta un volumen total de 480 microlitros. A continuación, agregue la mezcla de ADN plasmídico y cloruro de calcio. Gotear lentamente en el tubo HPS dos veces y incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Se formará gradualmente un precipitado fino. Ahora agregue los 960 microlitros de la mezcla gota a gota mediante pipeta a las células HEK 2 9 3 T. Incube a 37 grados Celsius, 5 % dióxido de carbono, durante la noche.
Al día siguiente, retire el sobrenadante S y agregue 10 mililitros de medio fresco. Incube las células nuevamente a 37 grados Celsius, 5 % dióxido de carbono durante la noche. A las 48 horas posteriores a la transfección, recolecte el virus retirando el sobrenadante SUP y transfiriéndolo a un tubo estéril de 50 mililitros.
Añada 10 mililitros de medio fresco a la placa de Petri y continúe el cultivo durante la noche. Almacene el virus en posición supina a cuatro grados Celsius. Continúe la recolección a las 72 horas posteriores a la transfección, recogiendo el sobrenadante SUP y combinándolo con el sobrenadante previamente recolectado.
Luego, centrifugue el sobrenadante S a 500 veces G durante 15 minutos para formar un precipitado y eliminar los restos celulares. Tras la centrifugación, recoja el sobrenadante S y transfiéralo a un tubo nuevo. A continuación, filtre el sobrenadante a través de un filtro Milipore de 0,22 micrómetros.
El virus se concentrará aún más mediante una columna de exclusión por tamaño, lo cual se demostrará a continuación para concentrar las partículas virales. Cargue el sobrenadante viral en una columna de exclusión por tamaño y centrifugue a 6.000 × g a cuatro grados Celsius durante 15 minutos. Recopile el sobrenadante viral concentrado, reservando aproximadamente 100 microlitros para determinar la titulación viral.
Aliquote el resto y almacénelo a menos 80 grados Celsius. La determinación del título viral es uno de los aspectos más críticos de este procedimiento. Se requiere una alta multiplicidad de infección para una superinfección de células con el vector VIR GFP.
Con el fin de obtener un porcentaje de células positivas para GFP detectables mediante citometría de flujo para determinar el título viral, una línea celular de gato positiva para VIH V1 tratada con TNF será infectada con el sobrenadante viral. Estas células positivas para VIH V1 se cultivan.
En una placa de 96 pocillos con 2,5 veces 10 a la cinco células por mililitro en un volumen total de 100 microlitros. Prepare seis diluciones seriadas diez veces de las partículas lentivirales dependientes de rev para infectar las células positivas para VIH-1; agregue 100 microlitros de cada dilución seriada del virus a cada pocillo de células. Incube en un incubador de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante siete días.
El título de la partícula se estima observando las células positivas para GFP mediante microscopía de fluorescencia. Los cálculos se realizan siguiendo el método de Reid y MU, y el título se determina como el punto de dilución que puede dar lugar a pocillos positivos para GFP. En el 50 % de los pocillos infectados hasta el marcador IV, se observan células positivas con partículas lentivirales dependientes de rev.
Primero, se infectará una línea celular de linfocitos T CD4 humana con el VIH-1. Utilizamos dos veces 10 a la cinco células para cada infección. Dos horas antes de la infección.
Añada poli-cerebro a las células hasta una concentración final de cuatro microgramos por mililitro. Incube a 37 grados Celsius durante dos horas. A continuación, infecte las células agregando la solución de VIH a uno de los tubos de cinco mililitros.
Las otras dos muestras de células no se infectan y servirán como controles. Incubar todas las células a 37 grados Celsius durante dos horas. Después de dos horas, centrifugar las células a 300 ×g durante 10 minutos, eliminar el virus libre de células descartando el sobrenadante y resuspender las células en medio fresco a una concentración de 2 × 10⁵ células por mililitro en cultivo a 37 grados Celsius durante 48 horas.
Después de 48 horas, las células infectadas con VIH están listas para la infección. Con las partículas lentivirales dependientes de rev, utilice dos veces 10 a la cinco células para la infección con 100 microlitros de partículas lentivirales en células humanas CD4 T infectadas con VIH V1 como control; también se infectan células humanas CD4 T no infectadas con VIH V1 con 100 microlitros de partículas lentivirales. Incube las células a 37 grados Celsius durante la noche y al día siguiente.
Sustituya el medio gastado por medio fresco y resuspenda las células a una concentración de dos veces 10 a la cinco células por mililitro. 48 horas post-infección, pelete las células mediante centrifugación y luego resuspenda en 500 microlitros de paraformaldehído al 1%. Transfiera las células resuspendidas a un tubo para citometría de flujo para su análisis por citometría de flujo. Tras una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente, las células pueden analizarse en un analizador FACS para detectar la positividad para GFP.
Si los experimentos se realizan con éxito, el vector lentiviral dependiente de rev V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A permitirá la detección altamente específica de VIH replicante en poblaciones celulares vivas mediante la medición de la expresión de la proteína verde fluorescente GFP. En este ejemplo, las células C-E-M-S-S recolectadas fueron marcadas con un anticuerpo monoclonal de rata marcado con PE contra el CD 24 HSA de ratón y luego analizadas en un citómetro de flujo para la expresión de HSA y GFP, como se muestra aquí. Se detectó una población considerable de GFP en células infectadas con VIH-1 superinfectadas con V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A.
En contraste, no se detectaron células positivas para GFP en las células C-E-M-S-S no infectadas con VIH V ni en las células no infectadas con VIH uno, con o sin superinfección lentiviral. No olvide que trabajar con el VIH puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como los niveles de bioseguridad mediante prácticas adecuadas, al realizar este procedimiento.
