Name: Aislamiento de células madre de la retina del ojo del ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Aprenda a aislar células madre de la retina del epitelio ciliar del ojo de ratón mediante disección microscópica y tratamiento enzimático. Este método permite formar esferas clonales para estudiar propiedades de renovación y multipotencialidad.

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Damos las gracias a Laura Clarke por su inestimable ayuda. Este trabajo es apoyado por la economía neoclásica: la Red de Células Madre, CIHR y los NIH.

1. Prepare las soluciones de disección y soluciones enzimáticas <ol><li> Hacer que el líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) y los medios de comunicación libre de suero antes de tiempo y refrigere. </li><li> Pesar el ácido quinurénico (0,2 mg / ml) y se disuelven en 10 ml de hilo ACSF en un baño de agua a 37 ° C antes de tiempo, ya que no se disuelven fácilmente. </li><li> Pesar de la tripsina (1,33 mg / ml) y hialuronidasa (0,67 mg / ml) y colocar en un tubo de 15 ml y mantener a -20 ° C hasta que se necesite. Añadir la solución de ácido quinurénico a este tubo y el filtro usando un filtro de 22 micras jeringa justo antes de su uso. </li><li> Pesar inhibidor de tripsina (Ovamucoid: 1 mg / ml) y se disuelven en agua tibia medio libre de suero y el filtro con filtro de jeringa de 22μm. </li><li> Hacen los medios de recubrimiento: medio libre de suero que contiene FGF2 (10 ng / ml) y heparina (2 mg / mL). </li></ol> 2. Aislar las células madre de la retina del ojo del ratón <ol><li> El aislamiento de las células madre de la retina se realiza en una sala específica estéril dedicado a los experimentos de cultivo primario. Antes de iniciar este procedimiento, configure el microscopio de disección y la fuente de luz fría, y luego diseñar los instrumentos de disección estéril. Cada campana tiene un esterilizador de calor para la esterilización de cuentas de los instrumentos entre los pasos. </li><li> Vamos a aislar las células madre de la retina de los ojos que se han colocado de inmediato en una placa de Petri estéril que contiene el líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) después de su eliminación de los ratones sacrificados de acuerdo a protocolos aprobados ética animal. </li><li> Bajo el microscopio de disección, limpia los ojos con unas pinzas: deshacerse del pelo y el tejido conectivo que se une a la córnea / frontera escleral. A continuación, traslado a los ojos a un nuevo plato con ACSF. </li><li> Mientras que suavemente manteniendo el ojo fijo con unas pinzas dentadas, usar un ángulo de micro-disección de tijeras para cortar los músculos oculares. Quitar el nervio óptico y si todavía está conectado a la vista. Trate de no aplastar a los ojos durante el proceso. La transferencia de los ojos a un nuevo plato con ACSF. </li><li> Siguiente uso de micro-disección curvas tijeras para cortar el ojo en la mitad: comienzan en el nervio óptico y cortar por el centro de la córnea, encuentro de vuelta en el nervio óptico, donde se inició el corte. Lo ideal es que las dos partes del ojo son más o menos equivalente en tamaño, ya que esto hará que el siguiente paso sea más fácil. </li><li> La celebración de las córneas con dos pinzas, suavemente pelar el ojo dos mitades. Retire y deseche las lentes, las vísceras, y la retina neural de las conchas de los ojos. Transferencia de las conchas de un nuevo plato con ACSF. </li><li> Ahora estamos listos para aislar el epitelio ciliar. Para comenzar, orientar la cáscara del ojo para que la córnea está a su derecha y el epitelio pigmentado retiniano (EPR) está a la izquierda. Suavemente la capa pin vista hacia abajo con una pinza recta en el lado del EPR. </li><li> A continuación, utiliza un bisturí para cortar la córnea y el iris lejos del epitelio ciliar del ojo presionando suavemente sobre el bisturí en lugar de utilizar los movimientos de aserrado. </li><li> Después de eso, cortar el epitelio ciliar lejos de la RPE. Use unas pinzas dentadas no a la transferencia de la franja de epitelio ciliar a una nueva de 35 mm plato que contiene ACSF. </li><li> De la misma manera, aislar el epitelio ciliar de la cáscara del otro ojo. </li><li> Una vez que ambas bandas del epitelio ciliar se han recogido, la transferencia de las tiras en una placa de 35 mm que contiene 2 ml de Dispasa. Coloque el plato con las tiras en una incubadora a 37 ° C durante 10 minutos. </li><li> Después de 10 minutos, la transferencia de las tiras de la Dispasa en un plato que contiene 2 ml de tripsina filtrada, hialuronidasa y ácido quinurénico. Coloque el plato a 37 ° C durante 10 minutos. </li><li> Ahora regresa a la microscopio de disección. Mientras mantiene la esclerótica hacia abajo con pinzas rectas, el uso de la parte inferior de la curva no dentada pinzas para raspar suavemente el epitelio ciliar lejos de la esclerótica. </li><li> Retire la esclerótica del plato. Todo lo que se debe dejar en el plato ahora son las células de interés y la solución enzimática. </li><li> El uso de un pulido al fuego de algodón conectado pipeta, transferir esta solución en un tubo de 14 ml. Triturar esta solución 30 veces para romper las células epiteliales con cuidado pasar la solución dentro y fuera de la pipeta. </li><li> Centrifugar el tubo durante 5 minutos a 1500 RPM. Cuando se hace la centrifugación, sacar el tubo de la centrífuga con cuidado ya que las células son propensos a la que salió de la parte inferior del tubo en esta etapa. </li><li> Aspire con cuidado la mayor parte de el sobrenadante con una pipeta pulida al fuego, y luego agregar 1 ml de inhibidor de tripsina en el medio libre de suero de las células. Use un pequeño algodón conectado pozo pipeta para triturar la muestra de aproximadamente 50 veces hasta que es una suspensión de una sola célula. </li><li> Centrifugar el tubo de nuevo durante 5 minutos a 1500 RPM. </li><li> Eliminar el sobrenadante y reemplazarlo con 1 ml de medio de galvanoplastia. Triturar suavemente con una pipeta de vidrio pulido al fuego para volver a suspender la ceLLS. </li><li> Después de contar las células, las placas a la densidad deseada en una placa de 24 pocillos. Por lo general, la placa de 10 células / mm llenando cada primer pozo en medio y luego añadir la suspensión celular para obtener un volumen final de 500 l de los medios de comunicación. </li><li> Colocar la placa en un 37 ° C incubadora de CO 2 en los que no se moverán hasta que se cuentan las esferas que surgen después de 7 días. </li></ol> 3. Los resultados de aislamiento de células madre de la retina <ol><li> Cuando este procedimiento se realiza con éxito, la disección células epiteliales ciliares debería tener este aspecto después de haber sido disociadas y chapada a la baja densidad (Figura 1). </li><li> Después de 7 días en la cultura, las esferas de células madre de la retina que se plantean son contados. Una esfera debe ser más de 75 micras de diámetro y de libre flotación para ser considerado como una esfera de células madre derivadas. (Figura 2). Sin embargo, algunas células se han esferoides limitado la proliferación y la forma de que no cumplen con el criterio de tamaño y no se contará como esferas de células madre derivadas; un ejemplo de un esferoide se muestra a continuación (Figura 2). </li></ol> 4. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. <img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2.

