A gran escala basado en pez cebra En vivo Pantalla de moléculas pequeñas

El objetivo general del siguiente experimento consiste en descubrir moléculas pequeñas que modulen específicamente aspectos clave del desarrollo embrionario y de la fisiología. Esto se logra colocando un gran número de huevos fertilizados en placas de screening de 96 pocillos como segundo paso. A continuación, se añaden alícuotas de una biblioteca de moléculas pequeñas a las placas de 96 pocillos junto con los embriones en las 96.

Las placas de cultivo se examinan en busca de fenotipos inducidos por las moléculas pequeñas. Se obtienen resultados que muestran qué moléculas pequeñas afectan específicamente el desarrollo o la fisiología de los superpeces. Hola, mi nombre es Charles Hong en la Escuela de Medicina de la Universidad de Vanderbilt.

En nuestro laboratorio, realizamos cribados químicos de alto rendimiento utilizando embriones de pez cebra. Esta es una técnica relativamente sencilla que puede adaptarse ampliamente para descubrir nuevos compuestos bioactivos. Por la tarde, previo al día del cribado químico, prepare de 10 a 20 tanques de reproducción de pez cebra.

Coloque un divisor en cada tanque y llene cada tanque con agua del sistema de acuicultura utilizando una red para peces, transfiriendo un macho adulto y una a dos hembras adultas al recipiente interior. En cada tanque de reproducción, etiquete los tanques y coloque una tapa sobre ellos por la mañana del análisis. Retire los divisores de los tanques de reproducción y permita que los peces cebra se apareen.

En el transcurso de la próxima hora, permita que los huevos fertilizados caigan a través de la rejilla en la parte inferior de cada recipiente interno. Después de una hora, devuelva los peces cebra adultos a los tanques de almacenamiento permanentes.

Retire el recipiente interno y recoja los huevos colando el agua de cada tanque de cría a través de un colador de plástico para té. Invierta el colador sobre una placa de Petri y enjuáguelo suavemente para hacer caer los huevos en la placa. Utilizando un frasco lavador que contenga medio E tres, deben eliminarse todos los huevos no fertilizados, que aparecen opacos.

Utilizando una pipeta plástica desechable, cada cruce de apareamiento debe producir aproximadamente 200 embriones. Luego, transfiera alrededor de cinco embriones en medio E tres a cada pocillo de una placa de 96 pocillos utilizando una pipeta de Pasteur de vidrio. Una vez que los embriones se hayan dispuesto en una placa de 96 pocillos.

Retire la mayor cantidad posible del medio E tres de los pocillos utilizando una pipeta de 12 canales, teniendo cuidado de no perforar los embriones. Con la pipeta de 12 canales, agregue 250 microlitros de E tres.

Medio que contiene 0,5 microgramos por mililitro de canamicina en cada pocillo lo más rápidamente posible para evitar que los embriones se sequen. Coloque las placas de 96 pocillos en un incubador a 28,5 grados Celsius hasta que alcancen la etapa deseada en la que se agregarán los compuestos. En este protocolo, buscamos compuestos que alteren el patrón embrionario temprano e incubaremos los embriones durante tres horas o hasta que más del 90 % de los embriones alcancen la etapa de 1000 células, momento en el cual se suministran típicamente las bibliotecas de moléculas pequeñas.

En una placa fuente de 96 pocillos con cada compuesto almacenado en DMSO como una solución madre de 10 milimolar, aproximadamente 60 minutos antes de que los embriones alcancen la etapa deseada, descongele un número adecuado de placas de 96 pocillos que contengan alícuotas de moléculas pequeñas. Tenga en cuenta el número de serie u otro número de identificación de las placas fuente para minimizar la condensación en las placas. Coloque en una cámara de desecación que contenga agente desecante.

Centrifugar brevemente las placas en una centrífuga de sobremesa equipada con un adaptador para placas de múltiples pozos. Retirar la cinta de aluminio de la placa fuente utilizando una pipeta de 12 canales y diluir los compuestos en la placa fuente hasta la concentración deseada con DMSO. En este protocolo, utilizamos una concentración final de 0,5 milimolar y agregamos 4,75 microlitros de DMSO para diluir la placa stock de 10 milimolar.

Cuando los embriones en la placa de 96 pocillos alcancen la etapa deseada, utilice una pipeta de 12 canales para transferir 2,5 microlitros de compuestos desde las placas fuente a las placas receptoras que contienen los embriones. Cubra las placas que ahora contienen los embriones y los compuestos con sus tapas, y registre el número de identificación de las placas fuente en las placas de embriones. Mezcle suavemente las placas agitándolas suavemente y colóquelas en un incubador a 28,5 grados Celsius.

Cubra cada placa fuente que contenga moléculas pequeñas sin usar con lámina de aluminio, sujétela con cinta adhesiva y colóquela en un congelador a menos 80 grados Celsius para su almacenamiento a largo plazo. Antes de realizar la pantalla visual, formule un criterio específico de acierto. Por ejemplo, en una pantalla de inhibidores de moléculas pequeñas del desarrollo del cerebro anterior, un acierto puede ser un compuesto que provoque la pérdida del cerebro anterior.

La ausencia de ojos es un indicador visual sencillo de la pérdida del prosencéfalo y no requiere fluorescencia para analizar en los momentos deseados del desarrollo. Retire las placas de 96 pocillos que contienen embriones tratados con compuestos del incubador y examine cada pocillo bajo un microscopio estereoscópico al tamizar inhibidores de bajo peso molecular del desarrollo del cerebro anterior; examine las placas a las 28 horas buscando la pérdida del ojo como marcador de la inhibición del desarrollo del cerebro anterior. Registre la identidad de la placa y la ubicación del pocillo para cualquier pocillo en el que al menos tres de cada cinco embriones presenten el fenotipo hi prescrito. Devuelva la placa de 96 pocillos al incubador.

Vuelva a confirmar la pérdida de los ojos y el prosencéfalo a las 48 horas. Aunque los embriones no tendrán prosencéfalo, sobrevivirán al menos hasta los cuatro días. Vuelva a confirmar un resultado positivo potencial repitiendo la prueba de los efectos del compuesto a varias dosis; para cada dosis, se analizan 10 embriones en 0,5 mililitros de medio E3 en placas de 48 pocillos.

El momento de la adición del compuesto para la repetición de pruebas debe ser idéntico al del cribado original. Se confirma un HIIT cuando el fenotipo inducido se reproduce de manera dependiente de la dosis durante la repetición de pruebas del compuesto. Finalmente, identifique el compuesto hi a partir de la base de datos de moléculas pequeñas en la biblioteca química.

Mediante una pantalla química visual basada en el pez cebra, descubrimos un inhibidor de la señalización hedgehog compuesto por una pequeña molécula, basándonos en su efecto sobre el eje corporal. Esta imagen muestra embriones expuestos al inhibidor de hedgehog que presentan una marcada curvatura ventral de la cola. A las 24 horas, los mismos embriones examinados a las 48 horas aún muestran el fenotipo de curvatura ventral.

Esta imagen muestra el embrión tratado con el compuesto en comparación con el embrión mutante de la vía hedgehog. Una vez dominada esta técnica, una persona puede analizar aproximadamente 400 compuestos por semana en solo un par de horas. Esta técnica también ha allanado el camino para que los biólogos químicos estudien aspectos como el desarrollo celular, las vías de señalización celular y el desarrollo embrionario.

Al trabajar con moléculas pequeñas no caracterizadas, es importante utilizar correctamente el equipo de seguridad, como batas de laboratorio y guantes, ya que estas moléculas no caracterizadas podrían ser potencialmente peligrosas.