Name: Alimentador de Libre adaptación, Cultura y pases de células iPS humanas con alimentador de Libre Completa golpe de gracia suero sustitución Media (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprende a adaptar y mantener células iPS humanas en cultivo libre de alimentador usando medio KSR-FF completo. Este método mejora la consistencia y eficiencia en la investigación con células madre pluripotentes.

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Nota: Para mantener condiciones estériles cultura, todos los procedimientos descritos en este protocolo se realiza mediante prácticas de laboratorio y estériles a cabo bajo una campana de flujo laminar. Antes de comenzar, asegúrese de que cualquier medio es equilibrado a 37 ° C y adecuadamente el gas. Preparación Geltrex recubierto placas de cultivo Nota: véase el apéndice para el uso de platos de la cultura CELLstart recubierto <ol><li> Descongelar un tubo de Geltrex (1 mL) lentamente a 2-8 º C y se diluye 1:100 en 99 ml de golpe de gracia D-MEM/F-12. Mezcle la solución suavemente. Nota: Algunas líneas de células iPS pueden requerir una dilución diferente Geltrex para un crecimiento óptimo. Véase el apéndice para las diluciones alternativa. </li><li> Cubrir toda la superficie de cada placa de cultivo con la solución Geltrex (1 ml por un plato de 35 mm, 1,5 ml de un plato de 60 mm). </li><li> Sello de cada plato con Parafilm para evitar la sequedad y se incuban las placas durante 1 hora a 37 ° C. Nota: En este punto usted puede almacenar las placas de cultivo Geltrex recubierto a 4 ° C durante un máximo de un mes. Sello de cada plato con Parafilm para evitar la Geltrex se seque. </li><li> Antes de usar, la transferencia de los platos Geltrex recubierto con una campana de flujo laminar y permitir que alcancen la temperatura ambiente (alrededor de 1 hora). </li></ol> Preparación del alimentador de Libre Completo SR golpe de gracia Media <ol><li> Para preparar 1 ml de 10 mg / ml de solución FGF básico, asépticamente mezclar los componentes enumerados a continuación. Alícuota de la solución y almacenar a -20 ° C hasta por 6 meses. <table border="0"><tbody><tr><td> FGF básico </td><td> 10 mg </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 990 l </td></tr><tr><td> 10% de BSA </td><td> 10 l </td></tr></tbody></table> Nota: BSA se puede sustituir con HSA o SR golpe de gracia a la misma concentración. </li><li> Para preparar 50 ml de solución de 2 Dispasa mg / ml, asépticamente mezclar los componentes enumerados a continuación. Filtro de esterilización de la solución y se almacenan a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas. <table border="0"><tbody><tr><td> Dispasa </td><td> 100 mg </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 50 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Para preparar 100 mL de SR anulación completa del alimentador-Free (KSR-FF) medio asépticamente combinar los componentes que figuran en la tabla de abajo. <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Concentración de la </td><td> La concentración final </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> Nocaut DMEM/F12 (cat. n °. 12660-012) </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76.8 mL </td></tr><tr><td> Glutamax-I (Cat. N º 35.050-061) </td><td> 200 mM </td><td> 2 mM </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> SR golpe de gracia (art. no. 10.828-028) </td><td> - </td><td> 20% </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Golpe de gracia SR-GFC (cat. n °. A10580-01) </td><td> 50 veces </td><td> 1X </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> bFGF (Cat. no. PHG0024) </td><td> 10 mg / ml </td><td> 20 ng / mL </td><td> 200 l </td></tr></tbody></table> Puede almacenar el medio KSR-FF a 2-8 º C durante un máximo de una semana. </li><li> Justo antes de pre-equilibrar el medio completo a la temperatura y gases, añadir asépticamente el volumen requerido de 2-mercaptoetanol (55 mM de concentración) para una concentración de 0,1 mM final. Por ejemplo, para preparar 100 ml de KSR-FF medio añadir 182 l de 55 mM 2-mercaptoetanol (1:550 dilución) Por otra parte, el 2-mercaptoetanol puede ser añadido al medio 1X completaron y se almacenaron a 2-8 ° C para hasta una semana. </li></ol> La adaptación a CMPi KSR-FF Medio <ol><li> Antes de comenzar, pre-equilibrar sus platos Geltrex revestido a temperatura ambiente en el capó. </li><li> La cultura de la CMPi en células alimentadoras MEF hasta que el 70-80% confluente. Por favor, consulte el manual GIBCO de fibroblastos de ratón embrionario para los protocolos de la cultura basada en el MEF. </li> Pre-caliente el volumen necesario de Dispasa en un baño de agua a 37 ° C. Consulte la Tabla 1 a continuación para obtener información sobre los volúmenes requeridos. <li> Pre-equilibrar el volumen requerido de KSR-FF en un baño de agua 37 ° C for15 min. Consulte la Tabla 1 a continuación para obtener información sobre los volúmenes requeridos. </li><li> Aspirar el medio de las placas de cultivo, y añadir una cantidad apropiada de solución Dispasa. Incubar las placas a 37 ° C durante 3-5 minutos. </li><li> Aspirar la solución Dispasa de cada recipiente de cultivo y lavar las células alimentadoras MEF suavemente con D-PBS (2 a 3 veces). </li><li> Añadir una cantidad apropiada de medio completo SR golpe de gracia a cada recipiente de cultivo. Use un raspador celular o una pipeta de 5 ml para raspar suavemente las células de la superficie del recipiente de cultivo. Nota: véase el apéndice para los protocolos de adaptación alternativa para las líneas celulares duro para adaptarse iPS, </li><li> Recoger la suspensión de células de cada placa de cultivo en distintos tubos de 15 ml cónicos. Enjuague cada recipiente de cultivo con una cantidad apropiada de medio completo SR golpe de gracia, y añadir el D-PBS enjuague medio en los tubos de 15 ml cónicos que contengan la suspensión celular. Tenga cuidado de no romper los cúmulos de