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El objetivo general de este procedimiento es adaptar y mantener células madre pluripotentes inducidas humanas en cultivo libre de alimentadores utilizando medio libre de alimentadores con reemplazo completo de suero knockout. Esto se logra primero preparando placas recubiertas con gelt, TRX o cell start. El segundo paso del procedimiento consiste en pasar sus IPS desde MEFs a medio libre de alimentadores utilizando espacio de disco.

El paso final del procedimiento consiste en mantener continuamente sus células IPS sin uso de alimentadoras. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran un crecimiento celular y pluripotencia similares a los observados en cultivos con metilo, mediante tinción inmunológica con marcadores pluripotentes. Hola, soy Kate Wagner en el sitio de GIB co en Life Technologies.

La principal ventaja de esta técnica frente a las técnicas existentes es que puede ahorrar tiempo y aumentar la consistencia en su cultivo celular cuando utiliza el reemplazo de suero knockout en todo su flujo de trabajo. Hoy en día, la familia de productos knockout incluye una lista completa de medios y reactivos para condiciones con alimentadores, sin alimentadores y libres de xeno para células madre embrionarias humanas, células madre embrionarias de ratón y células madre pluripotentes inducidas. El KSR puede utilizarse para la obtención, el crecimiento, la expansión, la criopreservación y los pasos iniciales de la diferenciación.

El siguiente video le mostrará cómo adaptar y envasar sus células utilizando KSR en condiciones libres de células alimentadoras. Se requieren platos de cultivo recubiertos con Gel TRX para adaptar y envasar células madre pluripotentes inducidas humanas en condiciones libres de células alimentadoras. Un día antes de la preparación de estos platos recubiertos, descongele lentamente un tubo de gelt TRX dejándolo en el refrigerador durante toda la noche. Al día siguiente, diluya el tubo de gelt TRX descongelado uno a 100 en medio basal, transfiriendo un mililitro de gel Rex a un frasco que contiene 99 mililitros de medio basal. Mezcle suavemente la solución.

Recomendamos usar D-M-E-M-F 12 sin suero como medio basal, pero consulte el texto del protocolo para otras opciones. Cubra toda la superficie de cada placa de cultivo con la solución de gel Rex. Para cada placa de 60 milímetros, agregue 1.5 mililitros de la solución de gel trek.

Incube las placas durante una hora a 37 grados Celsius. Las placas adicionales pueden envolverse en parafilm y almacenarse en el refrigerador durante hasta cuatro semanas. Puede distribuirse y almacenarse gelt TRX adicional diluido a entre menos 20 y menos 80 grados Celsius, pero deben evitarse múltiples ciclos de congelación y descongelación antes de su uso.

Transfiera las placas recubiertas con gelt TRX a una cabina de flujo laminar o cabina de seguridad biológica y déjelas equilibrar a temperatura ambiente. Además, prepare todos los demás reactivos necesarios y asegúrese de que todos los medios estén equilibrados a 37 grados Celsius y adecuadamente aireados. Para adaptar los IPC humanos al medio libre de alimentadores Primera cultura.

Las CIPi están sobre células alimentadoras de metotrexato hasta que alcancen una confluencia del 70 al 80 %. Aspire el medio de cada placa de cultivo de 60 milímetros y agregue una cantidad adecuada de solución de dispa, que es un mililitro. En este caso, incube las placas a 37 grados Celsius durante tres a cinco minutos.

Aspire la solución de dispa de cada placa de cultivo y lave suavemente las células alimentadoras con DPBS de dos a tres veces. A continuación, añada una cantidad adecuada de medio con reemplazo sérico completo a cada placa de cultivo. Utilizando un raspador celular, desprenda suavemente las células de la superficie de la placa.

Recoger la suspensión celular de cada placa en tubos cónicos separados de 15 mililitros. Enjuagar cada placa de cultivo con una cantidad adecuada de medio completo con sustituto de suero y añadir el medio de enjuague a los tubos cónicos de 15 mililitros que contienen la suspensión celular. Centrifugar los tubos cónicos de 15 mililitros a 200 ×g durante cinco minutos a temperatura ambiente para obtener el sedimento celular.

