Name: Marcado específico del VIH-1 células positivas utilizando un vector lentiviral Ap-dependientes que expresan la proteína verde fluorescente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-23T18:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Aprende a identificar células VIH-1 positivas mediante un vector lentiviral dependiente de Rev que expresa proteína verde fluorescente en células T CD4 humanas. Este método permite detectar el virus replicante en células vivas mediante citometría de flujo.

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El trabajo fue apoyado en parte por el Servicio de Salud Pública 1R01AI081568 subvención del NIAID para YW y por las generosas donaciones de los donantes y los jinetes de la Cabalgata 2009 NYCDC SIDA organizada por M. Rosen y Day2 Inc.

1. La transfección de plásmidos para la producción de las partículas lentivirales Ap-dependiente Set up: The Rev-dependiente GFP vector lentiviral, PNL-GFP-RRE-SA, se ha descrito anteriormente 4,5,6. Para montar en una partícula viral, el plásmido se contransfected en HEK293 células T con un VIH-1 en la construcción de envases, pCMVΔ8.2 (amablemente proporcionados por el Dr. Dider Trono), y un plásmido que lleva la glicoproteína VSV-G (pHCMV-G) . La transfección se realizó mediante el método de fosfato de calcio. Preparación de tampones: 10 X HBS (Hepes salina tamponada) se preparó disolviendo 5 g de Hepes, 8 g de NaCl, 0,37 g de KCl, 1 g de dextrosa, 0,103 g de Na 2 HPO 4 (anhidro) en 100 ml de H 2 O. Alícuota the10 X EPF buffer en alícuotas de 1 ml y almacenar a -20 ° C. En el momento de la transfección, convertir el 10 X 2 X HBS para HBS con H 2 O (1: 5 de dilución), y ajustar el pH entre 7,05 a 7,12. (De 10 ml de HBS 2 X, por lo general requiere de aproximadamente 50 l de NaOH 1M). Filtro de esterilizar el 2X tampón HBS, al pasar por un filtro Millipore de 0,22 M. CaCI buffer 2 se realizó mediante la disolución de CaCl 2 en 10 mM Hepes a una concentración final de 2 millones. Ajustar el pH a 5.8, filtro de esterilización de la memoria intermedia y se almacenan a 4 ° C. Procedimiento: <ol><li> Un día antes de la transfección, las semillas de 2 x 10 6 células HEK293T en una de 100 mm de Petri plato, y hacer crecer las células durante la noche en 10 ml de DMEM + 10% de SFB a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Al día siguiente, retirar el sobrenadante de las células y reemplazar con 5 ml de DMEM + 10% de SFB, continuamente células en cultivo durante 4 horas. </li><li> En un tubo de poliestireno de 5 ml, añadir 480 l 2X tampón HBS. </li><li> En un segundo tubo de poliestireno de 5 ml, añadir 60 l 2 M de CaCl2 buffer, el ADN del plásmido y transfección buffer TE (1 mM Tris, 25 mM EDTA, pH 8,0) hasta un volumen total de 480 mL. Para cada plato de Petri, los plásmidos se debe agregar en la proporción de 10 mg de PNL-GFP-RRE-SA, 7,5 g de pCMVΔR8.3, y 2,5 mg de pHCMV-G. </li><li> Añadir el plásmido ADN-CaCl2 mezcla gota a gota en el tubo de 2 X HBS, e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Un fino precipitado se forma. </li><li> Agregue el l 960 de la mezcla gota a gota con una pipeta a las células. Se incuba a 37 ° C CO, 5% 2 durante la noche. </li><li> Al día siguiente, separar el sobrenadante y agregar 10 ml DMEM + 10% de SFB, y continuamente se incuban las células a 37 ° C CO, 5% de CO2 durante la noche. </li><li> A las 48 horas después de la transfección, la cosecha del virus mediante la eliminación del sobrenadante y transferirlo en tubos de 50 ml estériles. Añadir nuevo 10 ml fresca FBS DMEM + 10% en cada plato de Petri y siguen a la cultura durante la noche. Guardar el sobrenadante del virus a 4 ° C. </li><li> Continuar la cosecha de 72 horas después de la transfección mediante la recolección del sobrenadante. Combine todos los sobrenadantes y centrifugar el sobrenadante a 500 xg durante 15 minutos para sedimentar y eliminar los