células en células individuales </li><li> Centrífuga de 15 ml en tubos cónicos de 200 xg durante 5 minutos para que sedimenten las CMPi. </li><li> Aspirar el sobrenadante del precipitado de IPSC. Resuspender el precipitado en una cantidad adecuada de KSR-FF medio de acuerdo con la relación de división (tabla 1). No romper los grumos de células de un tamaño más pequeño, porque las matas más pequeñas no se adhieren bien a la superficie. Nota: Se recomienda una relación de división de 1:2 para los 3 primeros pasos después de la CMPi han pasajes directamente desde el medio de cultivo iPSC MEF para KSR-FF medio. Normalmente, una relación de separación 01:03-01:05 es apropiado, pero los pases en 01:02 garantiza la mayor densidad de células necesarias para la adaptación de una cultura de enlace de forma gratuita. </li><li> Antes de la chapa en los platos CMPi Geltrex recubierto, aspirar residual solución Geltrex del plato pre-revestidos, y se añade lentamente una cantidad apropiada de la suspensión celular a cada plato de cultivo. Nota: No enjuague los platos antes de la galvanoplastia. </li><li> Mover el plato de la cultura de ida y vuelta y de lado a lado varias veces para dispersar las células en la superficie del plato. Con cuidado, coloque la placa de cultivo en una incubadora a 37 ° C con una atmósfera húmeda de CO 4 al 6% 2 en el aire. Sustituya el medio pasó con KSR-FF todos los días. </li></ol> Pases células iPS humanas con KSR-FF <ol start="13"><li> Tenga en cuenta las CMPi humanos crecen en completa KSR-FF bajo el microscopio para confirmar que las células son del 70-80% confluentes y listo para ser subcultivaron. Refiérase a la Figura 1. Nota: Si las colonias es muy densa o demasiado grande, mayor diferenciación se produce. </li><li> Cortar y eliminar cualquier colonias iPSC diferenciadas antes de pases de la cultura. </li><li> Pre-caliente el volumen necesario de Dispasa en un baño de agua a 37 ° C. Consulte la Tabla 1 a continuación para obtener información sobre los volúmenes requeridos. </li><li> Pre-equilibrar el volumen requerido de KSR-FF en un baño de agua 37 ° C for15 min. Consulte la Tabla 1 a continuación para obtener información sobre los volúmenes requeridos. </li><li> Aspirar el medio transcurrido desde el recipiente de cultivo con una pipeta, y aclarar las células dos veces con D-PBS. </li><li> Suavemente agregar precalentado Dispasa solución al recipiente de cultivo (por ejemplo, 1 ml de solución Dispasa por placa de cultivo de 60 mm). Agitar el recipiente de cultivo para cubrir la superficie entera de la célula. </li><li> Incubar el recipiente de cultivo a 37 ° C durante 3 minutos. </li><li> Retire el vaso de la incubadora, se aspira la solución Dispasa, y lavar suavemente las células con D-PBS. </li><li> Raspe suavemente las células de la superficie de la placa de cultivo con un rascador de células, y la transferencia de las células a un tubo de centrífuga de 15 ml estéril. </li><li> Enjuague la placa de cultivo en dos ocasiones con KSR-FF, con suavidad "pulverización de" cualquier célula que no se han desprendido. La piscina del enjuague medio con las células en el tubo de 15 ml. </li><li> Centrifugar el tubo a 200 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente para precipitar las células. </li><li> Con cuidado, aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento celular y lo descarta. </li><li> Agitar suavemente el tubo para desalojar completamente el pellet de células de la parte inferior del tubo. </li><li> Resuspenda suavemente las células pre-equilibrio KSR-FF con una pipeta serológica de 5 ml. No triturar. Nota: es fundamental en el paso para volver a suspender suavemente las células sin usar la fuerza para evitar daños. </li><li> Transferencia de las células a un nuevo máximo de 60 mm Geltrex recubiertos plato en la relación de división que desee y mover la placa de cultivo de ida y vuelta y de lado a lado varias veces para dispersar las células a través de su superficie. </li><li> Coloque el plato de cultivo en una incubadora a 37 ° C con una atmósfera húmeda de4 a 6% de CO 2 en el aire. </li><li> Al día siguiente, reemplazar el cuidado medio gastado con KSR-FF para eliminar los restos celulares. Vuelva a colocar el medio gastado todos los días a partir de entonces. Observar las células iPS diario y el paso cuando sea necesario (aproximadamente cada 4-5 días). Pases se recomienda cuando las células alcanzan el 70-80% de confluencia. Para la criopreservación de células iPS y deshielo, se refieren a nuestro protocolo titulado "criopreservación y recuperación de células iPS humanas con alimentador de Libre Completa golpe de gracia suero sustitución Medio". </li></ol> Resultados esperados <img src="/files/ftp_upload/2236/2236fig1.jpg" alt="Cultivo celular bajo microscopio; estudio del crecimiento celular; imágenes de microscopía; investigación biológica." data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. La imagen de contraste de fase muestra CMPi cultivadas en placas de cultivo Geltrex recubiertos con alimentador de Libre completa golpe de gracia en suero de sustitución medio. La exposición CMPi morfología similar a hESCs, que se caracteriza por núcleos grandes y escaso citoplasma. (40 aumentos) <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> 35 mm del plato </td><td> Plato de 60mm </td><td> Plato de 100 mm </td></tr><tr valign="top"><td> Completa golpe de gracia SR medio </td><td> 2 mL </td><td> 4 ml </td><td> 10 ml </td></tr><tr valign="top"><td> Geltrex Solución </td><td> 1 mL </td><td> 1,5 ml </td><td> 4.5 mL </td></tr><tr valign="top"><td> Dispasa </td><td> 0,5 ml </td><td> 1 mL </td><td> 3.4 mL </td></tr><tr valign="top"><td> D-PBS para enjuagar </td><td> 2 mL </td><td> 4 ml </td><td> 10 ml </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Los volúmenes recomendados <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2236/2236appendix.pdf">Por favor, haga clic aquí para ver el apéndice</a> .

