El mantenimiento de Wolbachia en medio libre de células

Me llamo Courtney Ston. Trabajo en la Escuela de Salud Pública Johns Hopkins Bloomberg, en el laboratorio del Dr. Jason Rascon. Hoy realizaremos la purificación bacteriana a partir de células de insecto cultivadas.

En realidad, es un procedimiento muy sencillo. Comenzamos recolectando nuestras células y luego rompemos físicamente las membranas de las células huésped eucariotas mediante lisis con perlas de vidrio. A continuación, utilizamos centrifugación diferencial para separar las bacterias de los restos celulares del huésped.

Luego utilizamos una serie de pasos de filtración para eliminar aún más las partículas de células huésped, de modo que al final quede únicamente el pellet bacteriano purificado. Esta es, de hecho, una de las principales exigencias. Es una cabina de cultivo celular y se utiliza para mantener todo estéril porque los cultivos celulares son muy propensos a la contaminación.

También necesitamos medio de cultivo celular, las propias células, y las cultivamos en frascos de plástico. También necesitamos perlas de vidrio de tres milímetros, tubos cónicos de 50 ml, y necesitamos una centrífuga capaz de realizar una centrifugación a alta velocidad, aproximadamente 18.000 G para sedimentar nuestras bacterias, pero que también sea capaz de alcanzar unos 3.000 G o 2.500 G para sedimentar nuestras células huésped. Por lo tanto, lo primero que haremos es comenzar con nuestras células cultivadas.

Se cultivan correctamente, ¿verdad? Estos son frascos T 75. Tienen 15 ml de medio de cultivo, al igual que nosotros.

Entonces, lo primero que haremos es comenzar por interrumpir la capa celular y recolectarlas en un tubo cónico de centrífuga de 50 ml. Simplemente deben mover el espátula hacia arriba y hacia abajo sobre la capa celular, lo que desplaza todas las células al medio. Luego, una vez que nuestras células están en el medio, las pipeteamos para transferirlas al tubo cónico de ML.

Ahora, a las dos suspensiones celulares, vamos a añadir unas perlas de vidrio de tres milímetros. Estas han sido autoclavadas y, de hecho, se pueden reutilizar. Se pueden lavar y remojar en lejía y luego autoclavar antes de volver a usarlas.

Simplemente vierta, asegurándose de no tocar la boca del frasco B de vidrio con la boca del tubo de centrífuga. Y colocamos aproximadamente hasta la marca de volumen de cinco mililitros de perlas de vidrio en cada tubo de centrífuga. Así que lo siguiente que hacemos es querer romper físicamente las células del suelo para liberar nuestras bacterias en la suspensión.

Así que utilizamos un vórtex, lo colocamos en su velocidad máxima y luego mezclamos por cinco minutos. Ahora vortexamos las células con las perlas de vidrio de tres milímetros durante cinco minutos y pipeteamos el sobrenadante con una pipeta limpia hacia un tubo cónico de 50 mL limpio y estéril. Verteremos nuestra suspensión recién creada, la cual consiste en las bacterias liberadas y la solución, así como los restos completos de células.

Entonces, el siguiente paso que vamos a realizar es una centrifugación a baja velocidad para poder sedimentar el material en bloque y dejar las bacterias en suspensión. Vamos a utilizar la centrífuga a 2.500 ×g durante 10 minutos. Además, realizaremos la centrifugación a cuatro grados Celsius para ayudar a recoger el sedimento en el fondo.

Y así simplemente lo colocamos aquí, nos aseguramos de que esté equilibrado, lo cerramos y centrifugamos durante 10 minutos. Ahora he centrifugado nuestro sobrenadante que contiene restos de células huésped, así como las bacterias purificadas. Lo hice a 2.500 ×g durante 10 minutos.

Y como puede observarse, tengo un precipitado en el fondo de mi tubo que consiste en restos celulares. Mis bacterias recién liberadas aún se encuentran en el sobrenadante porque la centrifugación no fue lo suficientemente fuerte como para precipitarlas también. Por lo tanto, lo siguiente que haré será retirar el sobrenadante y filtrarlo a través de un filtro de cinco micrones.

Entonces, este es un filtro de cinco micrones y se adapta a cualquier tipo de jeringa. Voy a usar una jeringa de 30 ml, pero simplemente se tira del émbolo hacia arriba y, sin tocar el filtro propiamente dicho, especialmente la parte inferior aquí, que debe permanecer estéril, se une la jeringa al filtro enroscándola, y luego se presiona suavemente el émbolo para hacer pasar el sobrenadante a través del filtro y hacia nuestro tubo.

No debe presionar demasiado porque podría romper el filtro y dejará de funcionar. Si llega al punto en que tiene que aplicar mucha presión, debe retirar el filtro y reemplazarlo, ya que eso indica que está obstruido con muchos restos celulares. Y en este momento, lo que normalmente hacemos, dependiendo de nuestro volumen y como otro método adicional para obtener un cultivo bacteriano muy puro, es añadir 250 milimolares de solución de sacarosa, esterilizada por filtración, al tubo de la centrífuga de alta velocidad.