desechos celulares. </li><li> El sobrenadante se recogieron y se filtra a través de un filtro Millipore de 0,22 M. El virus se concentró aún más a través de columnas de exclusión de tamaño. </li></ol> 2. Concentrar las partículas virales y determinar título viral <ol><li> Las partículas virales se concentraron por una columna de exclusión por tamaño (100.000 MW cortado, Centricoin). Sobrenadante viral se ha cargado en la columna, y se centrifuga a 6000 xg a 4 ° C durante 15 minutos. </li><li> Sobrenadante viral concentrada se recogió, alícuotas, y almacenadas a -80 ° C. </li><li> El título viral se determinó por la infección de un TNF-tratamiento, el VIH-1 positivos línea celular chaqueta, J1.1 7. Las células fueron cultivadas en una placa de 96 pocillos de 2,5 x 10 5 células por ml (100 ml de volumen total), e infectados con 100 ml de diluciones seriadas VNL-GFP-RRE-SA por una semana. El título (TCID50) de la partícula se calculó contando los pozos GFP positivos siguiendo el método de Reed y Muench 8. </li></ol> 3. Marcando el VIH-1 células positivas con la partícula lentivirales, VNL-GFP-RRE-SA Montaje: una T CD4 líneas de células humanas, CEM-SS, estaba infectado primero con el VIH-1. A las 48 horas post-infección, las células fueron superinfección con las partículas lentiviral, VNL-GFP-RRE-SA. Después de la sobreinfección por otros dos días, las buenas prácticas agrarias de células positivas fueron analizadas por citometría de flujo. Como control, el VIH-1 no infectadas CEM-SS células fueron infectadas con idéntica VNL-GFP-RRE-SA. Sólo la pandemia del VIH-1-infected CEM-SS células dieron lugar a las células GFP positivos, pero no el VIH-1 no infectadas CEM-SS células. Procedimiento: <ol><li> Dos horas antes de la infección, añadir polybrane a una concentración final de 4 mg / mL. Recuento de células y tomar 2 x 10 5 células por cada infección. Infectar a las células con 200 ng (p24) del VIH-1 NL4-3 durante 2 horas. </li><li> Lavado de las células por centrifugación a 300 xg durante 10 minutos, resuspendercélulas en 2 x 10 5 células / ml, y la cultura a 37 ° C durante 48 horas. </li><li> Recuento de células y tomar 2 x 10 5 células por la infección por VNL-GFP-RRE-SA. Añadir 100 ml de VNL-GFP-RRE-SA y se incuba a 37 ° C durante la noche. Lavar las células y resuspender en 2 x 10 5 células / ml. </li><li> Realizar un análisis de citometría de flujo a las 48 horas después de la superinfección. Las células infectadas se sedimentaron y se resuspendieron en 500 ml paraformaldehede 1%, incubados a temperatura ambiente durante 20 minutos, y luego se analizaron en un analizador FACScan (Becton Dickenson). </li></ol> 4. Resultados representante Si los experimentos se realizó con éxito, una población considerable GFP se detectó en el VIH-1-infected CEM-SS células por el citómetro de flujo, mientras que, en el control, las células GFP positivos no se detecta el VIH-1 no infectadas CEM-SS las células. Si los experimentos se realizó con éxito, el vector lentiviral Ap-dependiente, VNL-GFP-RRE-SA, permitirá una detección muy específica de la replicación del VIH en las poblaciones de células que viven, a través de la medición de la proteína verde fluorescente (GFP) de expresión. En este ejemplo, se recogieron CEM-SS células fueron teñidas con un anticuerpo marcado con PE rata monoclonal contra CD24 de ratón, HSA, y luego se analizaron en un citómetro de flujo, tanto para la HSA y la expresión de GFP. <img src="/files/ftp_upload/2198/2198fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Como se muestra aquí, una población considerable GFP se detectó en el VIH-1 las células infectadas por superinfección con VNL-GFP-RRE-SA (Figura 1c). En contraste, las células GFP positivos no se han detectado, ya sea en el VIH-1 no infectadas CEM-SS células sin sobreinfección lentiviral (Figura 1a) o el VIH-1 las células no infectadas con sobreinfección lentiviral (Figura 1b).

