Name: Preparación de corazón de rata altamente acoplado mitocondrias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Aprende a aislar mitocondrias cardíacas de rata altamente acopladas mediante disrupción mecánica, centrifugación diferencial y control de temperatura. Este protocolo garantiza preparaciones de alta calidad para estudios de bioenergética celular.

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Agradecemos al Prof. A. Vinogradov y el Dr. Vera Grivennikova para la introducción de los autores en el campo de la biología mitocondrial y mucha información útil y consejos en este procedimiento. Los autores agradecen a la Sra. Amanda McKintock de la oficina de la Universidad de Queens medios de comunicación por la ayuda con la preparación de vídeo.

Introducción Las mitocondrias de corazón de rata es una de las preparaciones más comunes de los estudios anteriores y actuales del metabolismo celular. Se pueden obtener de forma rápida y fiable en gran cantidad de tipo silvestre o animales knock-out. El procedimiento general consiste en la digestión del tejido por la tripsina, fraccionamiento y centrifugación diferencial. Hay varias condiciones que han de mantenerse durante el aislamiento de las mitocondrias de varios tejidos, incluyendo el corazón (Fig. 1). <ul><li> El tejido tiene que ser bien picada, ya que afecta directamente el rendimiento de las mitocondrias obtenidas. El tejido del corazón que es mejor para picar con pequeñas tijeras curvas y puede ser seguido por el uso de un triturador de tejidos Latapie, o si un triturador de tejidos no está disponible, una prensa de ajo con una salida de diámetro de los agujeros de alrededor de 1,0 mm de diámetro. </li><li> Es necesario para mantener la temperatura de las soluciones a cada paso. Por lo tanto, todo el procedimiento ha de llevarse a cabo en una habitación fría y todos los instrumentos y las soluciones tienen que estar preparados y refrigerados con antelación. Si las condiciones de temperatura no se mantienen estables varias propiedades de la preparación se puede perder. La estructura mitocondrial es muy sensible a las heladas por lo overfreezing de la suspensión (por ejemplo durante la centrifugación) no está permitido, especialmente si los estudios de transporte activo son muy importantes. </li><li> Un parámetro importante es el tiempo de duración del procedimiento, el aislamiento debe ser realizado lo más rápidamente posible y la preparación obtenida debe ser utilizado inmediatamente. Por lo tanto, instrumentos quirúrgicos, soluciones y aparatos tienen que estar preparados de antemano. </li></ul> Materiales e instrumentos Instrumentos <ol><li> Tijeras rectas de operación, el punto fuerte </li><li> Tijeras curvas </li><li> Fórceps </li><li> Una caja de petri </li><li> Pequeño embudo + pedazo de nylon filtro (previamente lavada) </li><li> 6 vasos de 50 ml </li><li> Dos agitadores magnéticos y dos baños de hielo </li><li> Un gran baño de hielo </li><li> Dos barras magnéticas pequeñas </li><li> Espátulas para raspar pellet </li><li> Tubos de centrífuga </li><li> Prensa Latapie tejido (se puede sustituir con prensa de ajo) </li><li> Teflón-vidrio de 20 ml y homogeneizadores de un 2 ml- </li><li> Residuos vaso </li><li> Tubos Eppendorf de suspensión definitiva mitocondrial y muestras para la determinación de proteínas </li><li> Baños de hielo </li></ol> Soluciones (calculado por 2 ratas): <ol><li> Tampón de lavado: 0,3 M de sacarosa, 10 mM HEPES (pH = 7,2), 0,2 mM EDTA (1000 ml) </li><li> Aislamiento de amortiguación: 0,3 M de sacarosa, 10 mM HEPES (pH = 7,4), 0,2 mM EDTA, 1 mg / ml de BSA (Sigma A6003) (preparado a partir de la solución de lavado 100 ml). Albúmina sérica bovina puede ser sustituidos por otros menos caros de ácidos grasos libres análogos. El mismo tampón, o sus variantes isotónicas se puede utilizar como buffer de resuspensión. </li><li> Tripsina (Sigma T8003): Se 2.5mg/ml en 1 mM HCl (0,5 ml) </li><li> Inhibidor de tripsina de soja (Sigma T9128) 6,5 mg/10 ml de solución tampón de aislamiento </li></ol> Protocolo El esquema general del procedimiento se muestra en la figura. 