Después de la centrifugación, aspire y deseche cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el botón celular. Agite suavemente el tubo para desalojar completamente el botón celular del fondo del tubo. Añada una cantidad adecuada de medio completo con reemplazo sérico, libre de células alimentadoras, según la relación de división deseada.

Y resuspenda suavemente el sedimento. No desintegre los agregados celulares en fragmentos más pequeños, ya que los agregados más pequeños no se adhieren bien a la superficie. Aspire cualquier solución residual de gel TRE de las placas de cultivo recubiertas con gel Rex previamente preparadas y agregue lentamente una cantidad adecuada de suspensión celular a cada placa de cultivo.

Mueva la placa de cultivo hacia adelante y hacia atrás, y de lado a lado varias veces para dispersar las células a través de la superficie de la placa. Coloque suavemente las placas de cultivo en un incubador a 37 grados Celsius con una atmósfera humedecida de 4 a 6% CO₂ en aire. Reemplace el medio gastado diariamente a partir de entonces hasta que las células alcancen aproximadamente una confluencia del 70 al 80%.

Cuando las células madre pluripotentes inducidas por humanos que crecen en un medio sin suero completo y sin alimentador alcancen una confluencia del 70 al 80 %, estarán listas para ser subcultivadas. Si hay células diferenciadas, elimínelas antes del envasado. Aspire el medio gastado del recipiente de cultivo de 60 milímetros utilizando una pipeta y enjuague las células dos veces.

Con DPBS, agregue suavemente un mililitro de solución precalentada basada en disco a la placa de cultivo. Agite la placa de cultivo para recubrir toda la superficie celular. Incube el cultivo a 37 grados Celsius durante tres a cinco minutos.

A continuación, aspire la solución del espacio de dis y lave suavemente las células dos veces con DPBS, agregue medio completo con reemplazo de suero, libre de células alimentadoras, y desprenda suavemente las células de la superficie del recipiente de cultivo. Utilizando un raspador de células, transfiera las células a un tubo cónico estéril de 15 mililitros. Enjuague el recipiente de cultivo dos veces con medio completo con reemplazo de suero.

Aplicar suavemente medio libre de alimentadores para eliminar cualquier célula que no se haya desprendido. Recoger el medio de ambos lavados con las células en el tubo de 15 mililitros. Centrifugar el tubo a 200 G durante cinco minutos a temperatura ambiente para obtener un sedimento celular sin perturbar el botón celular.

Aspire con cuidado y deseche el sobrenadante. Agite suavemente el tubo para desalojar completamente el botón celular del fondo del tubo. Re suspenda suavemente las células en reemplazo completo de suero.

Medio libre de alimentadores utilizando una pipeta serológica de cinco mililitros. No realizar tritración. Transfiera las células a una placa fresca de 60 milímetros recubierta con gelt TRX en la proporción de división deseada.

Mueva el plato de cultivo hacia adelante y hacia atrás, y de lado a lado varias veces para dispersar las células a lo largo de su superficie. Coloque el plato de cultivo en una incubadora a 37 grados Celsius con una atmósfera humedecida de cuatro a 6% de dióxido de carbono en aire al día siguiente. Reemplace suavemente el medio gastado con reemplazo completo de suero.

Alimente con medio libre de suero para eliminar los restos celulares. Reemplace el medio gastado cada día a partir de entonces. Esta imagen de contraste de fase muestra células madre pluripotentes inducidas humanas cultivadas en placas de cultivo recubiertas con gelt TRX, utilizando medio completo de reemplazo de suero, libre de células alimentadoras.

La morfología de los IPC es similar a la de las células madre embrionarias humanas, caracterizándose por núcleos grandes y citoplasma escaso. La tinción inmunohistoquímica muestra que los IPC cultivados en medio con reemplazo sérico knockout más un cóctel de factores de crecimiento expresan los marcadores de pluripotencia OCT4 y SSEA4. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo adaptar y mantener tus IPC en condiciones libres de suero knockout y sin capa alimentadora. Eso es todo.

Gracias por vernos y buena suerte con sus experimentos.