Aislamiento de células madre de la retina del ojo del ratón

En este video, vamos a demostrar cómo aislar las células madre de la retina del epitelio ciliar del ojo del ratón y hacer crecer en cultivo de forma clonal esferas de retina. Las esferas que se encuentran aisladas poseen las propiedades cardinales de las células madre: la auto-renovación y multipotencialidad.

El objetivo general de este procedimiento es aislar las células madre de la retina del epitelio ciliar del ojo. Esto se logra primero limpiando y cortando el ojo por la mitad, comenzando desde el nervio óptico, cortando a través de la córnea y encontrándose de nuevo en el nervio óptico, y luego retirando la retina neural y el cristalino. El segundo paso del procedimiento es cortar el epitelio ciliar cortando la córnea, el iris y el epitelio pigmentado de la retina.

El tercer paso del procedimiento es tratar enzimáticamente el epitelio ciliar, eliminar la esclerótica y disociar mecánicamente el epitelio en células individuales. El paso final del procedimiento es resuspender las células en medios libres de suero y colocarlas en placas de cultivo de tejidos que contengan medios libres de suero con factores de crecimiento. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran prospectivamente el número de células madre que se encuentran en el epitelio ciliar del ojo a través de la esfera clonal, formación in vitro.

Hola, mi nombre es Brenda Coles. Nuestro laboratorio ideó por primera vez este método cuando estábamos investigando artículos sobre las capacidades regenerativas de los anfibios y los peces en sus ojos, y planteó la hipótesis de que tal vez había una célula en el ojo de los mamíferos con las mismas capacidades. El aislamiento de las células madre de la retina se realiza en una sala estéril específica dedicada a los experimentos de cultivo primario.

Antes de comenzar este procedimiento, configure el microscopio de disección y la fuente de luz fría y luego coloque los instrumentos de disección estériles. Cada campana tiene un esterilizador de ritmo caliente para esterilizar los instrumentos entre pasos. Aislaremos las células madre de la retina de los ojos que se han colocado inmediatamente en una placa de Petri estéril que contiene líquido cefalorraquídeo artificial. Después de la extracción de ratones sacrificados de acuerdo con los protocolos de ética animal aprobados, el aspecto más difícil de este procedimiento es diseccionar un objeto redondo bajo el microscopio.

Se debe tener mucho cuidado para no destruir el tejido de interés Bajo el microscopio de disección, limpie el ojo con fórceps. Deshazte del vello y del tejido conectado que está unido al borde escleral de la córnea. Luego, transfiera el ojo a un nuevo plato con un líquido cefalorraquídeo mientras mantiene el ojo inmóvil con pinzas dentadas.

Use tijeras de microdisección en ángulo para eliminar los músculos oculares. Retire también el nervio óptico si todavía está unido al ojo, trate de no aplastar el ojo durante este proceso. Transfiera los ojos a un plato nuevo con un líquido cefalorraquídeo.

A continuación, utilizó unas tijeras de microdisección curvas para cortar el ojo por la mitad. Comience en el nervio óptico y corte a través del centro de la córnea encontrándose de nuevo en el nervio óptico donde se inició el corte. Lo ideal es que las dos piezas del ojo tengan un tamaño aproximadamente equivalente, ya que esto facilitará el siguiente paso.

Sosteniendo las córneas con dos pinzas, separe suavemente las dos mitades del ojo. Retire y deseche las lentes, las vísceras y la retina neural de las conchas de los ojos. Transfiera las cáscaras a un plato nuevo con un líquido cefalorraquídeo.

Ahora estamos listos para aislar el epitelio ciliar. Para comenzar, oriente la concha del ojo de modo que la córnea esté a su derecha y el epitelio pigmentado de la retina esté a su izquierda. Sujete suavemente la carcasa del ojo con pinzas rectas en el lado del EPR.

A continuación, utilice el bisturí para cortar la córnea y el iris lejos del epitelio ciliar del ojo empujando suavemente el bisturí hacia abajo en lugar de utilizar movimientos de sierra. Después de eso, corte el epitelio ciliar del EPR. Use pinzas no dentadas para transferir la tira de epitelio ciliar a una nueva placa de 35 milímetros que contenga LCR A.

De la misma manera, aísla el epitelio ciliar de la otra concha del ojo. Una vez que se hayan recogido las tiras de epitelio ciliar, transfiera las tiras a un plato de 35 milímetros que contenga dos mililitros de espacio dis. Coloque el plato con las tiras en una incubadora a 37 grados centígrados durante 10 minutos.

Después de 10 minutos, transfiera las tiras del espacio a un plato que contenga dos mililitros de gotas filtradas en Halle su haase y ácido reico amable. Coloca el plato a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Ahora regrese al microscopio de disección mientras sujeta la esclerótica con pinzas rectas.

Use la parte inferior de las pinzas curvas no clasificadas para raspar suavemente el epitelio ciliar de la esclerótica. Retira la esclerótica del plato. Todo eso hay que dejarlo en el plato.

Ahora están las células de interés y la solución enzimática. Con una pipeta taponada de algodón pulido al fuego, transfiera la solución a un tubo de 14 litros. Tritrate esta solución 30 veces para separar las células epiteliales forzando suavemente la solución dentro y fuera de la pipeta, centrífuga y tubo durante cinco minutos a 1500 RPM.

Cuando termine la centrifugación, retire el tubo de la centrífuga con cuidado. Ya que las células son propensas a salirse del fondo del tubo. En esta etapa, aspire suavemente la mayor parte de la SuperNet con una pipeta pulida al fuego y luego agregue un mililitro de inhibidor de tripsina en medios libres de suero a las células.

Utilice una pipeta pequeña con tapón de algodón para probar la muestra aproximadamente 50 veces hasta que sea una suspensión de una sola celda. Vuelva a centrifugar el tubo durante cinco minutos. A 1500 RPM, retire el sobrenadante y reemplácelo con un mililitro de su enchapado.

Refrigere suavemente con una pipeta de vidrio pulido al fuego para resuspender las células. Después de contar las celdas, póngalas en la placa a la densidad deseada. En una placa de 24 pocillos, generalmente colocamos 10 celdas por microlitro llenando cada pocillo primero con medio y luego agregando la suspensión celular para obtener un volumen final de 500 microlitros de medio.

Coloque la placa en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados donde no se moverá hasta que cuente las esferas que surgen después de siete días cuando este procedimiento se realiza con éxito. Las células epiteliales ciliares disecadas deben tener este aspecto después de ser disociadas y sembradas a baja densidad. Después de siete días en cultivo, se cuentan las esferas de células madre de la retina que surgen.

Una esfera debe tener más de 75 micras de diámetro y flotar libremente para que se cuente como una esfera derivada de células madre. Sin embargo, algunas células tendrán una proliferación limitada y formarán PHE que no cumplen con el criterio de tamaño y no se contarán como esferas derivadas de células madre. Un ejemplo de este tipo de asteroide se muestra aquí después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las ciencias de la visión exploraran la posibilidad de utilizar células madre de la retina en el tratamiento de la enfermedad de la retina.