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li>
<li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnli%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 knockout</td><td></td><td>N.º de cat. 12660-012</td><td>Nota: véase el apéndice para el uso de productos alternativos de DMEM</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td></td><td>N.º de cat. 35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Sustituto de suero KnockOut</td><td></td><td>KnockOut SR, n.º de cat. 10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de factores de crecimiento de sustituto sérico KnockOut</td><td></td><td>KnockOut SR-GFC, n.º de cat. A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-básico, proteína recombinante humana, 10 &amp;mu;g</td><td></td><td>bFGF, n.º de cat. PHG0024</td><td>Nota: véase el apéndice para tamaños de empaque alternativos de bFGF.</td></tr><tr><td>2-Mercapto&amp;#8211;etanol</td><td></td><td>N.º de cat. 21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td></td><td>N.º de cat. 17105-041</td><td>Nota: véase el apéndice para métodos alternativos de pase.</td></tr><tr><td>Matriz de la membrana basal con factores de crecimiento reducidos, calificada para hESC Geltrex, 1 mL</td><td></td><td>Cat. n.º A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Solución salina tamponada con fosfato (D-PBS) sin calcio ni magnesio </td><td></td><td>N.º de cat. 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Cabina de cultivo de tejidos estéril</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora ajustada a 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta-Aid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua ajustado a 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas estériles (5 mL, 10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de centrífuga de 15 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos tratadas de 60 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

alimentador de libre adaptación, cultura y pases de células ips humanas con alimentador de libre completa golpe de gracia suero sustitución media

