Gen de entrega de cerebro de rata postnatal por la inyección no ventricular plásmido y electroporación
17 de septiembre de 2010
Este protocolo describe un método no viral de la entrega de las construcciones genéticas en un área determinada del cerebro de roedor viviente. El método consiste en la preparación de plásmidos, fabricación micropipeta, la cirugía de las crías de rata neonatal, la microinyección de la construcción, y In vivo Electroporación.
Hola, soy RI Ov. Y yo soy Alexia Ying. Somos estudiantes de posgrado de la Universidad Cent. En este video, presentaremos un método de electroforesis in vivo para la entrega de un gen diana a una zona específica de un tejido cerebral principal.
Veamos. Veamos. El método de electrotransferencia in vivo ofrece una forma rápida y eficiente de entregar genes de interés o ARN de interferencia pequeño a tejido cerebral vivo.
Ofrece una alternativa de bajo costo frente a la creación de animales transgénicos y al enfoque de entrega génica mediante virus. En este video, demostraremos un procedimiento detallado de entrega génica posnatal a la corteza rad neonatal. Utilizaremos el plásmido que codifica la proteína verde fluorescente mejorada y el promotor de la beta actina de pollo con un potenciador CMV.
Realizamos todas las manipulaciones quirúrgicas en el gabinete de flujo laminar para mantener la esterilidad y minimizar el riesgo de contaminación bacteriana o fúngica del animal. Para la administración de plásmidos a la corteza, utilizamos un microinyector WPI con controlador electrónico y una jeringa Hamilton de 10 microlitros conectada a un manipulador estereotáctico. La cría roja se anestesia utilizando una unidad de anestesia compuesta por una caja y una máscara.
La cría se fija entonces mediante barras auriculares sobre la mesa de calentamiento conectada al manipulador estereotáxico. Para la manipulación quirúrgica y el monitoreo de la microinyección, utilizamos un microscopio binocular. Para la electroforesis, utilizamos el electrooperador CYV 21 in vivo con electrodos en forma de pinza.
Para la recuperación de las crías. Después de la anestesia, se utiliza una cámara calentada. Normalmente preparamos 10 microlitros de la solución de inyección del plásmido en un tubo de pared delgada de 200 microlitros. Esta solución es suficiente para varios experimentos.
Mezclamos ocho microlitros de la solución de plásmido con un microlitro de PBS 10X y un microlitro de solución acuosa al 0,1 % de verde rápido. La concentración final del plásmido en la solución de inyección debe estar entre uno y tres microgramos por microlitro. El uso de concentraciones más bajas de ADN plasmídico reducirá la eficiencia de transfección, mientras que una concentración más alta de ADN será demasiado viscosa para inyectarse a través de la punta delgada de la capilar de vidrio.
Para la preparación de la pipeta de vidrio, utilizamos una capilar de vidrio de borosilicato con filamento y el extractor vertical de electrodos de vidrio con los parámetros máximos de tracción y calentamiento. Luego, rompemos la punta de la pipeta usando un trozo de papel para obtener una punta con un diámetro de entre 10 y 20 micrómetros. Verificamos la punta, su diámetro y forma bajo el objetivo del microscopio.
Utilizando un capilar delgado de polímero, llenamos aproximadamente un tercio del volumen de una jeringa Hamilton de 10 microlitros. Con aceite mineral, nos aseguramos de evitar burbujas de aire. Luego llenamos la pipeta de vidrio con aceite mineral e insertamos la pipeta en la jeringa Hamilton.
Nuevamente, evitando burbujas de aire. La jeringa con la pipeta de vidrio se fija entonces en un microinyector conectado a un controlador. El sistema de microinyección fijado en un instrumento estereotáctico nos permite sumergir con seguridad la punta de la pipeta de vidrio en el tubo con una solución de inyección de plásmido.
Cuando la punta toca la superficie de la solución, se sumerge un milímetro a dos milímetros más. Luego, utilizamos el controlador de microinyección para llenar la pipeta con aproximadamente un microlitro de la mezcla de inyección. Todos los experimentos presentados aquí se realizan de acuerdo con las regulaciones de la Universidad de Helsinki para experimentos con animales.
