La inducción y la puntuación clínica de enfermedades crónico-recurrente encefalomielitis autoinmune experimental

Soy Christine Beaton. Soy investigadora asistente en el laboratorio de George Chen, en el Departamento de Fisiología y Biofísica de la Universidad de California en Irvine. Y lo que voy a mostrarles en los próximos días es cómo inducir y monitorear la EAE crónica recidivante, que significa encefalomielitis autoinmune experimental en ratas DA.

Este es un modelo animal para la esclerosis múltiple, o debería decir, uno de los modelos animales para la esclerosis múltiple. Se caracteriza por una parálisis flácida ascendente en esos animales y por características histológicas que se asemejan a la enfermedad humana. Por lo tanto, este procedimiento llevará varios días.

Así que el primer día voy a mostrarle cómo preparar la emulsión genética con homogenado de médula espinal roja ingenua en adyuvante completo de Freund. El segundo día, voy a mostrarle cómo inmunizar las ratas contra la EAE, y luego vamos a esperar entre siete y 15 días para observar los primeros signos clínicos en esos animales, momento en el cual le mostraré las diferentes etapas de progresión de la EAE en distintos animales. Primero, voy a mostrarle todos los reactivos y materiales necesarios para preparar la emulsión.

Lo que estoy utilizando es el adyuvante completo de Freund H 37 Ra, pero aunque ya contiene Mycobacterium tuberculosis, voy a suplementarlo con cuatro miligramos por ml de Mycobacterium tuberculosis H 37 Ra liofilizado adicional. Para preparar esta bacteria liofilizada, necesito colocarla en más trementina y hacer un polvo fino con la espátula. Una vez hecho esto, voy a añadir esas bacterias al adyuvante.

Luego el adyuvante está listo. El siguiente paso es preparar mi antígeno. Así que voy a sacar médulas espinales de rata D que están congeladas a menos 80, y para mantenerlas bien congeladas, las colocaré sobre un recipiente de pesaje con hielo seco, y las iré sacando una por una y, utilizando cuchillas de afeitar simples, picaré las médulas espinales dentro de los recipientes de pesaje.

A continuación, voy a colocar mi adyuvante suplementado en el vórtex. Y mientras se produce la vortexación, voy a añadir mi médula espinal poco a poco al adyuvante después de haber mezclado toda la médula espinal con el adyuvante en el vórtex. Vamos a vortexar durante cinco minutos más, y después vamos a transferir la emulsión preparada a cinco jeringas de vidrio de 1 mL.

Vamos a conectar dos jeringas de vidrio de 5 M utilizando un puente de 16 G, y vamos a impulsar la emulsión de una jeringa a la otra lo más rápido posible para ese puente. Y después de unos minutos, cuando la emulsión comience a endurecerse, vamos a cambiar a un puente más pequeño. Este es de 18 G, y hará que la emulsión se endurezca aún más, y la mantendremos en esas jeringas con este puente cubierto con papel de aluminio durante la noche en el refrigerador.

Así que he pesado 30 miligramos de Mycobacterium tuberculosis sobre el papel de pesaje. Los transferí a un mortero. Y utilizando un pistilo, he reducido los agregados de bacterias a un polvo fino.

Pero no debe presionar demasiado con el pistilo para no romper las bacterias. Cuando las bacterias están agregadas al inicio de un procedimiento, son de color beige amarillento. Si ha obtenido un polvo fino y muy fino, al final tendrá un polvo blanco, y eso es lo que desea, pero no debe presionar demasiado para evitar romper las bacterias.

Una vez hecho esto, tomé un ampolleta de 10 ml de adyuvante completo de trans, y me aseguré de que todas las bacterias estuvieran en suspensión. Abrí este ampolleta y vertí los 10 ml completos del adyuvante de trans en el mortero, encima del Mycobacterium tuberculosis desagregado. Ahora voy a transferir el adyuvante completo suplementado a un tubo de 50 ml.

Ahora estoy tomando mi adyuvante completo suplementado y colocándolo en un tubo. Por supuesto, las bacterias están en el fondo del líquido, y voy a tratar de extraer la mayor cantidad posible hacia el tubo. Pero si dejo algunas en el mortero, no será un problema tan grave porque voy a reutilizar este mortero sin limpiarlo para preparar mi emulsión de médula espinal.

Entonces, aquí están las médulas espinales. Se mantuvieron congeladas a menos 80. Pesé 10 gramos de ellas para agregar a 10 ml de mi adyuvante suplementado.