<ol><li>Garcia, J. A., Wu, F. K., Mitsuyasu, R., Gaynor, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+cellular+proteins+involved+in+the+transcriptional+regulation+of+the+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Interactions of cellular proteins involved in the transcriptional regulation of the human immunodeficiency virus.</a> EMBO Journal. 6, 3761-3770 (1987).</li>
<li>Merzouki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+gp120%2F160+expressing+cells+upregulate+HIV-1+LTR+directed+gene+expression+in+a+cell+line+transfected+with+HIV-1+LTR-reporter+gene+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+%28Noisy-le-grand%22%5BJournal%5D)">HIV-1 gp120/160 expressing cells upregulate HIV-1 LTR directed gene expression in a cell line transfected with HIV-1 LTR-reporter gene constructs.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand. 41, 445-452 (1995).</li>
<li>Aguilar-Cordova, E., Chinen, J., Donehower, L., Lewis, D. E., Belmont, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+reporter+cell+line+for+HIV-1+tat+activity%2C+HIV-1+inhibitors%2C+and+T+cell+activation+effects%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">A sensitive reporter cell line for HIV-1 tat activity, HIV-1 inhibitors, and T cell activation effects.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 10, 295-301 (1994).</li>
<li>Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-dependent+lentiviral+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Rev-dependent lentiviral expression vector.</a> Retrovirology. 4, 12-12 (2007).</li>
<li>Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-dependent+indicator+T+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Current+HIV+Research%22%5BJournal%5D)">Rev-dependent indicator T cell line.</a> Current HIV Research. 5, 395-403 (2007).</li>
<li>Young, J., Tang, Z., Yu, Q., Yu, D., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+killing+of+HIV-1-positive+macrophages+and+T+Cells+by+the+Rev-dependent+lentivirus+carrying+anthrolysin+O+from+Bacillus+anthracis%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Selective killing of HIV-1-positive macrophages and T Cells by the Rev-dependent lentivirus carrying anthrolysin O from Bacillus anthracis.</a> Retrovirology. 5, 36-36 (2008).</li>
<li>Perez, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HIV-1-infected+T+cell+clone+defective+in+IL-2+production+and+Ca2%2B+mobilization+after+CD3+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">An HIV-1-infected T cell clone defective in IL-2 production and Ca2+ mobilization after CD3 stimulation.</a> Journal of Immunology. 147, 3145-3148 (1991).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li>
</ol>

Al igual que con los vectores de expresión antes desarrollado Tat-dependientes, el sistema de Apocalipsis se describe aquí es una explotación de un proceso de evolución del VIH. La inclusión de Rev-dependencia hace que el vector de expresión basado en LTR depende en gran medida la presencia de la replicación del VIH. La aplicación de este vector como se informó aquí, un reportero de virus VIH-dependiente, ofrece un nuevo enfoque nuevo para identificar el VIH de células positivas. El vector permite el examen de las células vivas, se puede expresar cualquier gen para la experimentación básica y clínica, y como un lentivirus pseudo-tipo tiene acceso a más tipos de células y tejidos.

<table><tbody><tr><td>Campana de seguridad biológica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora a 37&amp;#x00B0;C y 5%CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo</td><td></td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Allega&amp;#174;6KR</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerador a 4&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerador a -20&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerador a -80&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contador de células</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer&amp;#174; AutoT4</td><td></td></tr><tr><td>Línea celular HEK293T</td><td>Institutos Nacionales de Salud</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Línea celular CEM-SS</td><td>Institutos Nacionales de Salud</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Línea celular Jurkat J1.1</td><td>Institutos Nacionales de Salud</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>21870</td><td></td></tr><tr><td>SFB inactivado por calor</td><td>Invitrogen</td><td>10438-018</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1&lt;sub&gt;NL4-3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>preparado mediante transfección de células HeLa con ADN proviral clonado</td></tr><tr><td>pNL-GFP-RRE</td><td></td><td></td><td>deleción completa de todos los ORF del VIH de pNL4-3</td></tr><tr><td>pNL-GFP-RRE-SA</td><td></td><td></td><td>Insertar los fragmentos A5 y D4 del VIH-1 en pNL-GFP-RRE</td></tr><tr><td>pCMV&amp;#916;8.2</td><td></td><td></td><td>proporcionado por el Dr. Dider Trono</td></tr><tr><td>pHCMV-G</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con Hepes 10x (HBS)</td><td>Invitrogen</td><td>11344-041</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 2M</td><td>Invitrogen</td><td>S-013-154-10</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído al 1%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Lejía</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon de 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>358206</td><td></td></tr><tr><td>Tubos redondos de 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Millipore de 0,45&amp;mu;m</td><td>EMD Millipore</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Millipore de 0,20&amp;mu;m</td><td>EMD Millipore</td><td>SLFG85000</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 100 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430588</td><td></td></tr><tr><td>Columna de exclusión por tamaño (corte de 100.000 MW)</td><td>Sartorius AG</td><td>VS2041</td><td></td></tr><tr><td>Tubo congelador de 2 ml</td><td>Axygen Scientific</td><td>SCT-200</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>BD Biosciences</td><td>353227</td><td></td></tr><tr><td>Tubo microcentrífugo de 1,7 ml</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT- 175-C</td><td></td></tr></tbody></table>

