Criopreservación y recuperación de células iPS humanas con anulación completa del alimentador de sustitución sin suero medio
15 de julio de 2010
Este protocolo describe el procedimiento detallado para criopreservar las células iPS humanas en el medio de criopreservación golpe de gracia SR y la recuperación de estas células en el golpe de gracia completa alimentador gratis SR (KSR-FF) a medio o en el alimentador medio basado golpe de gracia SR.
El objetivo general de este procedimiento es criopreservar y recuperar células IPS en condiciones de cultivo basadas en alimentadores o sin alimentadores. Esto se logra comenzando a empaquetar sus IPC como lo haría normalmente. El segundo paso del procedimiento es transferir las células a un medio de congelación libre de suero.
El tercer paso del procedimiento es criopreservar como lo haría normalmente. El paso final del procedimiento es descongelar las células y comenzar el mantenimiento. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la congelación y descongelación exitosa de las células IPS en medio de congelación libre de suero a través de una morfología saludable y la recuperación posterior a la descongelación.
Hola, soy Kate Wagner en el sitio de GCO en Life Technologies. La demostración visual de este protocolo es fundamental porque los IPC pueden ser muy sensibles a la congelación y a la T fina. Lo que hace que este protocolo sea más fácil es que el reemplazo de suero knockout se puede usar en todo su flujo de trabajo.
Hoy en día, la familia de productos KSR incluye una lista completa de medios y reactivos para el cultivo de células madre embrionarias y células madre pluripotentes inducidas basadas en alimentadores, sin piensos y sin xeno. KSR se puede utilizar para el crecimiento de la derivación, la criopreservación, la expansión y los primeros pasos iniciales de diferenciación. El siguiente video les mostrará descongelarse y congelarse usando KSR en una máquina libre de Peter.
Para iniciar este procedimiento. Primero calentar en una cantidad apropiada de medio libre de alimentador completo a 37 grados Celsius en un baño de agua aspirar el medio gastado del recipiente de cultivo, que es un plato de 60 milímetros. En este caso, enjuague las células madre pluripotentes inducidas humanas dos veces con DPBS.
A continuación, añade un mililitro de dispa al plato. Incuba la placa a 37 grados centígrados durante tres minutos. Después de eso, aspire la solución de dispa y lave suavemente las células con DPBS.
A continuación, agregue un medio libre de alimentador completo para cubrir el plato y use un raspador de células para raspar suavemente las células de transferencia a un tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros. Enjuague el plato con una alimentación completa de medio libre, rociando suavemente las células que no se hayan desprendido. Transfiera la solución de enjuague al mismo tubo de 15 mililitros que contiene las células.
Enjuague el plato por segunda vez con medio y extraiga esa solución de enjuague con las celdas de pellets por centrifugación a 1000 RPM durante tres minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, aspire y deseche cuidadosamente el sobrenadante sin alterar la pelletización de la célula. Golpee suavemente el tubo para desalojar completamente el pellet de celda de la parte inferior del tubo.
A continuación, añada un mililitro de medio de congelación A, utilizando una pipeta serológica de cinco mililitros, y vuelva a suspender las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Después de una suspensión uniforme de los grumos, agregue un mililitro de medio de congelación B al tubo gota a gota mientras agita suavemente la suspensión celular para mezclar. Asigne un mililitro de suspensión celular en cada celda criocongelada a menos 80 grados Celsius durante la noche en una cámara de isopropanol.
Al día siguiente, transfiera los viales de células a un tanque de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. Descongele rápidamente el frasco de células congeladas colocándolo en un baño de agua a 37 grados centígrados durante unos tres o cuatro minutos hasta que solo quede un pequeño trozo congelado en el vial. Después de retirar el vial del baño de agua, rocíe con isopropanol al 70% para descontaminarlo, use una pipeta de cinco mililitros para transferir asépticamente todo el contenido del vial a un tubo cónico de 15 mililitros.
El siguiente paso puede ser el aspecto más difícil del procedimiento. El medio libre del alimentador debe agregarse lenta y cuidadosamente a las celdas. Para reducir el choque osmótico, agregue lentamente cuatro mililitros de medio libre de alimentador completo gota a gota a las celdas en el tubo cónico de 15 mililitros.
Mientras agrega el medio, mueva suavemente el tubo hacia adelante y hacia atrás para mezclar las celdas. Esto reducirá el choque osmótico de las células. El medio libre de alimentador completo puede reemplazarse con un reemplazo de suero knockout que contenga medio acondicionado con metanfetamina o un medio de reemplazo de suero knockout para usar con alimentadores, consulte el texto del protocolo para obtener instrucciones de preparación de medios.
Una vez que se hayan agregado los cuatro mililitros de medio, centrifugar las celdas a 1000 RPM durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, aspire con cuidado y deseche el cuerdo sin alterar la pelletización de la célula. Vuelva a suspender suavemente el pellet de celda en cuatro mililitros de medio libre de alimentador completo.
Con una pipeta de cinco mililitros, agregue suavemente la suspensión de celdas gota a gota a una placa de cultivo de 60 milímetros recubierta de gelt trucks. Coloque la placa de cultivo en una incubadora de 36 a 38 grados centígrados con una atmósfera humidificada de cuatro a 6% de dióxido de carbono en el aire. Gire con cuidado el plato en un patrón de norte a sur, de este a oeste para distribuir uniformemente las celdas.