Entonces, lo que voy a hacer con esas médulas espinales, manteniéndolas congeladas el mayor tiempo posible, es picarlas muy finamente en esos recipientes de pesaje utilizando hojas de afeitar. Para picar muy finamente las médulas espinales, se necesitan dos hojas de afeitar y un recipiente de pesaje. Lo que hago es tomar una médula espinal, colocarla en mi recipiente de pesaje y comenzar a cortarla; pongo mi mano encima para que, como está congelada y tiene corazón, empiece a moverse bruscamente, y así puedo atrapar primero los trozos grandes. Además, comenzará a descongelarse muy rápidamente y se adherirá al costado de mi hoja de afeitar.

Así que uso la otra hoja de bisturí para retirarla, e intento picarla lo más finamente y lo más rápido posible para que no tenga tiempo de derretirse, ya que es mucho más difícil de cortar una vez derretida. Por lo tanto, es extremadamente importante que la médula espinal sea completamente picada, muy finamente, porque cuanto más fina esté, más homogénea será la inmersión, y más ratas enfermarán con una enfermedad más homogénea. Por eso es sumamente importante picar muy, muy bien todas esas médulas espinales.

Ahora voy a proceder a picar cada una de esas médulas espinales exactamente de la misma manera hasta terminar con los 10 gramos completos de médula espinal. Ahora lo que voy a hacer es mezclar ligeramente la médula espinal en el mortero para asegurarme de recoger toda la Mycobacterium tuberculosis que aún quedaba en el mortero después de terminar de añadir el adyuvante. Y lo que voy a hacer a continuación es colocar el adyuvante en el vórtex.

Y mientras agito en vórtice continuamente lo más rápido posible, voy a añadir mi médula espinal poco a poco a este adyuvante. Entonces, ahora tengo mi adyuvante suplementado en el vórtice, y voy a comenzar a añadir, añadiendo mi médula espinal poco a poco. La razón por la cual estoy añadiendo el A, el antígeno muy lentamente al adyuvante es porque estamos haciendo una emulsión de agua en aceite.

Entonces, el adyuvante consiste principalmente en aceite mineral, y el antígeno es una solución en partes iguales. Lo que deseamos hacer es mezclar el antígeno muy lentamente con el aceite, de modo que el aceite recubra completamente el antígeno cada vez que se añade. Si lo agregáramos todo de una vez, no recubriría completamente el antígeno.

Ahora he añadido toda la médula espinal media al adyuvante en el vórtex y he colocado el tubo en el vórtex para que gire durante cinco minutos más, a fin de asegurar que todo se mezcle completamente. Ajusto la velocidad para alcanzar el vértice más alto posible sin perder demasiado líquido en los bordes del tubo. Ya han terminado los cinco minutos adicionales de vórtice, así que detengo el vórtex y voy a transferir mi mezcla a jeringas de vidrio.

Entonces, he armado la jeringa completa. La he conectado al puente de mayor diámetro, y al otro extremo del puente, he conectado únicamente el cuerpo de una jeringa, y ahora voy a añadir la emulsión a esa jeringa. Entonces ahora, no.

Ahora voy a pasar todo el líquido a la jeringa inferior, desconectaré la jeringa superior, terminaré de armar la jeringa superior, y me aseguraré de que no haya burbujas de aire en mi jeringa inferior ni en el puente. Y ahora voy a volver a conectar. De modo que ahora tengo ambas jeringas conectadas entre sí a través de este puente.

Uno está lleno de inmersión, el otro está vacío. Y lo que voy a hacer ahora es empujar lo más rápido posible el émbolo de una jeringa hacia la otra, de ida y vuelta. Ahora voy a cambiar el puente de gran diámetro por uno más pequeño, el puente de 18 G.

El puente más pequeño hará que la emulsión sea aún más espesa. Para cambiar los puentes, coloco toda la emulsión en una jeringa, retiro la jeringa vacía, me aseguro de no perder nada en el puente, retiro el puente, coloco el nuevo, elimino todas las burbujas de aire y vuelvo a conectar la otra jeringa.

Y repito el procedimiento, ya que ahora la emulsión es mucho más difícil de atravesar, y tengo cuidado de no romper este puente, que es muy frágil. Repito este procedimiento con otro juego de jeringas mientras tenga emulsión en mi tubo. Así que uso tantas jeringas como sean necesarias para consumir toda la emulsión.