<ol><li>Tropepe, V., Coles, B. L., Chiasson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells in the adult mammalian eye.</a> Science. 287, 2032-2036 (2000).</li>
<li>Ahmad, I., Tang, L., Pham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+progenitors+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of neural progenitors in the adult mammalian eye.</a> Biochem Biophys Res Commun. 270, 517-521 (2000).</li>
<li>Coles, B. L., Angenieux, B., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+isolation+and+the+characterization+of+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15772-15777 (2004).</li>
<li>Cicero, S. A., Johnson, D., Reyntjens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+previously+identified+as+retinal+stem+cells+are+pigmented+ciliary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 6685-6690 (2009).</li>
<li>Lamba, D., Karl, M., Reh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regeneration+and+cell+replacement%3A+a+view+from+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural regeneration and cell replacement: a view from the eye.</a> Cell Stem Cell. 2 (6), 538-549 (2008).</li>
<li>Coles, B. L., Horsford, D. J., McInnes, R. R., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+retinal+progenitor+cells+leads+to+an+increase+in+the+retinal+stem+cell+population+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of retinal progenitor cells leads to an increase in the retinal stem cell population in vivo.</a> Eur J Neurosci. 23, 75-82 (2006).</li>
<li>Angénieux, B., Schorderet, F. D., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+is+a+neuronal+differentiation+factor+for+retinal+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor is a neuronal differentiation factor for retinal stem cells in vitro.</a> Stem Cells. 24 (3), 696-706 (2006).</li>
<li>Xu, S., Sunderland, M. E., Coles, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proliferation+and+expansion+of+retinal+stem+cells+require+functional+Pax6%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The proliferation and expansion of retinal stem cells require functional Pax6.</a> Dev Biol. 304, 713-721 (2007).</li>
<li>Canola, K., Angénieux, B., Tekaya, M., Quiambao, A., Naash, M. I., Munier, F. L., Schorderet, D. F., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells+transplanted+into+models+of+late+stages+of+retinitis+pigmentosa+preferentially+adopt+a+glial+or+a+retinal+ganglion+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells transplanted into models of late stages of retinitis pigmentosa preferentially adopt a glial or a retinal ganglion cell fate.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (1), 446-4454 (2007).</li>
<li>Canola, K., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cells+committed+towards+the+photoreceptor+fate+for+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Generation of cells committed towards the photoreceptor fate for retinal transplantation.</a> Neuroreport. 18 (9), 851-855 (2007).</li>
<li>Djojosubroto, M. W., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells%3A+promising+candidates+for+retina+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells: promising candidates for retina transplantation.</a> Cell Tissue Res. 331 (1), 347-357 (2008).</li>
<li>Inoue, T., Coles, B. L., Dorval, K., Bremner, R., Bessho, Y., Kageyama, R., Hino, S., Matsuoka, M., Craft, C. M., McInnes, R. R., Tremblay, F., Prusky, G. T., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+functional+photoreceptor+differentiation+from+adult+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Maximizing functional photoreceptor differentiation from adult human retinal stem cells.</a> Stem Cells. 28 (3), 489-500 (2010).</li>
<li>Tropepe, V., Sibilia, M., Ciruna, B. G., Rossant, J., Wagner, E. F., Kooy, D. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+neural+stem+cells+proliferate+in+response+to+EGF+and+FGF+in+the+developing+mouse+telencephalon.+Dev+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev Biol.</a> , 208-201 (1999).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L., Brain, I., Purpura, K. A., Karpowicz, P., Zandstra, P. W., Morshead, C. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%27t+look%3A+growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
</ol>