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

El descubrimiento en 2006 de que los fibroblastos humanos y de ratón podría ser reprogramado para generar células iPS de 1-3 con cualidades muy similares a las células madre embrionarias ha creado una nueva y valiosa fuente de células pluripotentes para el descubrimiento de fármacos, la terapia celular y la investigación básica. Los medios de comunicación GIBCO y reactivos han estado a la vanguardia de la investigación de células madre pluripotentes de años. Nocaut DMEM suplementado con suero de reemplazo golpe de gracia es el medio de elección para el crecimiento de células madre embrionarias, y ahora el cultivo de células iPS 3-9. Este estándar de oro del sistema de medios ahora se puede utilizar para alimentación libre de la cultura con la adición de cóctel golpe de gracia SR factor de crecimiento. ES humanas tradicionales y los métodos de cultivo de células iPS requieren el uso de ratón o humano capas de fibroblastos de alimentación o el alimentador de medio condicionado. Estos métodos de cultivo son mano de obra, difícil de escalar y que es difícil mantener las células indiferenciadas caderas debido a las condiciones indefinido. Invitrogen ha desarrollado SR golpe de gracia crecimiento Cocktail factor que le permite fácilmente la transición de su cadera para cultivos de células de alimentación libre, manteniendo el uso de SR golpe de gracia.

El siguiente protocolo proporciona instrucciones para la adaptación humana células madre pluripotentes inducidas (iPS) celdas para alimentación libre de la cultura a través del alimentador de Libre completa golpe de gracia suero sustitución medio (KSR-FF). Una vez adaptado, instrucciones para el mantenimiento continuo también se proporcionan.

Alimentador de Libre adaptación, Cultura y pases de células iPS humanas con alimentador de Libre Completa golpe de gracia suero sustitución Media

El descubrimiento en 2006 de que los fibroblastos humanos y de ratón podían reprogramarse para generar células iPS 1-3 con cualidades notablemente similares a las de las células madre embrionarias...