1. Corazones deben ser enfriados y lavados en tampón de lavado, el tejido extirpado ventricular, picada y homogeneizada durante el tratamiento con tripsina fotolítica. La suspensión se centrifuga a baja velocidad y el sobrenadante obtenido se centrifugó de nuevo a una velocidad más alta para recoger las mitocondrias. En función de los experimentos previstos el buffer resuspensión puede ser sustituida por cualquier otra solución isotónica. Los animales fueron terminados de acuerdo con el Reino Unido "Animals (Scientific Procedures) Act". por dislocación cervical seguido por decapitación. Es necesario extraer el corazón inmediatamente después de la decapitación del animal, de modo que no hay retraso entre la terminación de los animales y la extracción de corazón. Si el aislamiento paralelo de mitocondrias de hígado se espera que las ratas deben estar en ayunas durante la noche antes del experimento. <ol><li> Preparar tres vasos de precipitado que contiene 40 ml de Tampón de Lavado. Enfriar en un baño de hielo y sal de 3 a 5 min antes de proceder al siguiente paso. Asegúrese de que no los overfreeze y utilizar inmediatamente justo después de las nubes de cristales de hielo comienzan a aparecer. </li><li> Abrir el tórax de la rata decapitado y extraer el corazón. Hacen pequeñas incisiones y luego transferir inmediatamente el corazón a la solución enfriada con hielo en el vaso de primera. Apriete el corazón para eliminar la sangre y la puso en el segundo vaso. Repita esta operación para cada corazón. </li><li> Seca el corazón en el papel de filtro. Eliminar todas las grasas en la sangre, coagulada, aurículas y la fascia y la piscina del tejido ventricular. </li><li> Picar el tejido combinado con pequeñas tijeras curvas en la placa de Petri en el hielo durante unos 5 minutos hasta que el tamaño de las partículas es de unos 1-2 mm. </li><li> Coloque el tejido picado en la prensa del tejido y pasartravés de él. Tenga en cuenta que una cantidad sustancial de material puede permanecer en la prensa para recoger todos los tejidos del corazón de las paredes y el fondo de la prensa. </li><li> Transferir el material en el vaso con 50 ml de Tampón de Lavado y revuelva. Después se filtra la suspensión a través de un filtro de nylon. Lave el tejido picado en el filtro 3 veces con el tampón de lavado y descartar el filtrado. </li><li> La transferencia de los tejidos lavados en 20 ml de tampón de lavado y colocarlo en el baño de hielo en el agitador magnético. Añadir 0,5 ml de solución de tripsina con agitación constante y en marcha el temporizador. Se prepara otro agitador magnético, baño de hielo y un segundo vaso de 50 ml. </li><li> En el minuto 4 brevemente homogeneizar la parte de suspensión por parte de utilizar una pequeña muy ajustada de vidrio Teflón homogeneizador (10 y 15 ml) con varios golpes arriba y abajo para dispersar a la suspensión. Después de la homogeneización de transferencia de la suspensión en el segundo vaso. Repita el procedimiento en el minuto 9 º, por lo que se realiza la homogeneización de la suspensión de dos veces en total. Después de 15 minutos de incubación, agregar 10 ml de aislamiento de un tampón que contiene inhibidores de la tripsina y se incuba durante 1 min. </li><li> Filtrar la suspensión una vez más a través de un filtro de nylon y guardar el líquido filtrado. Recoger la fracción de partículas a la izquierda en un filtro y se homogeneiza durante 1 minuto en 15-20 ml de tampón de lavado. </li><li> Combine el homogeneizado con el filtrado y centrifugado durante 15 minutos a 600g. </li><li> Cuidadosamente filtra el sobrenadante resultante en un tubo de centrífuga de nuevo. Evitar la contaminación por el sedimento y se centrifuga de nuevo durante 15 min a 8500g. </li><li> Después de la centrifugación de alta velocidad descartar el sobrenadante y lavar el pellet 2-3 veces con 1 ml de buffer de descartar la mullida capa blanca del borde exterior. Romper la pastilla con la espátula, sino evitar la mancha roja de los eritrocitos en la parte inferior. Si las células sanguíneas se loos, eliminar los bits de color rojo de la suspensión antes de la homogeneización. </li><li> Resuspender el precipitado con un homogeneizador de pequeñas o bien mediante pipeteo suave. Diluir la suspensión con más Isolationbuffer y centrifugar de nuevo durante 15 min a 8500g. </li><li> Descartar el sobrenadante, resuspender el precipitado en la resuspensión de búfer (un tampón isotónico de elección) y se centrifuga de nuevo. </li><li> El marrón resultante pastilla contiene lavado mitocondrias intactas. Resuspender el precipitado en un volumen muy pequeño de tampón isotónico de su elección. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2202/2202fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Esquema que demuestra el procedimiento paso a paso de aislamiento de las mitocondrias de corazón de rata. Parte superior, Etapas 1-9: alteración del tejido, el tratamiento de la tripsina y la homogeneización; parte inferior, las etapas 10-15: centrifugación diferencial.

