Una célula a célula macromoleculares de transporte de ensayo En la Planta La utilización de bombardeo biolística

El objetivo general del siguiente experimento es analizar el grado de movimiento de célula a célula de una proteína marcada con fluorescencia en el epidermis vegetal. Esto se logra obteniendo partículas de oro recubiertas con ADN para expresar transitoriamente la proteína de fusión de interés en el epidermis vegetal. Como segundo paso, el ADN se introduce en el epidermis vegetal, lo que permite la expresión y el movimiento de la proteína de fusión analizada.

A continuación, se observa la proteína de fusión expresada mediante microscopía confocal con el fin de monitorear la expresión y la localización de las proteínas de ensayo marcadas con fluorescencia. Se obtienen resultados que muestran el grado de transporte de célula a célula de la proteína marcada con fluorescencia, basado en el análisis de la distribución de la señal fluorescente mediante microscopía confocal. Hola, soy Ben Myers del laboratorio de KY en el Departamento de Bioquímica y Biología Celular de la Universidad Estatal de Nueva York en Stony Brook.

Hoy les mostraremos un procedimiento para analizar el grado de movimiento de célula a célula o de una proteína marcada con fluorescencia en el epidermis vegetal. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar el transporte de célula a célula de proteínas de movimiento virales en distintos fondos genéticos vegetales y para comparar la movilidad de diferentes tipos de proteínas. Así que comencemos.

Para comenzar este protocolo, cultive una planta de arabidopsis en Promix bx. En una maceta de tamaño adecuado, utilice una cámara controlada ambientalmente con un fotoperíodo corto y una humedad relativa del 40 al 65 % para las plantas de nicotiana, hamana y tabaco nicotiana; cultive cada planta en Promix BX en una maceta más grande. Nuevamente, proporcione una cámara con condiciones ambientales controladas con un fotoperíodo largo y una humedad relativa del 40 al 65 %.

Fertilice la planta ocasionalmente con productos disponibles comercialmente, como se describió previamente. Después de cultivar la planta de Opsis durante seis a ocho semanas, seleccione hojas para el experimento que tengan un tamaño mayor a 15 milímetros por 35 milímetros, donde la medición de longitud incluye el pecíolo; para plantas benanna y NAC, cultive las plantas durante siete a diez semanas. Luego, seleccione hojas mayores a 50 milímetros por 70 milímetros para benanna y de 100 milímetros por 125 milímetros para NAC.

En estos casos, las mediciones de longitud no incluyen los pecíolos. Antes de comenzar la entrega mediante BIC de micropartículas recubiertas con ADN, prepare el cartucho del cañón genético con micropartículas de oro recubiertas con ADN como se describió previamente en detalle. Luego, retire las hojas del mismo estadio de desarrollo con una cuchilla de afeitar afilada e inmediatamente colóquelas con los lados AAL hacia arriba sobre una superficie plana de espuma de poliestireno.

El lado ABA de la hoja representa un mejor sustrato para el bombardeo debido a su menor densidad de tricomas y cutícula más delgada. Hojas pequeñas, como las de *rapid opsis*, pueden inmovilizarse cubriéndolas con un trozo de malla de pantalla de ventana y fijando la malla con alfileres al superficie de poliestireno. Mantenga las hojas planas para aumentar la eficiencia de la entrega de partículas y minimizar el daño al tejido durante el microbombardeo.

Luego, inserte el cartucho con micropartículas recubiertas de ADN en la pistola. Para un opsis de conejo. Realice el disparo a presiones de 140 a 160 PSI para micropartículas de 0,6 micrones.

Bombardee la muestra utilizando un cartucho por hoja para distribuir las micropartículas sobre un área superficial de 10 a 12 milímetros de diámetro. Para end benanna y end baum. Realice el disparo a presiones de 160 a 180 PSI para micropartículas de 0,6 micrones con hojas más grandes de end benanna y end tabaco.

Es posible realizar múltiples bombardeos en la misma hoja; sin embargo, deben realizarse en posiciones simétricas a cada lado del nervio central para dirigirse a áreas de la hoja en la misma etapa de desarrollo. La señal fluorescente de las proteínas marcadas expresadas transitoriamente se visualiza mediante microscopía confocal. Debe tenerse cuidado en encontrar las condiciones óptimas de microscopía para la detección de cada proteína analizada.

Utilice un objetivo de 40 x para observar proteínas que presentan acumulación intracelular limitada con intensidades de señal débiles, como la localización en la membrana plasmática de la proteína de movimiento del virus del mosaico del tabaco o T-M-V-M-P. Esto proporciona una mayor resolución y sensibilidad mejorada. Sin embargo, se puede utilizar un objetivo de 10 x con función de zoom confocal para obtener imágenes más rápidas de proteínas que muestran distribución citoplasmática con intensidades de señal fuertes, como la proteína verde fluorescente libre o YFP. El transporte simplista se infiere a partir de la aparición de agrupaciones multicelulares que contienen la señal fluorescente.

El número de estos grupos y la cantidad de células en cada grupo indica el grado de transporte de célula a célula. Para obtener datos confiables, registre al menos 100 expresiones. Por sistema experimental, asegúrese de realizar los experimentos simultáneamente.

Cuando se realizarán las comparaciones. Aquí, se detectó el transporte simplista de proteínas marcadas con fluorescencia. Se muestran imágenes confocales típicas obtenidas tras el microbombardeo de una hoja de end hamana con un constructo que expresa A TMV mp YFP.

Se observa un movimiento simplista del MP del TMV-YFP basado en la aparición de agrupaciones multicelulares de la señal YFP. Sin embargo, no todo el MP del TMV-YFP expresado de forma transitoria es capaz de moverse, como lo demuestra la señal en una sola célula. En algunos microproyectiles.

Estadísticamente, en menos del 40 % de los grupos de señales contados, la proteína TMV MP YFP es incapaz de moverse entre células. Por el contrario, en más del 60 % de los grupos, la proteína se desplaza entre dos y cinco células. Dado que la diseminación a dos células es la más frecuente, las proteínas con un tamaño molecular relativamente pequeño y sin actividad intrínseca de movimiento pueden difundirse a través de la SMA plasmática para trasladarse de célula a célula.

Por ejemplo, la YFP libre o una XYFP se dispersa entre varias células y más del 30 % de los cúmulos contados. Por el contrario, esta difusión no específica no ocurre para un dímero traduccional de YFP o dos XYFP, que es comparable en tamaño con la proteína de fusión TMV MP-YFP y es completamente autónoma a nivel celular. Acabamos de mostrarle cómo analizar el movimiento de proteínas marcadas con fluorescencia de célula a célula mediante expresión transitoria utilizando un sistema de bioblasterio en el epidermis vegetal.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar preparar plantas sanas y vigorosas, partículas de oro recubiertas de ADN de alta calidad para la entrega del ADN y analizar suficientes agrupaciones de expresión para obtener resultados estadísticamente confiables. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.