Name: A gran escala basado en pez cebra En vivo Pantalla de moléculas pequeñas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Descubre un método de cribado a gran escala de moléculas pequeñas en embriones de pez cebra vivo. Esta técnica permite identificar compuestos que modulan el desarrollo embrionario y la fisiología.

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1) la recolección de huevos de pez cebra <ol><li> En la tarde antes del día de la pantalla químicos, creado desde 10 hasta 20 tanques de cría de pez cebra. Llenar cada tanque con agua del sistema de la acuicultura. Utilizando una red de pesca, la transferencia de un macho adulto y uno o dos hembras adultas en el recipiente interior de cada tanque de cría. Separar los peces machos y hembras de unos a otros con un divisor. Etiqueta de las jaulas y poner una tapa sobre ellos. </li><li> En la mañana de la pantalla, quitar los separadores de los tanques de cría y permitir que el pez cebra para el apareamiento. En el transcurso del próximo 1 hora, permiten a los óvulos fertilizados a caer a través de la red en la parte inferior de cada envase interior. </li><li> Después de 1 hora, vuelva adultos de pez cebra de nuevo a los tanques de almacenamiento permanente, retirar el recipiente interior y recoger los huevos por el esfuerzo del agua en cada tanque de crianza a través de un colador de té de plástico. </li><li> Invertir el tamiz sobre una placa de Petri y lavar el filtro con cuidado para eliminar los huevos en la placa de Petri con una botella de lavado que contiene el medio E3. </li><li> Todos los huevos no fertilizados, lo que parece opaco, debe ser removido con una pipeta de plástico desechable. Cada cruz de apareamiento debe producir alrededor de 200 embriones. </li></ol> 2) arraying embriones en placas de 96 pozos <ol><li> La transferencia de alrededor de 5 embriones en un medio de E3 en cada pocillo de una placa de 96 pocillos utilizando una pipeta Pasteur de vidrio. </li><li> Una vez que los embriones son dispuestos sobre la placa de 96 pozos, extraer la mayor cantidad del medio E3 como fuera posible de los pozos con una de 12 canales (30 - 300 l) pipeta, teniendo cuidado de no perforar el embrión. Usando la pipeta de 12 canales, entrega 250 l de medio E3 que contiene kanamicina 0.5μg/ml a cada pozo lo más rápido posible para no permitir que los embriones se sequen. </li><li> Ponga las placas de 96 pozos en 28,5 ° C incubadora hasta que alcancen la etapa deseada cuando los compuestos que se añaden. </li></ol> 3) La transferencia de la biblioteca de moléculas pequeñas Mientras que la transferencia de compuestos pueden ser automatizadas con métodos de transferencia de robótica, vamos a describir el método de transferencia manual. <ol><li> Bibliotecas de moléculas pequeñas son típicamente suministrados en un formato de 96 pozos, con cada compuesto almacenados en DMSO como una reserva de 10 mm. Unos 60 minutos antes de que los embriones llegan a la etapa cuando los compuestos se van a agregar al deshielo de un número deseado de placas de 96 pozos que contienen alícuotas de pequeñas moléculas (placa de la fuente). Tome nota del número de serie de identificación u otro de los platos de origen. Para minimizar la condensación en las placas, el deshielo puede ocurrir en una cámara de desecación que contiene Drierite (WA Hammond Drierite CO, Xenia, OH). </li><li> En pocas palabras de girar los platos en una centrífuga de mesa equipada con placa adaptadora múltiples también. </li><li> Retire el precinto de aluminio de la placa de la fuente. Con una pipeta de 12 canales, diluir los compuestos de la placa de la fuente a la concentración de 0,5 mm (por ejemplo, si a partir de 250 nL alícuotas de las acciones 10 mM, añadir 4,75 l de DMSO a cada pocillo). </li><li> Cuando los embriones en la placa de 96 pocillos (placa receptor) llegan a la etapa deseada, el uso de 12 canales (20-20 l) pipeta para transferir 2.5μL de compuestos (0,5 mM) de las placas de origen en las placas que contienen el receptor embriones. </li><li> Anote el número de identificación de las placas de origen en las placas de receptores embrión. Se cubren las placas receptor ya que contiene los embriones y los compuestos con tapa, mezcle suavemente las placas girando suavemente, y colocarlos en una incubadora de 28,5 ° C. </li><li> Cubrir cada plato de origen que contiene sin usar pequeñas moléculas (0,5 mm) con un precinto de aluminio y colocarlo en un congelador -80 ° C para almacenamiento a largo plazo. </li></ol> 4) La detección de los efectos de moléculas pequeñas mediante una inspección visual de los fenotipos <ol><li> Antes de realizar la pantalla, formular un criterio específico para lo que constituiría un &quot;golpe&quot;. </li><li> En el momento deseado en el desarrollo, eliminar las placas de 96 pocillos que contienen el compuesto tratados con embriones de la incubadora y examinar cada bien bajo un microscopio estereoscópico. Para una mejor visualización de los cambios sutiles, tales como cambios en el patrón circulatorio, un microscopio de contraste de fase invertida se puede utilizar. Microscopía fluorescente se puede utilizar para examinar la perturbación de la expresión de las buenas prácticas agrarias o de las proteínas DsRed bajo un promotor tejido-específica. </li><li> Analiza rápidamente las placas de 96 pozos para cualquier pozo en el que por lo menos 3 de los 5 embriones exhiben las prescritas &quot;hit&quot; fenotipo. Registro de la identidad de la placa y la ubicación del pozo de potencial de cada golpe. </li><li> Volver a confirmar un éxito potencial de volver a probar los efectos del compuesto en varias dosis (1 uM, 5 uM, M 10 y M 50). Para cada dosis, 10 embriones son examinados en 0,5 ml de los medios de comunicación E3 en un formato de placa de 48 pocillos. El momento de la adición de compuestos para volver a probar debe ser idéntica a la de la proyección original. Un golpe se confirma cuando el fenotipo provocado se reproduce en un nuevo análisis de la compound </li><li> Identifique el compuesto golpe de la base de datos de moléculas pequeñas en la biblioteca de química. </li></ol>