<ol><li>Jacobus, W. E., Saks, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatine+kinase+of+heart+mitochondria%3A+changes+in+its+kinetic+properties+induced+by+coupling+to+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Creatine kinase of heart mitochondria: changes in its kinetic properties induced by coupling to oxidative phosphorylation.</a> Arch. Biochem. Biophys. 219, 167-178 (1982).</li>
<li>Gostimskaya, I. S., Grivennikova, V. G., Zharova, T. V., Bakeeva, L. E., Vinogradov, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+assay+of+the+intramitochondrial+enzymes%3A+use+of+alamethicin+for+permeabilization+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria.</a> Anal. Biochem. 313, 46-52 (2003).</li>
</ol>

Protocolo detallado rápido para el aislamiento de las mitocondrias intactas con un alto grado de acoplamiento se describe. La preparación obtenida puede ser utilizada para la investigación funcional o estructural de la bioenergética celular, estudios de proteómica o análisis de ADN mitocondrial y el contenido de lípidos. Estudios biofísicos del transporte activo de iones y los intermediarios metabólicos también se puede realizar. Es posible que otro proceso de la preparación mitocondrial con el fin de aislar partículas submitocondriales, la membrana externa o purificar los componentes separados de la fosforilación oxidativa. El método descrito es una modificación del protocolo estándar de aislamiento por Jacobus y Saks 1. El rendimiento esperado de las mitocondrias preparado es de aproximadamente 10-15 mg de proteína mitocondrial por el corazón y la razón de control de la respiración en malato / glutamato de esta preparación varía entre 8 y 12 con respiración IV Estado de alrededor de 0,12 mmol O 2 -1 proteína xmin XMG -1 a 23 ° C en el medio que comprende 0,25 M de sacarosa, 10 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 5 mM fosfato de potasio (pH 8,0) con 150 mM de ADP para la iniciación de la respiración del Estado III (por las condiciones exactas experimental y adiciones, ver ref . 2). Se debe prestar especial atención a varios detalles técnicos antes del inicio del procedimiento de aislamiento. Es crucial para el uso limpio tubos de policarbonato o polipropileno centrífuga, por lo tanto, los tubos deben lavarse con un cepillo limpio y agua caliente, sin embargo, el tratamiento con detergente debe mantenerse al mínimo. Además, es conveniente recoger toda la cristalería y los instrumentos necesarios en la cámara fría un día antes del aislamiento. Durante el aislamiento, cuando la transferencia de buffers de los frascos de vasos, la atención а debe prestarse especial atención para evitar que las gotas de agua helada en las soluciones. Al manipular los tejidos hay que destacar que la extracción del corazón deben llevarse a cabo tan pronto como sea posible, ya que incluso a corto tiempo de retardo entre la decapitación del animal y el enfriamiento del tejido se traduciría en las mitocondrias parcialmente desacoplada. El enfriamiento rápido y un lavado profundo de los corazones eliminado es esencial para obtener la preparación estándar, libre de hemoglobina y eritrocitos NADase. Tripsina se utiliza para la degradación de las proteínas conectivo para aumentar la susceptibilidad del tejido a fuerza de corte durante la homogeneización. La exposición prolongada de los tejidos de la proteasa se debe evitar, ya que los resultados en las mitocondrias de calidad inferior. Después de centrifugaciones a alta velocidad de las paredes de los tubos de centrifugación deben limpiarse con un pañuelo de papel para eliminar los depósitos de material de grasa acumulada en las paredes. Para la resuspensión final es mejor utilizar un volumen bajo de la amortiguación final con el fin de minimizar la pérdida de las funciones mitocondriales durante el almacenamiento (150 a 200 l de tampón por el corazón). Para los estudios de transporte de cationes bivalentes no agentes quelantes deben estar presentes en la preparación final de lo que las mitocondrias se deben lavar varias veces con EGTA medio libre y utilizado en las primeras horas después de su aislamiento.