El objetivo general de este procedimiento es adaptar y mantener células madre pluripotentes inducidas humanas en cultivo libre de alimentadores utilizando medio libre de alimentadores con reemplazo completo de suero knockout. Esto se logra primero preparando placas recubiertas con gelt, TRX o cell start. El segundo paso del procedimiento consiste en pasar sus IPS desde MEFs a medio libre de alimentadores utilizando espacio de disco.El paso final del procedimiento consiste en mantener continuamente sus células IPS sin uso de alimentadoras. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran un crecimiento celular y pluripotencia similares a los observados en cultivos con metilo, mediante tinción inmunológica con marcadores pluripotentes. Hola, soy Kate Wagner en el sitio de GIB co en Life Technologies.La principal ventaja de esta técnica frente a las técnicas existentes es que puede ahorrar tiempo y aumentar la consistencia en su cultivo celular cuando utiliza el reemplazo de suero knockout en todo su flujo de trabajo. Hoy en día, la familia de productos knockout incluye una lista completa de medios y reactivos para condiciones con alimentadores, sin alimentadores y libres de xeno para células madre embrionarias humanas, células madre embrionarias de ratón y células madre pluripotentes inducidas. El KSR puede utilizarse para la obtención, el crecimiento, la expansión, la criopreservación y los pasos iniciales de la diferenciación.El siguiente video le mostrará cómo adaptar y envasar sus células utilizando KSR en condiciones libres de células alimentadoras. Se requieren platos de cultivo recubiertos con Gel TRX para adaptar y envasar células madre pluripotentes inducidas humanas en condiciones libres de células alimentadoras. Un día antes de la preparación de estos platos recubiertos, descongele lentamente un tubo de gelt TRX dejándolo en el refrigerador durante toda la noche. Al día siguiente, diluya el tubo de gelt TRX descongelado uno a 100 en medio basal, transfiriendo un mililitro de gel Rex a un frasco que contiene 99 mililitros de medio basal. Mezcle suavemente la solución.Recomendamos usar D-M-E-M-F 12 sin suero como medio basal, pero consulte el texto del protocolo para otras opciones. Cubra toda la superficie de cada placa de cultivo con la solución de gel Rex. Para cada placa de 60 milímetros, agregue 1.5 mililitros de la solución de gel trek.Incube las placas durante una hora a 37 grados Celsius. Las placas adicionales pueden envolverse en parafilm y almacenarse en el refrigerador durante hasta cuatro semanas. Puede distribuirse y almacenarse gelt TRX adicional diluido a entre menos 20 y menos 80 grados Celsius, pero deben evitarse múltiples ciclos de congelación y descongelación antes de su uso.Transfiera las placas recubiertas con gelt TRX a una cabina de flujo laminar o cabina de seguridad biológica y déjelas equilibrar a temperatura ambiente. Además, prepare todos los demás reactivos necesarios y asegúrese de que todos los medios estén equilibrados a 37 grados Celsius y adecuadamente aireados. Para adaptar los IPC humanos al medio libre de alimentadores Primera cultura.Las CIPi están sobre células alimentadoras de metotrexato hasta que alcancen una confluencia del 70 al 80 %. Aspire el medio de cada placa de cultivo de 60 milímetros y agregue una cantidad adecuada de solución de dispa, que es un mililitro. En este caso, incube las placas a 37 grados Celsius durante tres a cinco minutos.Aspire la solución de dispa de cada placa de cultivo y lave suavemente las células alimentadoras con DPBS de dos a tres veces. A continuación, añada una cantidad adecuada de medio con reemplazo sérico completo a cada placa de cultivo. Utilizando un raspador celular, desprenda suavemente las células de la superficie de la placa.Recoger la suspensión celular de cada placa en tubos cónicos separados de 15 mililitros. Enjuagar cada placa de cultivo con una cantidad adecuada de medio completo con sustituto de suero y añadir el medio de enjuague a los tubos cónicos de 15 mililitros que contienen la suspensión celular. Centrifugar los tubos cónicos de 15 mililitros a 200 ×g durante cinco minutos a temperatura ambiente para obtener el sedimento celular.Después de la centrifugación, aspire y deseche cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el botón celular. Agite suavemente el tubo para desalojar completamente el botón celular del fondo del tubo. Añada una cantidad adecuada de medio completo con reemplazo sérico, libre de células alimentadoras, según la relación de división deseada.Y resuspenda suavemente el sedimento. No desintegre los agregados celulares en fragmentos más pequeños, ya que los agregados más pequeños no se adhieren bien a la superficie. Aspire cualquier solución residual de gel TRE de las placas de cultivo recubiertas con gel Rex previamente preparadas y agregue lentamente una cantidad adecuada de suspensión celular a cada placa de cultivo. Mueva la placa de cultivo hacia adelante y hacia atrás, y de lado a lado varias veces para dispersar las células a través de la superficie de la placa. Coloque suavemente las placas de cultivo en un incubador a 37 grados Celsius con una atmósfera humedecida de 4 a 6% CO₂ en aire. Reemplace el medio gastado diariamente a partir de entonces hasta que las células alcancen aproximadamente una confluencia del 70 al 80%.Cuando las células madre pluripotentes inducidas por humanos que crecen en un medio sin suero completo y sin alimentador alcancen una confluencia del 70 al 80 %, estarán listas para ser subcultivadas. Si hay células diferenciadas, elimínelas antes del envasado. Aspire el medio gastado del recipiente de cultivo de 60 milímetros utilizando una pipeta y enjuague las células dos veces.Con DPBS, agregue suavemente un mililitro de solución precalentada basada en disco a la placa de cultivo. Agite la placa de cultivo para recubrir toda la superficie celular. Incube el cultivo a 37 grados Celsius durante tres a cinco minutos.A continuación, aspire la solución del espacio de dis y lave suavemente las células dos veces con DPBS, agregue medio completo con reemplazo de suero, libre de células alimentadoras, y desprenda suavemente las células de la superficie del recipiente de cultivo. Utilizando un raspador de células, transfiera las células a un tubo cónico estéril de 15 mililitros. Enjuague el recipiente de cultivo dos veces con medio completo con reemplazo de suero.Aplicar suavemente medio libre de alimentadores para eliminar cualquier célula que no se haya desprendido. Recoger el medio de ambos lavados con las células en el tubo de 15 mililitros. Centrifugar el tubo a 200 G durante cinco minutos a temperatura ambiente para obtener un sedimento celular sin perturbar el botón celular.Aspire con cuidado y deseche el sobrenadante. Agite suavemente el tubo para desalojar completamente el botón celular del fondo del tubo. Re suspenda suavemente las células en reemplazo completo de suero.Medio libre de alimentadores utilizando una pipeta serológica de cinco mililitros. No realizar tritración. Transfiera las células a una placa fresca de 60 milímetros recubierta con gelt TRX en la proporción de división deseada.Mueva el plato de cultivo hacia adelante y hacia atrás, y de lado a lado varias veces para dispersar las células a lo largo de su superficie. Coloque el plato de cultivo en una incubadora a 37 grados Celsius con una atmósfera humedecida de cuatro a 6% de dióxido de carbono en aire al día siguiente. Reemplace suavemente el medio gastado con reemplazo completo de suero.Alimente con medio libre de suero para eliminar los restos celulares. Reemplace el medio gastado cada día a partir de entonces. Esta imagen de contraste de fase muestra células madre pluripotentes inducidas humanas cultivadas en placas de cultivo recubiertas con gelt TRX, utilizando medio completo de reemplazo de suero, libre de células alimentadoras.La morfología de los IPC es similar a la de las células madre embrionarias humanas, caracterizándose por núcleos grandes y citoplasma escaso. La tinción inmunohistoquímica muestra que los IPC cultivados en medio con reemplazo sérico knockout más un cóctel de factores de crecimiento expresan los marcadores de pluripotencia OCT4 y SSEA4. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo adaptar y mantener tus IPC en condiciones libres de suero knockout y sin capa alimentadora. Eso es todo.Gracias por vernos y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Biology