marcado específico del vih-1 células positivas utilizando un vector lentiviral ap-dependientes que expresan la proteína verde fluorescente

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

La mayoría de los vectores de la expresión del VIH-respuesta se basan en el promotor del VIH, la repetición terminal larga (LTR). Mientras que responda a una de las primeras proteínas del VIH, Tat, el LTR es también sensible a los estados de activación celular y la actividad de la cromatina local, donde la integración se ha producido. Esto puede resultar en altas tasas de VIH-independiente de la actividad, y ha limitado la utilidad de la LTR basado en reportero para marcar las células con VIH 1,2,3. Aquí se construyó un vector de expresión lentiviral que posee, además de la LTR-Tat respuesta, numerosas secuencias de ADN del VIH que incluyen el elemento Ap-respuesta y los sitios de empalme VIH 4,5,6. El vector se incorporó a un reportero lentiviral virus, lo que permite una detección muy específica de la replicación del VIH en las poblaciones de células vivas. La actividad del vector se mide por la expresión de la proteína de fluorescencia verde (GFP). La aplicación de este vector como se informó aquí ofrece un enfoque alternativo nuevo a los métodos existentes, como la PCR in situ o tinción del antígeno, para identificar el VIH de células positivas. El vector también puede expresar genes terapéuticos para la experimentación básica o clínica para orientar el VIH de células positivas.

Hemos desarrollado un vector lentiviral que posee, además de la LTR-Tat respuesta, el elemento de respuesta Rev (RRE) que pueden regular la expresión del gen de una forma del VIH-1 Tat y Rev-dependiente. El vector permite la detección específica de la replicación del VIH en las células vivas a través de la expresión de GFP.

Marcado específico del VIH-1 células positivas utilizando un vector lentiviral Ap-dependientes que expresan la proteína verde fluorescente