preparación de corazón de rata altamente acoplado mitocondrias

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

La función de la mitocondria en la generación de ATP celular en el proceso de fosforilación oxidativa es ampliamente reconocida. Durante las últimas décadas ha habido avances significativos en nuestra comprensión de las funciones de otros mitocondrias que la generación de energía. Estos incluyen su papel en la apoptosis, actuando como una señal de orgánulos, desarrollo de los mamíferos y el envejecimiento, así como su contribución a la coordinación entre el metabolismo celular y la proliferación celular. Nuestra comprensión de los procesos biológicos modulada por las mitocondrias, se basa en métodos robustos para el aislamiento y la manipulación de las mitocondrias intactas de tejidos de los animales de laboratorio. Las mitocondrias de corazón de rata es una de las preparaciones más comunes de los estudios anteriores y actuales del metabolismo celular incluyendo estudios sobre animales knock-out. A continuación se describe un método detallado rápido para el aislamiento de las mitocondrias intactas con un alto grado de acoplamiento. Tal preparación de corazón de rata mitocondria es un objeto ideal para la investigación funcional y estructural de la bioenergética celular, el transporte de biomoléculas, los estudios proteómicos y análisis de ADN mitocondrial, las proteínas y los lípidos.

Se describe el protocolo а para el aislamiento de corazón puro, una rata muy unido las mitocondrias de los estudios funcionales o estructurales de la bioenergética celular, mediciones biofísicas, la proteómica y el ADN mitocondrial y el análisis de los lípidos.

Preparación de corazón de rata altamente acoplado mitocondrias

La función de las mitocondrias en la generación de ATP celular mediante el proceso de fosforilación oxidativa es ampliamente reconocida. Durante las últimas décadas, ha...