Este protocolo describe cómo aislar las células madre de la retina del epitelio ciliar del ojo con el ratón 3.1. La metodología para el aislamiento de las tiras de epitelio ciliar puede variar, sin embargo, las enzimas y la metodología para la consecución de una suspensión de una sola célula han sido optimizados en este protocolo. También es importante que las tiras de epitelio ciliar que han sido aisladas no contienen grandes cantidades de RPE o de la córnea, ya que estos parecen tener un impacto negativo en el número total de esferas que pueden ser aislados de cada ojo. Además, los medios de comunicación libres de suero que hacemos que se formuló originalmente para el cerebro neuroesferas 13, es ideal para el cultivo de la retina esferas de células madre. También hay que asegurarse de que las células no se alteran después de que se han plateado y se colocan en la incubadora para que los ámbitos de crecimiento no se agregan juntos 14. Una vez que las células madre de la retina se han formado las esferas clonal, que se puede contar para obtener un número potencial de células madre por ojo. Las esferas se pueden disociarse en células individuales y se pasaron a conocer la renovación capacidades de auto-o diferenciarse en diferentes tipos de células de la retina neural y el EPR usando diferentes combinaciones de factores de crecimiento y / o proteínas.

<table><tbody><tr><td>Microscopio Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fuente de luz fría</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>KL1500</td><td>luz óptica de brazo dual</td></tr><tr><td>Tijeras mini Vannas curvas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Vannas anguladas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15005-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas #7 Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-30</td><td>no dentadas</td></tr><tr><td>Pinzas #5 Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>rectas</td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td>curvas dentadas</td></tr><tr><td>Mango de bisturí #3</td><td>Almedic</td><td>2586-M36-10</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillas de bisturí #10</td><td>Almedic</td><td>2580-M90-10</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador por perlas calientes</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>VWR international</td><td>CACB354235</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1005</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cinurénico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3375</td><td>1000 UI</td></tr><tr><td>Inhibidor de la tripsina</td><td>Roche Group</td><td>10109878001</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 35 mm</td><td>VWR international</td><td>CA354235</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 pocillos</td><td>VWR international</td><td>CA73521-004</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas con tapón de algodón</td><td>VWR international</td><td>14672-400</td><td>pulidas con llama</td></tr><tr><td>Tubos de 14 mL</td><td>Falcon BD</td><td>352057</td><td>Poliestireno</td></tr><tr><td>Medio sin suero</td><td></td><td></td><td>Ref# 13 para la formulación</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td>100 UI</td></tr></tbody></table>