Para cada experimento, llenamos una jeringa hermética con isoflurano. Fijamos la jeringa en la unidad de anestesia conectada a la fuente de flujo de aire, el animal camina y la mascarilla está fijada en el equipo estereotáxico. En la unidad de anestesia, ajustamos el flujo de aire a aproximadamente 250 mililitros por minuto y el nivel de isoflurano a 4 %. Colocamos al animal en la caja durante dos a cinco minutos.
Cuando el P deja de moverse, lo colocamos sobre la almohadilla calefactora conectada al sistema estereotáctico. Posicionamos la parte rostral de la cabeza del P en la máscara. Por lo general, tarda entre cinco y diez minutos en que la cría entre en anestesia profunda.
Cuando se logra esto, reducimos el isoflurano en el flujo a aproximadamente 1,5 a 2 %. Tratamos la piel en la cabeza de la cría con etanol al 70 % utilizando pequeñas tijeras y pinzas finas. Cortamos la piel desde el pescuezo de la cría hasta su frente, doblamos las piezas de piel hacia los lados y tiramos ligeramente de las barras auriculares hacia las aberturas orales del cráneo para fijar la cabeza y la piel. Utilizando un microscopio binocular, localizamos el punto bregmático en el cráneo para identificar la región de interés mediante las coordenadas estereotáxicas, posicionamos la pipeta de inyección sobre esta región y marcamos el lugar dejando caer entre 25 y 50 nanolitros de la solución de inyección sobre la superficie del cráneo.
Perforamos el cráneo suave y cuidadosamente en el punto marcado utilizando un taladro quirúrgico de alta velocidad bajo el microscopio hasta que aparece líquido en el área perforada. Fijamos las pinzas de electroporación, con electrodos en los lados del cráneo. Aplicamos un gel conductor para lograr una mejor conductividad.
Eliminamos la gota de líquido del área perforada utilizando un pequeño tampón e introducimos la aguja de vidrio en el orificio. De acuerdo con las coordenadas del sitio de inyección, infundimos de 25 a cien nanolitros de la solución de inyección a una velocidad de cinco a 20 nanolitros por segundo. Luego retiramos rápidamente la pipeta y procedemos inmediatamente con la electroporación.
La electroforesis se realiza aplicando cinco pulsos con una duración de 50 milisegundos, una amplitud de pulso de 99 voltios y una frecuencia de un hercio. Retiramos los electrodos y las barras auriculares. Suturamos la piel cortada utilizando una combinación de pinzas romas y afiladas y los hilos quirúrgicos.
Colocamos la cría en una cámara cálida durante 15 a 30 minutos para ayudar a su recuperación tras la anestesia. Luego devolvimos la cría a la jaula de su madre. La expresión del transgén en las células transfectadas con éxito aparecerá aproximadamente 10 horas después de la electroforesis y permanecerá estable durante varias semanas.
Entonces eso es todo. Gracias por ver y buena suerte con sus experimentos. Adiós.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este protocolo describe un método no viral para entregar constructos genéticos a áreas específicas del cerebro vivo de roedores mediante electroforesis in vivo. El método es eficiente y permite la entrega rápida de genes al tejido cerebral.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Entrega génica
- Técnicas de electroforesis
Antecedentes
- La entrega de genes al cerebro es fundamental para estudiar la función génica.
- Los métodos tradicionales pueden ser invasivos y menos eficientes.
- La electrotransferencia in vivo proporciona una alternativa no viral.
- Este método puede dirigirse eficazmente a regiones cerebrales específicas.
Objetivo del estudio
- Presentar un método no viral para la transferencia génica en cerebros de roedores.
- Mostrar la eficiencia de la electroporación in vivo.
- Facilitar la investigación sobre la función génica y estudios neurológicos.
Métodos Utilizados
- Preparación de plásmidos para la entrega de genes.
- Fabricación de micropipetas para microinyección.
- Cirugía en ratones neonatos para entrega dirigida.
- Aplicación de electroforesis in vivo para mejorar la absorción génica.
Resultados principales
- Entrega exitosa de constructos genéticos a áreas cerebrales específicas.
- Eficiencia demostrada del método de electroforesis.