Soy el Dr. Ska. Hoy les mostraré cómo aislar mitocondrias del corazón rojo. Los pasos clave para aislar mitocondrias a partir de tejidos consisten primero en la ruptura del tejido y de las células mediante tratamiento mecánico o enzimático.Segundo, centrifugación diferencial a baja velocidad para eliminar restos celulares, células rotas y núcleos. Y tercero, centrifugación a mayor velocidad para recolectar mitocondrias. Los instrumentos y soluciones se prepararon y almacenaron de antemano en la cámara fría.Se deben mantener varias condiciones durante el aislamiento. Primero, una desintegración tisular completa, ya que afecta directamente el rendimiento de mitocondrias. Segundo, mantener la temperatura baja durante todos los pasos, pero tener cuidado con la congelación excesiva de las soluciones, especialmente durante la centrifugación.En tercer lugar, cuanto más rápido opere, mejor será la calidad de las mitocondrias obtenidas. Los animales fueron sacrificados de acuerdo con la Ley de Procedimientos Científicos Aplicados a los Animales del Reino Unido, y todas las operaciones siguientes se llevaron a cabo en cámara fría. Prepare tres vasos que contengan 40 mililitros de tampón de lavado.Enfríe esto en un baño de hielo durante tres a cinco minutos antes de pasar al siguiente paso. Asegúrese de no congelarlos en exceso y utilícelos inmediatamente, justo después de que comiencen a aparecer rápidamente nubes de cristales de hielo; abra rápidamente el tórax de la mosca decapitada y extraiga el corazón. Haga pequeñas incisiones y luego transfiera inmediatamente el corazón a la solución fría con hielo.En el primer vaso de precipitados, comprima el corazón para eliminar la sangre y colóquelo en el segundo vaso de precipitados. Repita esta operación para cada corazón. Es esencial enfriar y lavar rápidamente los corazones extraídos para obtener una preparación estándar libre de hemoglobina, eritrocitos y adas.Seque los corazones sobre el papel de filtro. Retire toda la grasa, la sangre coagulada y la arteria. Y extraiga el tejido ventricular.Luego, significa tirar del tejido con tijeras curvas pequeñas sobre la placa de Petri. Durante cinco minutos, coloque el tejido de MIT en el tejido. Presione y páselo a través. Después de prensar el tejido, transfiera el material al vaso con 50 ml de tampón de lavado y agite.Luego filtre la suspensión a través de un filtro de isla. Lave el tejido masculino en el filtro tres veces con el tampón de lavado y deseche el filtro. Transfiera el tejido lavado a 20 mils de tampón de lavado y colóquelo en el baño de hielo sobre el exterior magnético.Añada las tripsinas en solución bajo agitación constante e inicie el temporizador en el cuarto minuto de incubación. Homogenice brevemente la suspensión porciones por porción, poco a poco, utilizando un homogenizador de vidrio y teflón pequeño y flojo. Después de la homogenización, transfiera la suspensión a otro vaso de precipitados colocado en un segundo agitador.Repita el procedimiento en el minuto nueve, de modo que realice la homogeneización dos veces en total después de la segunda homogeneización. En el minuto 15 de la incubación, agregue 10 ml de tampón de aislamiento que contenga inhibidor de tripsina e incube durante un minuto más. Filtre nuevamente la suspensión a través de un filtro de nailon. En este caso, guarde el filtrado, transfiera el resto del tejido al homogeneizador y homogenice.Durante un minuto más, combine el homogenizado con el filtrado en el tubo de centrífuga. Asegúrese de que los tubos estén equilibrados por igual y realice una centrifugación a baja velocidad durante 15 minutos. A 600 G, filtre cuidadosamente el sobrenadante resultante en un nuevo tubo de centrífuga.Trate de evitar la contaminación por el precipitado y centrifugue nuevamente durante 15 minutos a 8.500 ×g. Después de la centrifugación a alta velocidad, deseche el sobrenadante y enjuague el precipitado con un tampón, intentando eliminar la capa externa blanca y esponjosa. Añada un volumen de tampón de aislamiento. Incline el tubo de un lado a otro y retire el resto del tampón.Desagregue el pellet con la pipeta tratando de evitar la mancha roja de eritrocitos en el fondo; suspenda el pellet con un homogenizador pequeño o, alternativamente, mediante pipeteo suave, diluya la suspensión con más tampón de aislamiento y centrifugue nuevamente durante 15 minutos a 8.500 ×g. Deseche el sobrenadante S. Susp. Suspenda el pellet en tampón de suspensión Resus y centrifugue nuevamente a 8.500 ×g. El pellet marrón resultante contiene mitocondrias íntegras lavadas. Susp. suspenda el pellet en un volumen muy pequeño de tampón de suspensión Resus.Cuanto menor sea el volumen que utilice, más estable será la preparación de mitocondrias. Por lo general, son suficientes 200 microlitros del tampón por corazón. El rendimiento esperado de mitocondrias preparadas es de aproximadamente 10 a 15 miligramos de proteína mitocondrial por corazón.Y la relación de control respiratorio sobre sustratos del complejo I de tal preparación debe estar entre ocho y 12. Buena suerte con su preparación.

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Investigación

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