aislamiento de células madre de la retina del ojo del ratón

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

La célula madre de la retina de ratones adultos (RSC) es una célula poco de reposo se encuentran en el epitelio ciliar (CE) del ojo de los mamíferos 1,2,3. La CE está compuesto por no pigmentados capas de células pigmentadas interior y exterior, y las colonias clonal RSC que surgen de una sola célula pigmentada de la CE se compone de dos células pigmentadas y no pigmentadas que se pueden diferenciar para formar todos los tipos de células de la retina neural y el EPR. Existe cierta controversia sobre si todas las células dentro de las esferas contienen al menos algo de pigmento 4, pero las células son todavía capaces de formar los tipos de células diferentes que se encuentran dentro de la retina neural 1-3. En algunas especies, como los anfibios y los peces, sus ojos son capaces de regenerarse después de una lesión 5, sin embargo, el ojo de los mamíferos no muestra propiedades regenerativas tales. Tratamos de identificar las células madre in vivo y para comprender los mecanismos que impiden que las células madre de la retina de mamíferos en reposo 6-8, incluso después de la lesión, así como su uso como una fuente potencial de células para ayudar a reparar los modelos físicos o genéticos de la lesión en el ojo a través del trasplante 9-12. Aquí se describe cómo aislar las células epiteliales ciliar del ojo del ratón y hacer crecer en cultivo con el fin de formar la retina esferas clonal de células madre. Dado que no existen marcadores conocidos de las células madre in vivo, estos ámbitos son la única forma conocida para identificar de manera prospectiva la población de células madre en el epitelio ciliar del ojo.

En este video, vamos a demostrar cómo aislar las células madre de la retina del epitelio ciliar del ojo del ratón y hacer crecer en cultivo de forma clonal esferas de retina. Las esferas que se encuentran aisladas poseen las propiedades cardinales de las células madre: la auto-renovación y multipotencialidad.

Aislamiento de células madre de la retina del ojo del ratón

La célula madre retiniana (RSC) adulta del ratón es una célula quiescente poco frecuente que se encuentra dentro del epitelio ciliar (CE) del ojo de los mamíferos1,2,3. El CE está compuesto por...