24 horas después de la descongelación. Reemplace el medio en el plato con medio fresco. A partir de entonces, reemplace el medio gastado diariamente hasta que las células tengan aproximadamente un 70 a 80% de confluente.
Esta imagen de contraste muestra células madre pluripotentes inducidas humanas cultivadas en placas de cultivo recubiertas de gelt TRX utilizando un reemplazo completo del suero, medio libre de alimentador. Las IPC exhiben una morfología similar a las células madre embrionarias humanas, caracterizadas por núcleos grandes y citoplasma escaso. Un ejemplo de reemplazo de suero después de la descongelación y la eliminación de las células.
Aquí se muestra el medio libre de alimentador en gelt TrackX. Al seguir este procedimiento, es importante recordar que todas las colonias celulares deben tener el mismo tamaño. Cuando se criopreserva, esto mejora la recuperación celular.
Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.
Visión general
Este protocolo describe el procedimiento para crioconservar células madre pluripotentes inducidas humanas (iPS) utilizando medio de crioconservación KnockOut SR y recuperarlas en medio completo KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) o medio KnockOut SR basado en alimentadores. El método enfatiza la importancia de la demostración visual debido a la sensibilidad de las células iPS durante la congelación y descongelación.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Investigación de células madre
- Técnicas de crioconservación
Antecedentes
- Las células iPS humanas son sensibles a los procesos de congelación y descongelación.
- Los productos KnockOut SR facilitan varias etapas del cultivo de células madre.
- La crioconservación adecuada es crucial para mantener la viabilidad celular.
- Se pueden utilizar condiciones de cultivo libres de alimentadores y basadas en alimentadores para las células iPS.
Propósito del estudio
- Proporcionar un protocolo confiable para crioconservar células iPS.
- Asegurar la recuperación exitosa de células después de la descongelación.
- Demostrar el uso de productos KSR a lo largo del flujo de trabajo.
Métodos utilizados
- Preparación de células iPS para crioconservación.
- Uso de medio de congelación libre de suero para la preservación celular.
- Crioconservación a -80 grados Celsius seguido de almacenamiento en nitrógeno líquido.
- Descongelación y resuspendiendo células en medio completo libre de alimentadores.
Resultados principales
- Congelación y descongelación exitosas de células iPS demostradas por morfología saludable.
- Las células mantuvieron viabilidad y crecimiento tanto en condiciones libres de alimentadores como basadas en alimentadores.
- La efectividad del protocolo confirmada mediante evaluación visual de la recuperación celular.
- Mantener un tamaño uniforme de colonia celular mejoró las tasas de recuperación.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un enfoque sistemático para crioconservar células iPS.
- Los productos KnockOut SR son efectivos para mantener la salud celular durante el proceso.
- Las demostraciones visuales mejoran la comprensión y ejecución del protocolo.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Reliable cryopreservation and recovery of human iPS cells using feeder-free, defined media directly addresses scalability and standardization challenges in early discovery and translational research. This protocol enables consistent pluripotent cell banking, supporting robust assay development and downstream applications in drug discovery portfolios. Feeder-free workflows reduce biological variability, enhancing predictive confidence and portfolio triage at key inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables consistent banking of pluripotent cells for repeated hypothesis testing and pathway interrogation.
- Reduces biological variability by eliminating feeder layers, supporting functional target validation.
- Facilitates mechanistic de-risking by maintaining cell health and pluripotency post-thaw.
- Supports predictive confidence in early-stage screening and triage decisions.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, feeder-free system for preparing validated iPS cells for high-throughput assays.
- Improves reproducibility and scalability of cell-based assays by using defined media components.
- Enables reliable compound evaluation by ensuring healthy, undifferentiated cell recovery.
- Supports platform reuse and assay standardization across discovery teams.
Translational & Preclinical Research
- Maintains disease-relevant cell models for translational biomarker studies when using patient-derived iPS cells.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by supporting robust cell recovery and expansion.
- Reduces risk of batch-to-batch variability in preclinical model development.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing reliable cell sources.
Pipeline & Workflow Integration
This cryopreservation and recovery protocol fits from early discovery through preclinical research, enabling seamless transitions between banking, expansion, and assay deployment stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by providing healthy, pluripotent cells on demand.
- Screening: Delivers assay-ready iPS cells with reproducible morphology and viability for quantitative readouts.
- Analytics: Enables consistent measurement of cell health and recovery, supporting cross-condition comparisons.
- Translational Research: Maintains continuity for disease modeling and biomarker alignment when using patient-derived lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, feeder-free workflow for pluripotent cell management across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based studies.
- Operational Value: Standardizes cryopreservation and recovery, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in pluripotent stem cell handling and feeder-free culture techniques.
- Needs access to defined media, cryopreservation equipment, and controlled thawing infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell colony size and handling procedures for optimal recovery.
- Adaptation may be needed for different iPS cell lines or disease models.
- Careful osmotic shock management is critical for maintaining cell viability post-thaw.