<ol><li>Bayliss, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modulation+of+receptor+signaling+inhibits+regenerative+angiogenesis+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Chemical modulation of receptor signaling inhibits regenerative angiogenesis in adult zebrafish.</a> Nature chemical biology. 2, 265-273 (2006).</li>
<li>Burns, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+assay+for+small+molecules+that+modulate+zebrafish+embryonic+heart+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate.</a> Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).</li>
<li>Hao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+structure-activity+relationship+study+of+dorsomorphin+analogues+identifies+selective+VEGF+and+BMP+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo structure-activity relationship study of dorsomorphin analogues identifies selective VEGF and BMP inhibitors.</a> ACS chemical biology. 5, 245-253 (2010).</li>
<li>Hong, C. C., Peterson, Q. P., Hong, J. Y., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artery%2Fvein+specification+is+governed+by+opposing+phosphatidylinositol-3+kinase+and+MAP+kinase%2FERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Artery/vein specification is governed by opposing phosphatidylinositol-3 kinase and MAP kinase/ERK signaling.</a> Curr Biol. 16, 1366-1372 (2006).</li>
<li>Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+that+induce+repolarization+abnormalities+cause+bradycardia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish.</a> Circulation. 107, 1355-1358 (2003).</li>
<li>Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+developmental+screens+reveal+the+logic+and+timing+of+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12965-12969 (2000).</li>
<li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nature chemical biology. 4, 33-41 (2008).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature reviews. 4, 35-44 (2005).</li>
<li>Stern, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+that+delay+S+phase+suppress+a+zebrafish+bmyb+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Small molecules that delay S phase suppress a zebrafish bmyb mutant.</a> Nature chemical biology. 1, 366-370 (2005).</li>
<li>Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+suppression+of+a+genetic+mutation+in+a+zebrafish+model+of+aortic+coarctation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation.</a> Nature biotechnology. 22, 595-599 (2004).</li>
</ol>

Cuando se planifica una pantalla de química basada en el pez cebra, se debe prestar especial atención a la solidez del fenotipo en estudio y la tasa previa de tal fenotipo. Esto es particularmente importante para las pantallas de los supresores de química de un fenotipo inducido. Por ejemplo, para un fenotipo causado por la inducción de choque térmico de un transgén, la condición que induce el fenotipo debe ser reproducible con precisión trazado antes de iniciar la pantalla para evitar inaceptablemente altos índices de ...