Biología

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La caracterización regular de las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), para determinar el mantenimiento de su estado pluripotente, es un paso importante antes de que estas células se utilicen para otras aplicaciones. En este trabajo describimos un método para la propagación a pequeña escala de iPSCs humanas diseñado específicamente para permitir su caracterización fácil y rutinaria a través de inmunocitoquímica.

Propagación de pequeña escala de iPSCs humano en condiciones sin suero para la caracterización inmunocitoquímica de rutina

La producción de células especializadas de la retina de células madre pluripotentes es un punto de inflexión en el desarrollo de la terapia basada en células madre para enfermedades de la retina. El presente trabajo describe un método sencillo para una generación eficiente de organoides de retina y epitelio pigmentado retiniano para investigación básica, traslacional y clínica.

Alimentador-libre las condiciones de cultivo para la generación de humanos derivados de iPSC de modelos de celulares de retina y definido sin Xeno

Presentamos aquí un protocolo para la diferenciación de células madre humanas pluripotentes inducidas en cada derivado del somite (miotoma sclerotome, dermatoma y syndetome) en condiciones químicamente definidas, que tiene aplicaciones en modelos futuros de la enfermedad y terapias basadas en células en cirugía ortopédica.

En la generación de Vitro del Somite derivados humanos inducida por células madre pluripotentes

Para evitar las limitaciones asociadas con el paso enzimático o mecánico de células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) cultivadas en células alimentadoras, hemos establecido un método rápido, efectivo, rentable y de alto rendimiento para recolectar colonias de hESC o hiPSC mantenidas en una capa de células alimentadoras de fibroblastos del prepucio humano utilizando la desadhesión mediada por EDTA.

Pase rápido, rentable y sin enzimas de células madre pluripotentes humanas a células alimentadoras mediante desadhesión mediada por ácido etilendiaminotetraacético

Aquí, presentamos un método para diferenciar y expandir las células asesinas naturales que expresan el receptor de antígeno quimérico (CAR) derivado de iPSC humano con una matanza mejorada contra varias neoplasias malignas. Este protocolo demuestra la diferenciación y expansión de células CAR-NK derivadas de iPSC optimizadas para asesinos naturales (NK) y la medición de la actividad antitumoral frente a varias líneas celulares tumorales.

Avances en células asesinas naturales que expresan receptores de antígenos quiméricos derivados de células madre pluripotentes humanas

Aprende a adaptar y mantener células iPS humanas en cultivo libre de alimentador usando medio KSR-FF completo. Este método mejora la consistencia y eficiencia en la investigación con células madre pluripotentes.

Alimentador de Libre adaptación, Cultura y pases de células iPS humanas con alimentador de Libre Completa golpe de gracia suero sustitución Media (Video) | JoVE Journal

Alimentador de Libre adaptación, Cultura y pases de células iPS humanas con alimentador de Libre Completa golpe de gracia suero sustitución Media

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