Así que ahora he mezclado la emulsión varias veces, quizás 10, 15 veces, pero varía según los lotes. Y ahora está volviéndose extremadamente difícil de atravesar. Y lo haré un par de veces más, bueno, o tal vez no.

Ahora está realmente atascado, así que voy a dejarlo así. De lo contrario, existe el riesgo de romper ya sea la jeringa o el puente. Entonces, cuando deje de avanzar, si sucede muy al principio, eso significa que quizás el puente está obstruido.

Pero en este punto, dado que lo he mezclado al menos 10 o 15 veces, significa que la emulsión está lista. Es muy espesa, así que debo dejarla en reposo. Ahora la envolveré en papel de aluminio y la colocaré en el refrigerador durante la noche.

Ayer preparamos la emulsión con médulas espinales rojas y dejamos la emulsión durante la noche en el refrigerador. Hoy la sacamos y vamos a inyectar 200 microlitros por rata en la base de la cola. Pero antes de inyectarla, debemos asegurarnos de que la emulsión esté en buen estado.

Por lo tanto, debería seguir siendo sólido, y aún es un buen sólido. La grieta que se observa aquí incluso nos indica que es un buen sólido, ya que no se ha separado en fases, en dos fases, lo cual sería negativo. Así que esta emulsión es adecuada para su uso.

Por lo tanto, cada jaula recibirá 200 microlitros de nuestra emulsión. Para inyectarla, utilizamos jeringas de tres mil, pero nos aseguramos de usar jeringas con punta de bloqueo de seguridad, porque si usamos jeringas de ajuste deslizante, la emulsión es tan espesa que la aguja podría salirse mientras intentamos inyectar.

Por lo tanto, siempre utilice una jeringa del tipo de bloqueo lu. Y como aguja, intentamos usar la aguja más pequeña posible, pero con una emulsión tan espesa, debemos usar una aguja de calibre 20. Dado que necesitamos inyectar con mucha precisión en la base de la cola, anestesiamos a las ratas durante unos minutos y aprovechamos que las ratas están profundamente dormidas para marcarlas y para marcarlas.

Utilizamos perforaciones en las orejas, y cada rata se identifica mediante un patrón específico de perforaciones. Ahora estamos listos para inyectar a las ratas, y vamos a administrar a cada rata 200 microlitros de emulsión en la base de la cola, y al mismo tiempo marcaremos las orejas. Solo preparo la emulsión en la jeringa de inyección para una rata a la vez, porque a menudo resulta muy difícil inyectar y tengo que presionar con mucha fuerza, y no quiero administrar a una rata más de lo que necesita.

Así que solo lleno la jeringa para una hu a la vez. Para llenar la jeringa, conecto mi jeringa de inyección de plástico al puente que a su vez está conectado a la jeringa de vidrio que contiene la emulsión. Coloco aproximadamente 300 microlitros de emulsión en mi jeringa de plástico.

Luego conecto la aguja y presiono para expulsar el aire de la aguja, de modo que no pierda estos 50 microlitros de espacio muerto en la aguja. Y me aseguro de tener exactamente 200 microlitros, y luego inyecto en la base de la cola de la rata. Ahora que hemos inyectado todos nuestros corazones, los monitorearemos diariamente.

Así que vamos a pesarlos todas las mañanas y a revisarlos dos veces al día en busca de signos clínicos de EAE. Los primeros signos, como les mostraré cuando aparezcan, serán una cola flácida, y esperamos que estos signos comiencen a manifestarse en las primeras ratas alrededor del día siete u ocho después de la inyección. La mayoría de las ratas enfermarán alrededor del día 10 al 12, y las últimas ratas enfermarán alrededor del día 15 al 17.

Actualmente estamos en el día 13 después de haber inmunizado nuestros corazones con la emulsión de médula espinal, y ahora voy a monitorear a esos animales para verificar su puntuación clínica. Pero antes de hacerlo, permítanme explicarles cómo alojamos a nuestros animales. Las enfermedades autoinmunes tienen esta característica: cualquier patógeno presente en el animal reducirá la respuesta autoinmune.

Para evitarlo en la mayor medida posible, alojamos a nuestras ratas en condiciones específicas. Así, se mantienen en este cubículo, que contiene aire filtrado y está bajo presión positiva; los animales se alojan individualmente en jaulas autoclavadas. Por lo tanto, absolutamente todo dentro de la jaula se autoclava antes de colocar la rata.