<ol><li> Mínimo de 20 parejas de adultos de pez cebra de genotipo deseado. </li><li> Redes de pesca, los tanques de cría, con el recipiente interior extraíble y separadores (hábitats acuáticos). </li><li> Placas de Petri (10 cm). </li><li> Colador de plástico. </li><li> Lavado de botellas de agua contendo embrión. </li><li> Pipetas desechables de polietileno de transferencia. </li><li> Poliestireno de 96 pocillos de fondo redondo de las placas de ensayo (Corning Costar, Lowell, MA). </li><li> Vidrio pipeta Pasteur (Fisher Scientific). </li><li> Manual pipeta bomba, 10 ml (Bel-Art Products, Pequannock, NJ). </li><li> Medio embrión E3: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4, que contiene 0,003% PTU (feniltio-carbamida, Sigma, St. Louis, MO). PTU se puede preparar como una solución de 10 veces por disolución de 0,3 g PTU en 1 litro de los medios de comunicación embrión E3. Las soluciones que contienen PTU debe ser protegido de la luz cubriendo con papel de aluminio. </li><li> 12 canales de pipetas, 20.2 l (Eppendorf). </li><li> 12 canales de pipetas, 300-300 l (Eppendorf). </li><li> Desechables de poliestireno pipeta de la cuenca, 50 mL (Fisher Scientific). </li><li> Biblioteca de moléculas pequeñas de compuestos estructuralmente diferentes dispuestos en un formato de 96 wll en acciones 10 mM en DMSO. Cada placa principal se dividió en alícuotas en placas de 96 pozos de almacenamiento de polipropileno (Corning) y se almacenan a -80 ° C hasta su uso. </li><li> Aluminio cinta aislante para placas de 96 pocillos (Nunc, Rochester, NY). </li><li> DMSO (Sigma, St. Louis, MO). </li><li> Básicos incubadora, 28,5 ° C (Fisher Scientific). </li><li> Estereomicroscopio con la base de luz transmitida (Leica Microsystems, Bannockburn, IL). </li></ol>

a gran escala basado en pez cebra en vivo pantalla de moléculas pequeñas

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Debido a su tamaño pequeño embrión, el rápido desarrollo, la transparencia, la fecundidad, y numerosas similitudes moleculares, morfológicas y fisiológicas de los mamíferos, el pez cebra se ha convertido en un poderoso<em&gt; In vivo</em&gt; Plataforma para las pantallas de drogas basada en el fenotipo y el análisis químico genético. Aquí, demostramos un método sencillo y práctico a gran escala de detección de moléculas pequeñas con embriones de pez cebra.

Pez cebra se ha convertido en un poderoso<em&gt; In vivo</em&gt; Plataforma para las pantallas de drogas basada en el fenotipo y el análisis químico genético. Aquí, demostramos un método sencillo y práctico a gran escala de detección de moléculas pequeñas con embriones de pez cebra.

A gran escala basado en pez cebra En vivo Pantalla de moléculas pequeñas

Dado su pequeño tamaño embrionario, su rápido desarrollo, su transparencia, su fecundidad y sus numerosas similitudes moleculares, morfológicas y fisiológicas con...