El objetivo general de este procedimiento es aislar células madre retinianas del epitelio ciliar del ojo. Esto se logra primero limpiando y cortando el ojo por la mitad, comenzando desde el nervio óptico, cortando a través de la córnea y volviendo a encontrarse en el nervio óptico, y luego eliminando la retina neural y el cristalino. El segundo paso del procedimiento consiste en extraer el epitelio ciliar cortando la córnea, el iris y el epitelio pigmentado de la retina.El tercer paso del procedimiento consiste en tratar enzimáticamente el epitelio ciliar, eliminar la esclerótica y disociar mecánicamente el epitelio en células individuales. El paso final del procedimiento es resuspender las células en medio libre de suero y sembrarlas en placas de cultivo celular que contienen medio libre de suero con factores de crecimiento. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran prospectivamente el número de células madre presentes en el epitelio ciliar del ojo mediante la formación de esferas clonales in vitro.Hola, me llamo Brenda Coles. Nuestro laboratorio desarrolló por primera vez este método cuando estábamos investigando artículos sobre las capacidades regenerativas de los anfibios y los peces en sus ojos, y formulamos la hipótesis de que quizás existía una célula en el ojo de los mamíferos con las mismas capacidades. El aislamiento de las células madre retinianas se realiza en una sala estéril específica dedicada a experimentos de cultivo primario.Antes de comenzar este procedimiento, configure el microscopio de disección y la fuente de luz fría, y luego coloque los instrumentos de disección estériles. Cada cabina dispone de un esterilizador por calor para esterilizar los instrumentos entre pasos. Aisleremos células madre retinianas de ojos que se hayan colocado inmediatamente en una placa de Petri estéril que contenga líquido cefalorraquídeo artificial tras su extracción de ratones sacrificados según protocolos éticos para animales aprobados. El aspecto más difícil de este procedimiento consiste en diseccionar un objeto redondo bajo el microscopio.Se debe tener mucho cuidado para no destruir el tejido de interés. Bajo el microscopio estereoscópico, limpie el ojo con pinzas. Elimine el pelo y el tejido conectado que está adherido al borde escleral de la córnea. A continuación, transfiera el ojo a un nuevo recipiente con A CSF mientras sostiene el ojo inmóvil con pinzas dentadas.Utilice tijeras microcirujanas anguladas para eliminar los músculos oculares. Retire también el nervio óptico si aún está adherido al ojo, tratando de no aplastar el ojo durante este proceso. Transfiera los ojos a un nuevo recipiente con LCR.A continuación, utilice tijeras curvas de disección micro para cortar el ojo por la mitad. Comience en el nervio óptico y corte a través del centro de la córnea, regresando al nervio óptico donde se inició el corte. Es ideal que las dos piezas del ojo sean aproximadamente equivalentes en tamaño, ya que esto facilitará el siguiente paso.Sosteniendo las córneas con dos pinzas, separe suavemente las dos mitades del ojo. Retire y deseche las vísceras del cristalino y la retina neural de las cáscaras oculares. Transfiera las cáscaras a un nuevo recipiente con A CSF.Ahora estamos listos para aislar el epitelio ciliar. Para comenzar, oriente la cáscara del ojo de manera que la córnea quede a su derecha y el epitelio pigmentado de la retina quede a su izquierda. Sujete suavemente la cáscara del ojo con pinzas rectas por el lado del EPR.A continuación, utilice el bisturí para cortar la córnea y el iris separándolos del epitelio ciliar del ojo, presionando suavemente hacia abajo con el bisturí en lugar de realizar movimientos de sierra. Después, corte el epitelio ciliar para separarlo del epitelio pigmentario de la retina (RPE). Utilice pinzas sin dientes para transferir la tira de epitelio ciliar a un nuevo recipiente de 35 milímetros que contenga A CSF.De la misma manera, aísle el epitelio ciliar de la cáscara del otro ojo. Una vez que se hayan recolectado las tiras de epitelio ciliar, transfiera las tiras a una placa de 35 milímetros que contenga dos mililitros de dis space. Coloque la placa con las tiras en un incubador a 37 grados Celsius durante 10 minutos.Después de 10 minutos, transfiera las tiras desde el espacio de disección a un recipiente que contenga dos mililitros de gotas filtradas en ácido hálico ur haase y kind reic. Coloque el recipiente a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Regrese ahora al microscopio de disección mientras sostiene la esclerótica hacia abajo con pinzas rectas.Utilice la parte inferior de la pinza curva sin calibrar para raspar suavemente el epitelio ciliar de la esclerótica. Retire la esclerótica del recipiente. Todo lo que debe quedar en el recipiente.Ahora están las células de interés y la solución enzimática. Utilizando una pipeta con punta de algodón pulida con fuego, transfiera la solución a un tubo de 14 litros. Triture esta solución 30 veces para separar las células epiteliales, forzando suavemente la solución dentro y fuera de la pipeta. Centrifugue el tubo durante cinco minutos a 1500 RPM.Una vez finalizada la centrifugación, retire el tubo del centrífugo con cuidado, ya que las células tienden a desprenderse del fondo del tubo. En esta etapa, aspire suavemente la mayor parte del SuperNet utilizando una pipeta con punta flameada y luego agregue un mililitro de inhibidor de tripsina en medio sin suero a las células.Utilice una pipeta de punta estrecha con algodón para pasar la muestra aproximadamente 50 veces hasta obtener una suspensión de células individuales. Vuelva a centrifugar el tubo durante cinco minutos. A 1500 RPM, retire el sobrenadante y sustitúyalo con un mililitro de su medio de siembra.Refrigere suavemente el medio utilizando una pipeta de vidrio pulida con llama para resuspender las células. Después de contar las células, siémelas a la densidad deseada. En una placa de 24 pocillos, generalmente sembramos 10 células por microlitro, llenando primero cada pocillo con medio y luego añadiendo la suspensión celular para obtener un volumen final de 500 microlitros de medio.Coloque la placa en un incubador de dióxido de carbono a 37 grados Celsius, donde no se moverá hasta que cuente las esferas que surjan después de siete días, cuando este procedimiento se realice con éxito. Las células epiteliales ciliares disecadas deben tener este aspecto tras ser disociadas y sembradas a baja densidad. Después de siete días en cultivo, se cuentan las esferas de células madre retinianas que se forman.Una esfera debe tener más de 75 micrones de diámetro y estar libre flotante para ser contabilizada como una esfera derivada de células madre. Sin embargo, algunas células tendrán una proliferación limitada y formarán PHE que no cumplen con el criterio de tamaño y no se contarán como esferas derivadas de células madre. Un ejemplo de dicho asteroide se muestra aquí tras su desarrollo.Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las ciencias de la visión exploraran la posibilidad de utilizar células madre retinianas en el tratamiento de enfermedades retinianas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra el procedimiento para aislar células ganglionares primarias de la retina (RGCs) murinas mediante citometría de flujo. Este método permite el estudio futuro de las RGCs, con el objetivo de comprender mejor la importante disminución de la agudeza visual que resulta de la pérdida de RGCs funcionales en las enfermedades neurodegenerativas.