La mayoría de los vectores de expresión sensibles al VIH se basan en el promotor del VIH, la repetición terminal larga (LTR). Aunque son sensibles a una proteína temprana del VIH, Tat, ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar células positivas para VIH mediante un vector lentiviral dependiente de una rev del VIH que porta la proteína verde fluorescente. Esto se logra primero produciendo partículas lentivirales dependientes de rev mediante coprotransfección. El segundo paso del procedimiento consiste en infectar células T CD4 humanas con el VIH-1.A continuación, las células T CD cuatro humanas positivas para VIH se superinfectan con partículas lentivirales que portan el gen GFP. El último paso consiste en identificar las células positivas para VIH mediante la medición de células positivas para GFP por citometría de flujo. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran el porcentaje de células positivas para GFP mediante citometría de flujo.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de la infección por VIH debido al hecho de que el vector dependiente de rev también puede entregar y expresar selectivamente genes terapéuticos en células infectadas por VIH para inducir la muerte de células positivas para VIH. Quien demostrará el procedimiento será gi, un profesor asistente de investigación de nuestro laboratorio, para producir partículas lentivirales dependientes de rev. Las células HEK 293T se transfectan con tres plásmidos: el vector lentiviral dependiente de rev que expresa GFP, el constructo de empaquetamiento del VIH-1 y un plásmido que porta la glucoproteína VSVG. Un día antes de la transfección con los plásmidos, siembre 2 × 10⁶ células HEK 293T en 10 mililitros de medio.En una placa de Petri de 100 milímetros, cultive las células durante la noche a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Al día siguiente, sustituya el sobrenadante de las células por cinco mililitros de medio fresco.A continuación, continúe cultivando las células durante cuatro horas a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono. Prepare los reactivos de transfección antes del final de la incubación de cuatro horas. Las células HEK 293T se transfectarán con los tres plásmidos en una proporción de 10 microgramos del vector lentiviral GFP dependiente de rev, 7,5 microgramos del constructo de empaquetamiento de VIH-1 y 2,5 microgramos de la glucoproteína VSVG.Primero, premezcle los tres ADN plasmídicos en la proporción deseada. Luego prepare dos tubos de poliestireno de cinco mililitros. Añada 480 microlitros de tampón HBS dos veces concentrado al primer tubo y al segundo tubo.Añada 60 microlitros de tampón de cloruro de calcio dos molar a los ADN plasmídicos y al tampón de transfección hasta un volumen total de 480 microlitros. A continuación, agregue la mezcla de ADN plasmídico y cloruro de calcio. Gotear lentamente en el tubo HPS dos veces y incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.Se formará gradualmente un precipitado fino. Ahora agregue los 960 microlitros de la mezcla gota a gota mediante pipeta a las células HEK 2 9 3 T. Incube a 37 grados Celsius, 5 % dióxido de carbono, durante la noche.Al día siguiente, retire el sobrenadante S y agregue 10 mililitros de medio fresco. Incube las células nuevamente a 37 grados Celsius, 5 % dióxido de carbono durante la noche. A las 48 horas posteriores a la transfección, recolecte el virus retirando el sobrenadante SUP y transfiriéndolo a un tubo estéril de 50 mililitros.Añada 10 mililitros de medio fresco a la placa de Petri y continúe el cultivo durante la noche. Almacene el virus en posición supina a cuatro grados Celsius. Continúe la recolección a las 72 horas posteriores a la transfección, recogiendo el sobrenadante SUP y combinándolo con el sobrenadante previamente recolectado.Luego, centrifugue el sobrenadante S a 500 veces G durante 15 minutos para formar un precipitado y eliminar los restos celulares. Tras la centrifugación, recoja el sobrenadante S y transfiéralo a un tubo nuevo. A continuación, filtre el sobrenadante a través de un filtro Milipore de 0,22 micrómetros.El virus se concentrará aún más mediante una columna de exclusión por tamaño, lo cual se demostrará a continuación para concentrar las partículas virales. Cargue el sobrenadante viral en una columna de exclusión por tamaño y centrifugue a 6.000 × g a cuatro grados Celsius durante 15 minutos. Recopile el sobrenadante viral concentrado, reservando aproximadamente 100 microlitros para determinar la titulación viral.Aliquote el resto y almacénelo a menos 80 grados Celsius. La determinación del título viral es uno de los aspectos más críticos de este procedimiento. Se requiere una alta multiplicidad de infección para una superinfección de células con el vector VIR GFP.Con el fin de obtener un porcentaje de células positivas para GFP detectables mediante citometría de flujo para determinar el título viral, una línea celular de gato positiva para VIH V1 tratada con TNF será infectada con el sobrenadante viral. Estas células positivas para VIH V1 se cultivan.En una placa de 96 pocillos con 2,5 veces 10 a la cinco células por mililitro en un volumen total de 100 microlitros. Prepare seis diluciones seriadas diez veces de las partículas lentivirales dependientes de rev para infectar las células positivas para VIH-1; agregue 100 microlitros de cada dilución seriada del virus a cada pocillo de células. Incube en un incubador de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante siete días.El título de la partícula se estima observando las células positivas para GFP mediante microscopía de fluorescencia. Los cálculos se realizan siguiendo el método de Reid y MU, y el título se determina como el punto de dilución que puede dar lugar a pocillos positivos para GFP. En el 50 % de los pocillos infectados hasta el marcador IV, se observan células positivas con partículas lentivirales dependientes de rev.Primero, se infectará una línea celular de linfocitos T CD4 humana con el VIH-1. Utilizamos dos veces 10 a la cinco células para cada infección. Dos horas antes de la infección.Añada poli-cerebro a las células hasta una concentración final de cuatro microgramos por mililitro. Incube a 37 grados Celsius durante dos horas. A continuación, infecte las células agregando la solución de VIH a uno de los tubos de cinco mililitros.Las otras dos muestras de células no se infectan y servirán como controles. Incubar todas las células a 37 grados Celsius durante dos horas. Después de dos horas, centrifugar las células a 300 ×g durante 10 minutos, eliminar el virus libre de células descartando el sobrenadante y resuspender las células en medio fresco a una concentración de 2 × 10⁵ células por mililitro en cultivo a 37 grados Celsius durante 48 horas.Después de 48 horas, las células infectadas con VIH están listas para la infección. Con las partículas lentivirales dependientes de rev, utilice dos veces 10 a la cinco células para la infección con 100 microlitros de partículas lentivirales en células humanas CD4 T infectadas con VIH V1 como control; también se infectan células humanas CD4 T no infectadas con VIH V1 con 100 microlitros de partículas lentivirales. Incube las células a 37 grados Celsius durante la noche y al día siguiente.Sustituya el medio gastado por medio fresco y resuspenda las células a una concentración de dos veces 10 a la cinco células por mililitro. 48 horas post-infección, pelete las células mediante centrifugación y luego resuspenda en 500 microlitros de paraformaldehído al 1%. Transfiera las células resuspendidas a un tubo para citometría de flujo para su análisis por citometría de flujo. Tras una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente, las células pueden analizarse en un analizador FACS para detectar la positividad para GFP.Si los experimentos se realizan con éxito, el vector lentiviral dependiente de rev V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A permitirá la detección altamente específica de VIH replicante en poblaciones celulares vivas mediante la medición de la expresión de la proteína verde fluorescente GFP. En este ejemplo, las células C-E-M-S-S recolectadas fueron marcadas con un anticuerpo monoclonal de rata marcado con PE contra el CD 24 HSA de ratón y luego analizadas en un citómetro de flujo para la expresión de HSA y GFP, como se muestra aquí. Se detectó una población considerable de GFP en células infectadas con VIH-1 superinfectadas con V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A.En contraste, no se detectaron células positivas para GFP en las células C-E-M-S-S no infectadas con VIH V ni en las células no infectadas con VIH uno, con o sin superinfección lentiviral. No olvide que trabajar con el VIH puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como los niveles de bioseguridad mediante prácticas adecuadas, al realizar este procedimiento.