- Aplicaciones potenciales en terapia génica e investigación en neurociencia.
- Invasión mínima en comparación con los métodos tradicionales.
Conclusiones
- El método no viral es eficaz para la entrega de genes in vivo.
- La electroforesis in vivo es una técnica prometedora para la investigación en neurociencia.
- Este enfoque puede mejorar los estudios sobre la función génica en el cerebro.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La entrega dirigida de genes en tejido cerebral postnatal permite la interrogación funcional de circuitos neuronales sin compensación durante el desarrollo, lo que apoya la reducción mecanicista de riesgos en la validación de objetivos terapéuticos. Este enfoque no viral ofrece una alternativa rentable y escalable a los modelos transgénicos para flujos de trabajo de descubrimiento temprano. Facilita la evaluación rápida de la función génica en sistemas relevantes para la enfermedad, mejorando la confianza predictiva en la identificación de compuestos líderes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite el control espacial y temporal de la expresión génica para investigar hipótesis terapéuticas en el cerebro posnatal.
- Valor operativo: Proporciona un método rápido y de bajo costo para la validación funcional de dianas sin necesidad de modificación de la línea germinal.
- Valor predictivo: Reduce la ambigüedad mecanicista al limitar la transfección a regiones cerebrales definidas, apoyando la selección de carteras.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Valor científico: Genera una eficiencia de transfección cuantitativamente evaluable mediante la expresión de un reportero fluorescente en cortes cerebrales agudos.
- Valor operativo: Estandariza los parámetros de administración (voltaje, duración del pulso, volumen) para obtener lecturas reproducibles mediante electrofisiología o imágenes.
- Preparación para ensayos: Prepara sistemas biológicos validados para la selección de compuestos posteriores en cultivos neuronales o preparaciones de cortes.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Apoya modelos de enfermedad posnatales en los que la letalidad durante el desarrollo dificulta los estudios con knockout constitutivo.
- Reducción de Riesgos Mecanicistas: Permite la modulación génica dependiente de la dosis para evaluar la interacción con el blanco y la modulación de la vía.
- Alineación Preclínica: Permite el uso de imágenes de dos fotones y de electrofisiología para correlacionar la modulación del blanco con fenotipos funcionales.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método conecta el descubrimiento inicial (prueba de hipótesis sobre dianas) y la validación preclínica al permitir la modulación génica específica de regiones en sistemas cerebrales posnatales relevantes para la enfermedad.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la interrogación basada en hipótesis de la función génica en circuitos neuronales definidos sin factores de confusión del desarrollo.
- Selección: Permite la evaluación estandarizada y cuantitativa de la expresión de transgenes para la validación del efecto de compuestos en cortes cerebrales.
- Análisis: Proporciona lecturas fluorescentes y electrofisiológicas para cuantificar la modulación del objetivo y la actividad de la vía.
- Investigación Traducional: Conecta la intervención molecular con resultados funcionales en preparaciones agudas de cortes, apoyando la evaluación fenotípica alineada con biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la validación iterativa de objetivos en múltiples indicaciones neurológicas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza en el blanco al permitir una entrega génica precisa en el espacio y el tiempo en el cerebro postnatal.
- Valor operativo: Proporciona reproductibilidad mediante parámetros estandarizados de electroporación y un flujo de trabajo quirúrgico estéril.
- Valor estratégico: Reduce la dependencia de modelos transgénicos que requieren mucho tiempo, acelerando las decisiones de avance o abandono en la validación de blancos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al aclarar el mecanismo del blanco en contextos neuronales relevantes para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía de roedores neonatos, coordinación estereotáctica y técnicas microquirúrgicas.
- Depende de instrumentación especializada, incluyendo microinyectores, electroporadores con electrodos moldeados y microscopios binoculares.
- Necesita la estandarización de la concentración del plásmido, el volumen de inyección y los parámetros del pulso entre operadores y sitios.
- La adaptación a otras regiones cerebrales o edades posnatales requiere la optimización empírica de las coordenadas y los parámetros de administración.
- Las limitaciones prácticas incluyen la eficiencia variable de transfección según la calidad de la punta de la pipeta y la integridad del tejido durante la cirugía.