Aislamiento de células ganglionares de la retina murinas mediante clasificación celular activada por fluorescencia

Millones de personas sufren de enfermedades degenerativas retinianas que resultan en ceguera irreversible. Un elemento común de muchas de estas enfermedades es la pérdida de células ganglionares de la retina (RGCs). Este protocolo detallado describe el aislamiento de los RGC murinos primarios mediante selección positiva y negativa con citometría de flujo.

Aislamiento de células primarias de ganglio retiniano murino (RGC) por citometría de flujo

El epitelio retiniano del pigmento (RPE) es un epitelio de múltiples funciones del ojo. Aquí presentamos un protocolo para establecer cultivos celulares primarios derivados del RPE murino.

Cultivos celulares primarios de células del epitelio pigmentario de la retina del ratón

Este manuscrito describe un protocolo simple para el aislamiento de las arteriolas de la retina de rata que puede utilizarse en, calcio presión y proyección de imagen de miografía estudios electrofisiológicos.

Aislamiento de arteriolas retinianas por estudios de fisiología celular Ex Vivo

Este protocolo presenta dos técnicas para aislar los compartimentos subcelulares de los fotorreceptores de bastón murino para el análisis de proteínas. El primer método utiliza retina viva y papel de filtro de celulosa para separar los segmentos externos de la varilla, mientras que el segundo emplea retinas liofilizadas y cinta adhesiva para pelar las capas internas y externas de la varilla.

Dos métodos de peeling para el aislamiento de compartimentos de células fotorreceptoras en la retina del ratón para el análisis de proteínas

Este protocolo describe un método para el aislamiento de células endoteliales retinianas postnatales murinas optimizadas para el rendimiento, la pureza y la viabilidad celular. Estas células son adecuadas para los enfoques de secuenciación de próxima generación.

Aislamiento de células endoteliales retinianas murinas para secuenciación de próxima generación

Este manuscrito describe un protocolo simplificado para el aislamiento de las células del epitelio pigmentado de la retina (EPR) de los ojos de ratón de una manera gradual. El protocolo incluye la enucleación y disección de los ojos del ratón, seguida del aislamiento, la siembra y el cultivo de células del EPR.

Aislamiento de células primarias del epitelio pigmentado de la retina del ratón

Describimos un método simple y eficiente para aislar células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) de los ojos de conejillos de indias pigmentados jóvenes. Este procedimiento permite realizar estudios de biología molecular de seguimiento en el EPR aislado, incluidos los análisis de expresión génica.

Aislamiento de células epiteliales pigmentarias de la retina de ojos de conejillo de indias

Este manuscrito describe un protocolo detallado para aislar células de Müller gliales de la retina de ojos de ratón. El protocolo comienza con la enucleación y disección de los ojos de los ratones, seguida del aislamiento, la siembra y el cultivo de las células de Müller.

Aislamiento de células Müller gliales retinianas primarias de ratón

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) actúa como una barrera crucial entre la coroides y la retina, promoviendo la salud y la función de los tipos de células de la retina, como los fotorreceptores. En este trabajo se describe un protocolo sencillo y eficaz para el aislamiento y cultivo de EPR murino adulto.

Un método simplificado para el aislamiento y cultivo de células epiteliales pigmentarias de la retina de ratones adultos

Aquí, proporcionamos una metodología detallada para aislar la retina del ojo del ratón para una experimentación ex vivo extendida. Este protocolo hace hincapié en hacer que este enfoque técnicamente exigente sea accesible para los investigadores que deseen aprovechar las vías de investigación que ofrece mantener la glía de la retina in situ en tejido vivo.

Un modelo de explante ex vivo para estudiar las interacciones gliales en la retina del ratón

Aprenda a aislar células madre de la retina del epitelio ciliar del ojo de ratón mediante disección microscópica y tratamiento enzimático. Este método permite formar esferas clonales para estudiar propiedades de renovación y multipotencialidad.

Aislamiento de células madre de la retina del ojo del ratón

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