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Inmunología e Infección

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Se describe un ensayo basado en células para reportar VIH-1 la fusión a través de la expresión de la proteína verde fluorescente detectable por microscopía de flujo cytometry o fluorescencia. Puede ser utilizado para probar los inhibidores de entrada viral (específicamente en la etapa de fusión) en sistemas libres de células y células a la infección.

Un alto rendimiento Cre-Lox activado análisis de fusión de la membrana Viral para identificar inhibidores de la fusión de la membrana Viral VIH-1

Un protocolo de alto rendimiento para la evaluación funcional de reactivación eficaz del VIH y la separación de provirus latentes es descrito y aplicado por el impacto de las intervenciones sobre la transcripción del VIH la prueba y empalme. Se proporcionan resultados representativos del efecto de latencia inversión a agentes sobre la transcripción basada en litros y empalme.

Alto rendimiento en la evaluación de Vitro de latencia inversión a en VIH transcripción y Splicing

A ADN epigenoma edición representa un potente enfoque terapéutico. Este protocolo describe la producción, purificación y concentración de vectores lentivirales all-in-one que el transgén CRISPR-dCas9-DNMT3A para aplicaciones de edición de epigenoma en células pluripotentes inducidas humanas (hiPSC)-derivado de las neuronas.

Plataforma de vectores lentivirales para la entrega eficiente de las herramientas de edición de epigenoma en humanos inducida por modelos de enfermedad derivados de células madre pluripotentes

Aquí se presenta un protocolo para un enfoque de imágenes de fluorescencia, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA y protein (MICDDRP), un método capaz de la visualización simultánea de fluorescencia unicelular de proteínas virales y ácidos nucleicos de diferente tipo y varamiento. Este enfoque se puede aplicar a una amplia gama de sistemas.

Imágenes de fluorescencia multiplexada de una sola célula para visualizar ácidos nucleicos y proteínas virales y monitorear el VIH, el HTLV, el VHB, el VHC, el virus del Zika y la infección por influenza

Aprende a identificar células VIH-1 positivas mediante un vector lentiviral dependiente de Rev que expresa proteína verde fluorescente en células T CD4 humanas. Este método permite detectar el virus replicante en células vivas mediante citometría de flujo.

Marcado específico del VIH-1 células positivas utilizando un vector lentiviral Ap-dependientes que expresan la proteína verde fluorescente (Video) | JoVE Journal

Marcado específico del VIH-1 células positivas utilizando un vector lentiviral Ap-dependientes que expresan la proteína verde fluorescente

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