Descripción general
Este estudio presenta un vector lentiviral novedoso diseñado para detectar células positivas para el VIH mediante la expresión de GFP de manera dependiente de las proteínas Tat y Rev del VIH-1. El método permite la identificación del VIH en replicación en células vivas, lo que tiene implicaciones significativas para aplicaciones terapéuticas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Virología
- Terapia génica
Antecedentes
- La infección por VIH sigue siendo un importante problema de salud mundial.
- Los métodos actuales para detectar células positivas para VIH son limitados.
- Los vectores lentivirales pueden diseñarse para expresar genes específicos.
- El elemento de respuesta a Rev (RRE) mejora la especificidad de la detección.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un vector lentiviral que permita la detección de células positivas para VIH.
- Utilizar la expresión de GFP como marcador para identificar células infectadas.
- Explorar las implicaciones terapéuticas del vector en el tratamiento del VIH.
Métodos Utilizados
- Cotransfección de células HEK 293T para producir partículas lentivirales.
- Infección de linfocitos T CD4 humanos con VIH-1 seguida de superinfección con el vector lentiviral.
- Citometría de flujo para medir células positivas para GFP.
- Determinación del título viral mediante diluciones seriadas y observación de GFP.
Resultados principales
- Producción exitosa de partículas lentivirales dependientes de Rev.
- Identificación de células positivas para VIH mediante la expresión de GFP.
- Los resultados de citometría de flujo indicaron un porcentaje cuantificable de células infectadas.
- El vector demostró potencial para la entrega de genes terapéuticos.
Conclusiones
- El vector lentiviral desarrollado es eficaz para detectar células positivas para el VIH.
- Este método podría mejorar las estrategias terapéuticas para la infección por VIH.
- Estudios futuros podrían centrarse en optimizar el vector para aplicaciones de terapia génica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la detección altamente específica del VIH en replicación en poblaciones de células vivas, abordando un desafío clave en la validación de dianas antivirales donde la actividad del reportero no específica dificulta la interpretación mecanicista. Al vincular la expresión de GFP tanto a las dependencias de Tat como de Rev, el vector reduce los falsos positivos derivados de estados de activación celular, mejorando la confianza predictiva en la selección temprana de terapias contra el VIH. El enfoque permite la reducción de riesgos mecanicistas al proporcionar una lectura cuantificable basada en fluorescencia para evaluar los efectos de compuestos sobre los ciclos de replicación viral.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de la regulación transcripcional y post-transcripcional específica del VIH mediante la expresión dual del reportero dependiente de Tat/Rev.
- Valor operativo: Reduce el ruido de fondo proveniente de vectores con solo LTR, aumentando la especificidad del ensayo en campañas de validación de objetivos.
- Valor predictivo: Facilita la priorización de compuestos que interrumpen la exportación dependiente de Rev o la replicación viral en etapas tardías.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Proporciona una lectura cuantitativa compatible con citometría de flujo para medir células GFP-positivas como indicador de replicación de VIH.
- Valor operativo: Permite protocolos estandarizados y reproducibles de infección y superinfección en modelos de células T CD4+.
- Escalabilidad: La determinación del título viral mediante diluciones seriadas facilita la normalización del ensayo entre placas de cribado.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Vincula la detección temprana de células positivas para VIH con la entrega terapéutica de genes en el mismo sistema vectorial.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Permite evaluar si los compuestos candidatos reducen la señal de GFP al inhibir la replicación en lugar de causar citotoxicidad.
- Sistema Relevante para la Enfermedad: Utiliza linfocitos T humanos CD4+ superinfectados para modelar contextos de replicación del VIH fisiológicamente relevantes.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, donde la detección específica del virus en replicación informa estudios sobre el mecanismo de acción y apoya decisiones de continuar o descartar basadas en la reducción de la señal de GFP.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre interacciones entre factores huésped y el VIH, así como la función de genes virales, mediante la expresión regulada de un reportero.
- Selección: Permite que el ensayo esté listo para su uso gracias a la expresión cuantificable de GFP, detectable por citometría de flujo tras superinfección.
- Análisis: Genera resultados basados en porcentajes de células GFP-positivas que permiten comparaciones entre diferentes condiciones de tratamiento y títulos virales.
- Investigación Traducional: Relaciona la capacidad de detección con el potencial terapéutico mediante la entrega en el mismo vector de genes efectores.
- Reutilización Empresarial: La plataforma puede adaptarse para otros virus de ARN intercambiando elementos reguladores, manteniendo al mismo tiempo el diseño de doble dependencia.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del blanco al distinguir señales verdaderamente dependientes del VIH de los artefactos por activación celular.
- Valor operativo: Estandariza el flujo de trabajo de detección mediante la producción lentiviral, la titulación y la lectura por citometría de flujo.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al reducir los falsos positivos en las cascadas de cribado antiviral.
- Impacto en la cartera: Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en la reducción medible de la señal de virus replicante.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la producción de vectores lentivirales, protocolos de bioseguridad para VIH y operación de citometría de flujo.
- Depende del acceso a células HEK 293T para el empaquetamiento viral y modelos de células T humanas CD4+ para la infección.
- Necesita la estandarización del momento de la superinfección y de la cuantificación del título viral entre laboratorios.
- La adaptación a células primarias u otros modelos puede requerir la optimización de la eficiencia de infección y de la actividad del promotor.
- Limitación práctica: La señal depende de la expresión activa de Rev, lo que puede no captar las etapas latentes o tempranas posteriores a la integración.