El objetivo general del siguiente experimento es descubrir moléculas pequeñas que modulen específicamente aspectos clave del desarrollo embrionario y de la fisiología. Esto se logra colocando un gran número de huevos fertilizados en placas de cribado de 96 pocillos como segundo paso. A continuación, se añaden alícuotas de una biblioteca de moléculas pequeñas a los pocillos de 96 que contienen los embriones.Se examinan placas de cultivo para detectar fenotipos inducidos por las moléculas pequeñas. Se obtienen resultados que muestran qué moléculas pequeñas afectan específicamente el desarrollo o la fisiología del pez super. Hola, mi nombre es Charles Hong en la Escuela de Medicina de la Universidad de Vanderbilt.En nuestro laboratorio, realizamos cribados químicos de alto rendimiento utilizando embriones de difish. Esta es una técnica relativamente sencilla que puede adaptarse ampliamente para descubrir nuevos compuestos bioactivos. La tarde anterior al día del cribado químico, prepare de 10 a 20 tanques de reproducción de pez cebra.Coloque un divisor en cada tanque y llene cada tanque con agua del sistema de acuicultura utilizando una red de pesca para transferir, a un recipiente interno, un macho adulto y una a dos hembras adultas. En cada tanque de reproducción, etiquete los tanques y coloque una tapa sobre ellos por la mañana del análisis. Retire los divisores de los tanques de reproducción y permita que los peces cebra se apareen.En el transcurso de la próxima hora, permita que los huevos fertilizados caigan a través de la rejilla en la parte inferior de cada recipiente interno. Después de una hora, devuelva los peces cebra adultos a los tanques de almacenamiento permanentes.Retire el recipiente interno y recoja los huevos filtrando el agua de cada tanque de cría a través de un colador de plástico para té. Invierta el colador sobre una placa de Petri y enjuáguelo suavemente para hacer caer los huevos en la placa. Utilizando un frasco lavador que contenga medio E tres, deben eliminarse todos los huevos no fertilizados, que aparecen opacos.Utilizando una pipeta plástica desechable, cada cruce de apareamiento debe producir aproximadamente 200 embriones. Luego, transfiera alrededor de cinco embriones en medio E tres a cada pocillo de una placa de 96 pocillos utilizando una pipeta de Pasteur de vidrio. Una vez que los embriones estén dispuestos en una placa de 96 pocillos.Retire la mayor cantidad posible del medio E tres de los pocillos utilizando una pipeta de 12 canales, teniendo cuidado de no perforar los embriones. Con la pipeta de 12 canales, agregue 250 microlitros de E tres.Medio que contiene 0,5 microgramos por mililitro de canamicina en cada pocillo lo más rápidamente posible para evitar que los embriones se sequen. Coloque las placas de 96 pocillos en un incubador a 28,5 grados Celsius hasta que alcancen la etapa deseada en la que se agregarán los compuestos. En este protocolo, buscamos compuestos que alteren el patrón embrionario temprano e incubaremos los embriones durante tres horas o hasta que más del 90 % de los embriones alcancen la etapa de 1000 células, momento en el cual se suministran normalmente las bibliotecas de moléculas pequeñas.En una placa fuente de 96 pocillos con cada compuesto almacenado en DMSO como stock de 10 milimolar, aproximadamente 60 minutos antes de que los embriones alcancen la etapa deseada, descongele un número adecuado de placas de 96 pocillos que contengan alícuotas de moléculas pequeñas. Tome nota del número de serie u otro número de identificación de las placas fuente para minimizar la condensación en las placas. Coloque la placa en una cámara de desecación que contenga agente desecante.Centrifugar brevemente las placas en una centrífuga de sobremesa equipada con un adaptador para placas de múltiples pozos. Retirar la cinta de aluminio de la placa fuente utilizando una pipeta de 12 canales y diluir los compuestos en la placa fuente hasta la concentración deseada con DMSO. En este protocolo, utilizamos una concentración final de 0.5 milimolar y agregamos 4.75 microlitros de DMSO para diluir la placa stock de 10 milimolar.Cuando los embriones en la placa de 96 pocillos alcancen la etapa deseada, utilice una pipeta de 12 canales para transferir 2,5 microlitros de