Y tienen filtros en la parte superior de las jaulas. La comida es el alimento estándar para roedores. Es I originated.

También proporcionamos a nuestras ratas agua acidificada. Tomamos agua de bebida normal y agregamos ácido clorhídrico siguiendo protocolos estándar, y utilizamos aguas acidificadas para mantener la flora intestinal al mínimo, lo que reducirá el riesgo de alterar nuestra respuesta autoinmune. Ahora estoy listo para realizar la puntuación clínica de mis ratas.

La puntuación varía desde un valor de cero, que indica ausencia de signos clínicos, hasta seis, que corresponde a un estado morboso en el cual se sacrifica a los animales. Ahora voy a mostrarles paso a paso ejemplos de cada puntuación clínica que podemos encontrar en este modelo. En este momento estamos en el día 13 después de la inmunización de las ratas con UCAE.

Y en esa jaula tengo dos ratas que aún no se han enfermado. Por lo tanto, no presentan absolutamente ningún signo clínico de enfermedad. Así que ambas ratas aún están sanas.

Están corriendo de un lado a otro, moviéndose continuamente, y como se puede observar, cuando se desplazan levantan la cola del lecho de cama. Así que a veces dejan que la cola se seque, pero la mayor parte del tiempo intentan mantenerla elevada fuera del lecho de cama. Y si tienen la oportunidad, también treparán fuera de la jaula, lo que indica que tienen control completo sobre las cuatro extremidades y pueden ponerse de pie si es necesario.

Por lo tanto, el primer signo clínico de EA es una cola flácida. Así, si tomo una rata y presiono mi dedo contra su cola, la rata tenderá a aferrarse con la punta de la cola. Como acaba de ver, esta rata no tiene la cola flácida, y puedo comprobarlo también con la otra.

La cola agarra el dedo, lo que significa que estas ratas tienen una cola completamente reactiva. Tienen un puntaje clínico de cero, lo que en realidad significa ausencia total de signos clínicos. Aquí se muestra una rata que tiene un puntaje clínico de 0,5.

Entonces, si simplemente se observa dentro de la jaula, se comporta absolutamente normal: corre, trepa por los lados de la jaula, pero la punta de la cola nunca se separa del lecho de cama. Por lo tanto, esta rata podría tener una parálisis parcial de la cola. Entonces, lo que hago es tomar la rata y realizar la misma prueba, y aunque la cola tiene cierto tono, el extremo no se enrolla completamente alrededor de mi dedo.

Así que puntuaré a esta rata con una puntuación de 1,5, que corresponde a cola parcialmente flácida. Una puntuación clínica de uno se caracteriza por una cola completamente flácida, es decir, ninguna parte de la cola tiene tono muscular, pero el animal aún puede usar sus patas traseras. Como se puede observar, esta rata se mantiene erguida contra el lateral de la jaula, lo que indica que sus patas traseras funcionan normalmente.

Pero si examino la cola de esas ratas al tomarlas, no hay absolutamente ningún tono en su cola. Otra prueba que puede realizarse es, mientras la RU está en el fondo de la jaula, si se levanta la cola con una RU normal, la cola bajará lentamente o quizás ni siquiera llegue al suelo con una puntuación de uno. Si se levanta la cola, caerá inmediatamente al suelo.

Esta RU puede mover las cuatro extremidades, pero las extremidades posteriores son demasiado débiles como para permitirle mantenerse de pie. Por lo tanto, clasificaré esta RU con una puntuación clínica de dos. Así, la principal diferencia entre una puntuación de uno y dos es que la puntuación de uno consiste únicamente en una cola flácida.

Las patas traseras son completamente funcionales, y con una puntuación de tres, la rata caería de lado. Dos es un valor intermedio, lo que significa que la rata puede usar sus patas traseras, pero estas son mucho más débiles que las de una rata normal. Por lo tanto, esta rata presenta una característica inusual de la EAE.

Normalmente, la EAE se caracteriza como una parálisis flácida ascendente, pero en algunos casos, bastante raros, como este, las ratas desarrollan primero parálisis de las extremidades delanteras antes de que se paralicen las traseras. Y este es el caso de esta rata. Si la observa, su cabeza está más baja que el resto de su cuerpo porque tiene dificultades con sus extremidades delanteras y no puede trepar por el costado de la jaula.

