Criopreservación y recuperación de células iPS humanas con anulación completa del alimentador de sustitución sin suero medio

El objetivo general de este procedimiento es criopreservar y recuperar células IPS en condiciones de cultivo con o sin células alimentadoras. Esto se logra primero comenzando a envasar sus células IPS como lo haría normalmente. El segundo paso del procedimiento consiste en transferir las células a un medio de congelación libre de suero.

El tercer paso del procedimiento consiste en realizar la criopreservación como lo haría normalmente. El paso final del procedimiento es descongelar las células e iniciar el mantenimiento. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren una congelación y descongelación exitosas de células IPS en medio de congelación libre de suero, mediante una morfología saludable y una recuperación adecuada tras la descongelación.

Hola, soy Kate Wagner en el sitio GCO de Life Technologies. La demostración visual de este protocolo es fundamental porque los IPC pueden ser muy sensibles a la congelación y a la temperatura fina. Lo que facilita este protocolo es que se puede utilizar reemplazo de suero sin suero en todo su flujo de trabajo.

Actualmente, la familia de productos KSR incluye una lista completa de medios y reactivos para el cultivo con alimentador, sin alimentador y libre de componentes xenógenos de sus células madre embrionarias y células madre pluripotentes inducidas. KSR puede utilizarse en la derivación, el crecimiento, la criopreservación, la expansión y los primeros pasos iniciales de la diferenciación. El siguiente video le mostrará cómo descongelar y congelar usted mismo utilizando KSR en una máquina libre de Peter.

Para comenzar este procedimiento, primero caliente una cantidad adecuada de medio completo libre de alimentadores a 37 grados Celsius en un baño de agua. Aspire el medio gastado del recipiente de cultivo, que en este caso es una placa de 60 milímetros. Enjuague las células madre pluripotentes inducidas humanas dos veces con DPBS.

Luego, agregue un mililitro de dispa al recipiente. Incube el recipiente a 37 grados Celsius durante tres minutos. Después de eso, aspire la solución de dispa y lave suavemente las células con DPBS.

A continuación, agregue medio completo libre de alimentadores para cubrir la placa y use un raspador celular para desprender suavemente las células y transferirlas a un tubo cónico estéril de 15 mililitros. Enjuague la placa con medio completo libre de alimentadores, rociando suavemente para desprender cualquier célula que no se haya desprendido. Transfiera la solución de enjuague al mismo tubo cónico de 15 mililitros que contiene las células.

Lave el recipiente una segunda vez con medio y recupere esa solución de lavado junto con las células, centrifugando a 1000 RPM durante tres minutos a temperatura ambiente. Tras la centrifugación, aspire y deseche cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el botón celular. Agite suavemente el tubo para desalojar completamente el botón celular del fondo del tubo.

Luego, agregue un mililitro del medio de congelación A, utilizando una pipeta serológica de cinco mililitros, y resuspenda las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Después de lograr una suspensión uniforme de los agregados, agregue un mililitro del medio de congelación B al tubo gota a gota mientras agita suavemente la suspensión celular para mezclar. Distribuya un mililitro de la suspensión celular en cada vial criogénico y congele las células a menos 80 grados Celsius durante la noche en una cámara de isopropanol.

Al día siguiente, transfiera los viales de células a un tanque de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. Derrita rápidamente el vial congelado de células colocándolo en un baño de agua a 37 grados Celsius durante aproximadamente tres a cuatro minutos, hasta que solo quede un pequeño trozo congelado en el vial. Después de retirar el vial del baño de agua, rocíelo con isopropanol al 70 % para descontaminarlo y luego utilice una pipeta de cinco mililitros para transferir asépticamente todo el contenido del vial a un tubo cónico de 15 mililitros.

El siguiente paso puede ser el aspecto más difícil del procedimiento. El medio libre de alimentadores debe agregarse lentamente y con cuidado a las células. Para reducir el choque osmótico, agregue lentamente cuatro mililitros de medio completo libre de alimentadores gota a gota a las células en el tubo cónico de 15 mililitros.

Mientras se añade el medio, mueva suavemente el tubo de un lado a otro para mezclar las células. Esto reducirá el choque osmótico en las células. El medio completo libre de alimentadores puede sustituirse por medio condicionado con metionina que contenga reemplazo de suero knockout o por medio con reemplazo de suero knockout para su uso con alimentadores; consulte el texto del protocolo para obtener instrucciones sobre la preparación de los medios.

Una vez que se hayan agregado los cuatro mililitros de medio, centrifugue las células a 1000 RPM durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, aspire y deseche cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el botón celular. Resuspenda suavemente el botón celular en cuatro mililitros de medio completo libre de alimentadoras.

Utilizando una pipeta de cinco mililitros, agregue suavemente la suspensión celular en forma de gotas a una placa de cultivo de 60 milímetros recubierta con gel. Coloque la placa de cultivo en un incubador a 36-38 grados Celsius con una atmósfera humedecida de 4-6% de dióxido de carbono en aire. Agite cuidadosamente la placa en un patrón de norte a sur y de este a oeste para distribuir uniformemente las células.

24 horas después del descongelado. Reemplace el medio en la placa con medio fresco. Reemplace el medio gastado diariamente a partir de entonces hasta que las células alcancen una confluencia aproximada del 70 al 80 %.

Esta imagen de contraste muestra células madre pluripotentes inducidas humanas cultivadas en placas de cultivo recubiertas con gelt TRX, utilizando medio libre de suero completo y sin células alimentadoras. Las CIP exhiben una morfología similar a la de las células madre embrionarias humanas, caracterizada por núcleos grandes y citoplasma escaso. Un ejemplo de células después del descongelamiento y reemplazo con suero knockout.

Se muestra aquí el medio libre de alimentadores en gelatina TrackX. Al seguir este procedimiento, es importante recordar mantener todas las colonias celulares del mismo tamaño. Al criopreservar, esto mejora la recuperación celular.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.