Llene la botella hasta aproximadamente al menos un 80 % de su capacidad. Normalmente la llenamos hasta el cuello. Estos tubos deben estar tan llenos para que no implosionen dentro de nuestra centrífuga de alta velocidad.

Vale, ahora vamos a centrifugar nuestro sobrenadante y concentrar nuestras bacterias purificadas a 18.000 ×g en esta centrífuga de alta velocidad. Asegurémonos de colocar nuestros tubos equilibrados, por supuesto, y luego la cerramos. La configuraremos durante 10 minutos.

Y nos gusta realizar este proceso a 10 grados Celsius o menos, temperatura que está ajustada aquí. Luego, nuestra velocidad angular para este rotor específico en la centrífuga es de 12,5 revoluciones por minuto. Disponemos de una tabla de conversión, por lo que girará a aproximadamente 18.670 veces G. Ahora hemos realizado la centrifugación de alta velocidad para sedimentar nuestras bacterias purificadas.

Ahora, como pueden ver, tenemos un buen pellet bacteriano en el fondo de nuestro tubo de alta velocidad. Así que ahora lo que haremos es retirar toda la SUP natin en un recipiente para desechos líquidos. Entonces, lo que necesitamos hacer en este momento es resuspender nuestras bacterias.

Voy a resuspenderlo en dos mililitros de nuestro medio de cultivo, que es el medio para insectos de Schneider, suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10%. Y simplemente resuspenderé el precipitado pipeteando hacia arriba y hacia abajo hasta que todas las bacterias vuelvan a estar en solución. Ahora que nuestras bacterias están nuevamente en suspensión, realizaremos un paso adicional de purificación solo para eliminar cualquier resto posible de células huésped.

Para esto, vamos a utilizar un filtro de 2,7 micrones. Lo que me gusta hacer es usar la carcasa de plástico de nuestro filtro de cinco micrones como soporte. Así podemos tomar nuestra solución, atornillar la jeringa al filtro de 2,7 micrones y ahora filtraremos dentro de un tubo para almacenamiento a largo plazo.

Al igual que con el otro filtro, simplemente presione suavemente el émbolo. Y ahora tenemos nuestra solución de bacterias purificadas. A continuación, voy a mostrarle cómo determinamos la viabilidad.

Utilizamos el kit de viabilidad bacteriana en vivo/muerto con retroiluminación de Molecular Probes. Este kit incluye dos colorantes: yoduro de propidio y citonina. El yoduro de propidio fluoresce en rojo y tiñe únicamente las bacterias que presentan una membrana bacteriana que no está completamente intacta, mientras que la citonina tiñe todas las bacterias.

Entonces, cuando se observan estas bacterias bajo el microscopio equipado con óptica de fluorescencia, todas las bacterias fluorescerán en verde, mientras que un subconjunto, aquellas que están muertas, fluorescerán en rojo. Tomamos una pequeña alícuota de nuestra muestra purificada y, en este caso, voy a tomar solo 10 microlitros, lo justo para preparar un portaobjetos. Y voy a dispensarla en otros dos.

Luego, voy a agregar nuestras otras dos coloraciones, solo un microlitro de la mezcla de yoduro de propidio y citocromo ala suspensión bacteriana. Después, puede dejar que incube en la oscuridad durante 15 minutos. Sin embargo, hemos encontrado que en realidad puede proceder a montarlo y observarlo casi inmediatamente para ver sus resultados.

Vale, ahora voy a observar al microscopio mi preparación que contiene la tinción bacteriana con la tinción de viabilidad con luz traslucida. Voy a depositarla sobre mi portaobjetos, colocaré una cubreobjetos y luego observaré. Voy a utilizar nuestro filtro mixto rojo-verde para poder evaluar la viabilidad de mis bacterias.

Entonces, cuando abro el obturador, veo mis bacterias, que son más o menos como pequeños puntos. Pero aquí observo que aproximadamente entre el 90 y el 95 % de las bacterias son verdes, mientras que solo alrededor del 5 % son rojas. Por lo tanto, tenemos una tasa de viabilidad muy alta, ¿verdad?

Así que acabo de mostrarles el proceso de purificación de Akia viable a partir de células de insecto en cultivo. Este protocolo incluyó la ruptura física de las células huésped eucariotas y luego una centrifugación diferencial para aislar las bacterias purificadas, así como una serie de pasos de filtración para garantizar la calidad de las bacterias purificadas y eliminar completamente todos los componentes de las células huésped. Luego, describimos el ensayo de viabilidad mediante tinción diferencial de células vivas y muertas, que utiliza dos colorantes para evaluar la viabilidad de las bacterias.

Y puede utilizar, ahora, sus bacterias purificadas en una variedad de aplicaciones, incluyendo la infección de otros sistemas de células cultivadas para aumentar la infección de un sistema específico. También puede realizar estudios metabólicos u otros numerosos estudios utilizando sus bacterias purificadas vivas.