compuestos desde las placas de origen hacia las placas receptoras que contienen los embriones. Cubra las placas que ahora contienen los embriones y los compuestos con sus tapas, y registre el número de identificación de las placas de origen en las placas de embriones. Mezcle suavemente las placas girándolas cuidadosamente y colóquelas en un incubador a 28,5 grados Celsius.Cubra cada placa fuente que contenga pequeñas moléculas no utilizadas con lámina de aluminio, sujétela con cinta adhesiva y colóquela en un congelador a menos 80 grados Celsius para su almacenamiento a largo plazo. Antes de realizar la pantalla visual, formule un criterio específico de acierto. Por ejemplo, en una pantalla de inhibidores de moléculas pequeñas del desarrollo del cerebro anterior, un acierto puede ser un compuesto que provoque la pérdida del cerebro anterior.La ausencia de ojos es un indicador visual sencillo de la pérdida del prosencéfalo y no requiere fluorescencia para analizar en los momentos deseados del desarrollo. Retire las placas de 96 pocillos que contienen embriones tratados con compuestos del incubador y examine cada pocillo bajo un microscopio estereoscópico al tamizar inhibidores de bajo peso molecular de la formación del cerebro; examine las placas a las 28 horas buscando la pérdida del ojo como marcador de la inhibición del desarrollo cerebral. Registre la identidad de la placa y la ubicación del pocillo para cualquier pocillo en el que al menos tres de cada cinco embriones presenten el fenotipo hi prescrito. Devuelva la placa de 96 pocillos al incubador.Vuelva a confirmar la pérdida de los ojos y el prosencéfalo a las 48 horas. Aunque los embriones no tendrán prosencéfalo, sobrevivirán al menos hasta cuatro días. Vuelva a confirmar un resultado positivo potencial mediante la repetición de la prueba de los efectos del compuesto a varias dosis; para cada dosis, se analizan 10 embriones en 0,5 mililitros de medio E3 en formato de placa de 48 pocillos.El momento de la adición del compuesto para la repetición de pruebas debe ser idéntico al del cribado original. Se confirma un HIIT cuando el fenotipo inducido se reproduce de manera dependiente de la dosis durante la repetición de pruebas del compuesto. Finalmente, identifique el compuesto hi a partir de la base de datos de moléculas pequeñas en la biblioteca química.Mediante una pantalla química visual basada en el pez cebra, descubrimos un inhibidor de la señalización hedgehog compuesto por una pequeña molécula, basándonos en su efecto sobre el eje corporal. Esta imagen muestra embriones expuestos al inhibidor de hedgehog que presentan una marcada curvatura ventral de la cola. A las 24 horas, los mismos embriones examinados a las 48 horas aún muestran el fenotipo de curvatura ventral.Esta imagen muestra el embrión tratado con el compuesto en comparación con el embrión mutante de la vía hedgehog. Una vez dominada esta técnica, una persona puede analizar aproximadamente 400 compuestos por semana en solo un par de horas. Esta técnica también ha allanado el camino para que los biólogos químicos estudien aspectos como el desarrollo celular, las vías de señalización celular y el desarrollo embrionario.Al trabajar con moléculas pequeñas no caracterizadas, es importante utilizar correctamente el equipo de seguridad, como batas de laboratorio y guantes, ya que estas moléculas no caracterizadas podrían ser potencialmente peligrosas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se presenta el desarrollo de un sistema automatizado de imágenes y análisis de pez cebra embriones transgénicos en placas de pocillos múltiples. Esto demuestra la capacidad de medir los efectos dependientes de la dosis de una molécula pequeña, BCI, el crecimiento de fibroblastos la expresión del gen del factor periodista y suministrar tecnología para el establecimiento de alto rendimiento de las pantallas de química de pez cebra.

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En este artículo, los embriones de pez cebra se utilizan para el cribado de toxicidad química. La toxicidad química se correlaciona con las lecturas del fenotipo. El protocolo de muestreo muestra un enfoque metodológico para realizar el cribado de toxicidad química.

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