Y aunque sus extremidades traseras funcionan normalmente, no puede empujar con sus extremidades delanteras. Por lo tanto, aún calificaría a esta rata con una puntuación de dos, lo que correspondería a una paraplejia leve, aunque normalmente vemos esto con las extremidades traseras en este RU, aquí lo observamos en las cuatro extremidades. Así que este RU tiene un fenotipo mucho más severo que los anteriores.

Tiene un puntaje clínico de tres. Como voy a mostrarles, las extremidades delanteras funcionan absolutamente con normalidad, pero las dos extremidades traseras presentan una parálisis moderada. Ambas extremidades traseras son utilizables por el animal para moverse, pero este cae de lado y no puede controlar completamente esas patas.

Esas esporas son mucho más débiles de lo que normalmente serían sin EE. En esa etapa, ya no nos preocupan los movimientos flácidos de la cola, ya que muchos de esos ratas, después de un tiempo, empiezan a tener una cola muy rígida. Esta rata aún tiene la cola muy flácida, pero a veces se puede observar alguna distonía. Así, la cola comienza a moverse de manera descoordinada.

Por lo tanto, ya no observamos la cola a este nivel, solo analizamos cómo funcionan las extremidades. Puntúa 3,5 porque, si observamos sus extremidades traseras, una se mueve, pero la otra está completamente paralizada y no contribuye en absoluto al avance del animal. Por ello, esto se considera una parálisis completa de una extremidad trasera y, en consecuencia, una puntuación de 3,5.

Esta UR tiene un puntaje clínico de cuatro, lo que significa parálisis completa de la extremidad trasera, y se caracteriza por la incapacidad total de mover las patas traseras. La rata que tenemos en esta jaula tiene un puntaje clínico de cinco, lo que corresponde a una parálisis completa de la extremidad trasera con incontinencia adicional. Este animal es incontinente, como podemos observar; presenta una pérdida total de peso en esta zona, lo cual no vemos en los otros animales que no son incontinentes.

Cuando nuestros HUS tienen puntuaciones de tres o más, les proporcionamos botellas de agua con tubos largos para sorber, a fin de asegurarnos de que puedan acceder al agua. También colocamos alimento en el fondo de la jaula y les damos paquetes de gel. Sin embargo, a pesar de todo esto, cada vez que sacamos a las ratas para monitorearlas, lo cual hacemos dos veces al día, siempre les ofrecemos agua por si no hubieran ingerido suficiente durante el día.

Aquí tengo una rata con una puntuación clínica de cuatro. En esa etapa, esos animales necesitan ser estimulados ligeramente para comer. Lo que hago es humedecer su alimento, lo que facilita mucho que puedan masticarlo.

Entonces, durante las últimas dos semanas, les he mostrado cómo inducir y monitorear la EAE crónica recurrente en ratas DA. En el primer paso, les mostré cómo preparar la inmersión de médula espinal y luego cómo inyectarla en la base de la cola de esas ratas. Y hoy les he mostrado cómo puntuar a esas ratas con diferentes grados de enfermedad.

Por supuesto, este es un modelo crónico con recaídas, por lo que esperamos que las puntuaciones en las ratas varíen. La enfermedad entrará en remisión en unos días y luego tendrá recaídas con el tiempo. Algunas ratas entrarán en una fase más crónica de la enfermedad.

Varía de un animal a otro. Ahora, antes de finalizar este video, quiero enfatizar un aspecto sobre la prueba de fármacos en esos modelos. El punto muy importante es aleatorizar a los animales lo más posible.

Una cosa muy importante que debe saberse es que cuanto antes enferme el animal, más grave será su enfermedad. Por lo tanto, no se deben agrupar todos los animales de control en el primer día y los animales tratados en los días siguientes. Lo que hacemos es que tan pronto como un animal enferma y en el día en que deseamos comenzar el tratamiento, colocamos los animales aleatoriamente en dos grupos diferentes.

Si tenemos, por ejemplo, un grupo control y un grupo tratado, el primer animal irá al grupo control, el segundo al grupo tratado, y así sucesivamente hasta que todos los animales se hayan asignado a su respectivo grupo. Sin embargo, nos aseguramos de que esta aleatorización ocurra lo más temprano posible en el protocolo. Espero que este video les haya sido útil y que puedan inducir y monitorear la EAE crónica recurrente en ratas D.

Y mucha suerte con sus experimentos.