Name: En la cuantificación in vivo de interacciones de proteínas G del receptor acoplado con espectralmente resuelve de dos fotones de Microscopía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-19T17:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: Aprende a cuantificar interacciones de proteínas G en células vivas mediante microscopía de dos fotones con resolución espectral. Este método permite obtener mapas de eficiencia FRET a nivel de píxel.

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Este trabajo fue apoyado por la Iniciativa de Investigación Universidad de Wisconsin-Milwaukee crecimiento, el Instituto de Investigación Biomédica de Wisconsin y Tecnologías de la Salud y la Fundación Bradley.

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</ol>

En esta presentación, se muestra cómo determinar el tamaño y la información estructural de un complejo de proteínas oligómero in vivo. Aunque los datos presentados se obtuvieron de un receptor específico de membrana (es decir, Ste2p) expresado en células de levadura, el método es que todo lo abarca, ya que se puede aplicar a cualquier tipo de proteína expresada en cualquier tipo de célula, la única condición es que las proteínas están etiquetados con los marcadores fluorescentes adecuados. Futuras modificacione...

<table><tbody><tr><td>Peptona</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1420</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422</td><td></td></tr><tr><td>Polietileno glicol 4000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-605</td><td></td></tr><tr><td>Base de nitrógeno para levadura sin (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; y aminoácidos</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0335-15-9</td><td></td></tr><tr><td>Suplementos para medio sintético de selección para levadura</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2001</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>S70210</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de amonio</td><td>Fisher Scientific</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Acros Organics</td><td>424090010</td><td></td></tr><tr><td>Leucina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP385</td><td></td></tr><tr><td>Histidina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP382</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo plan acromático corregido al infinito, inmersión en aceite, 100x, NA=1.43</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de dos fotones con resolución espectral</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

en la cuantificación in vivo de interacciones de proteínas g del receptor acoplado con espectralmente resuelve de dos fotones de microscopía

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

El estudio de las interacciones de proteínas en células vivas es un área importante de investigación debido a que la información acumulada tanto en las aplicaciones de los beneficios industriales, así como aumenta el conocimiento básico biológico fundamental. Förster (fluorescencia) la transferencia de energía por resonancia (FRET) entre una molécula de donantes en un estado electrónicamente excitado y una molécula de receptor de cerca ha sido frecuentemente utilizado para el estudio de las interacciones proteína-proteína en las células vivas. Las proteínas de interés se marcan con dos tipos diferentes de sondas fluorescentes y se expresa en las células biológicas. Las sondas fluorescentes son entonces emocionado, por lo general usando luz láser, y las propiedades espectrales de la emisión de fluorescencia que emanan de las sondas fluorescentes se recopila y analiza. La información sobre el grado de las interacciones proteína está incrustado en los datos de emisión espectral. Por lo general, la célula debe ser analizado un número de veces que el fin de acumular suficiente información espectral para cuantificar con exactitud el alcance de las interacciones de proteínas por cada región de interés dentro de la célula. Sin embargo, la composición molecular de estas regiones pueden cambiar durante el curso del proceso de adquisición, lo que limita la determinación espacial de los valores cuantitativos de la aparente eficiencia de FRET a un promedio de células enteras. Por medio de un espectro resuelto de dos fotones microscopio, podemos obtener un conjunto completo de imágenes espectral resuelto después de sólo un ciclo de excitación completa de la muestra de interés. De estos datos espectrales a nivel de píxeles, un mapa de FRET eficiencia a través de la celda se calcula. Mediante la aplicación de una teoría simple de FRET en los complejos oligoméricos a la distribución obtenidos experimentalmente la eficiencia de FRET en toda la célula, una sola exploración espectral resuelto revela información estequiométrica y estructural sobre el complejo oligómero en estudio. A continuación se describe el procedimiento de preparación de las células biológicas (la levadura Saccharomyces cerevisiae) que expresan receptores de membrana (estéril factor 2 α-receptores) marcado con dos tipos diferentes de sondas fluorescentes. Además, ilustran los factores críticos de la recogida de los datos de fluorescencia utilizando el espectro resuelto de dos fotones sistema de imágenes de microscopía. El uso de este protocolo podrá ser extendido a estudiar cualquier tipo de proteína que puede ser expresado en una célula viva con un marcador fluorescente que se le atribuye.

Mediante el empleo de un espectro resuelto de dos fotones sistema de imágenes de microscopía, a nivel de píxel de mapas de transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) se obtienen eficiencias de las células que expresan receptores de membrana, la hipótesis de que forma oligomérica homo-complejos. Mapas de la FRET eficiencia, son capaces de estimar la información sobre el complejo estequiométrico oligómero en estudio.

En la cuantificación in vivo de interacciones de proteínas G del receptor acoplado con espectralmente resuelve de dos fotones de Microscopía

El estudio de las interacciones proteicas en células vivas es un área de investigación importante debido a que la información acumulada beneficia tanto al sector industrial...

El objetivo general del siguiente experimento es determinar información estequiométrica y estructural acerca de una proteína. Todos los complejos de ligamentos que expresan células biológicas vivas, las células de levadura están modificadas genéticamente para expresar las proteínas de interés unidas a una sonda fluorescente donadora o a una aceptora. Las sondas donadoras pueden excitarse directamente mediante un láser.Aunque los aceptores solo pueden excitarse mediante una transferencia de energía desde un donador cercano previamente excitado, las células se exponen a luz de un láser pulsado de infrarrojo cercano. La fluorescencia emitida por las sondas se separa en sus componentes espectrales mediante una rejilla de transmisión y se proyecta sobre la superficie de un arreglo CCD con multiplicación de electrones. Por lo tanto, se obtienen espectros fluorescentes completos de cada ligamento individual en cada posición de la muestra.El perfil espectral de la fluorescencia detectada depende de la interacción específica de las proteínas de interés. Los datos se analizan para determinar, para cada píxel de imagen de una célula escaneada, las emisiones separadas de las sondas donadora y

in-vivo-quantification-g-protein-coupled-receptor-interactions-using

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo describe cómo la imagen de interacciones proteína-proteína mediante un ensayo basado en la proximidad FRET.

Imágenes de interacciones proteína-proteína In vivo</em

A continuación, describimos los métodos detallados en vivo de imágenes de células para la investigación de la quimiotaxis. Se presenta fluorescencia microscópica métodos para controlar la dinámica espacio-temporal de los eventos de señalización en las células que migran. La medición de la señalización de eventos nos permite entender mejor cómo una red de señalización de GPCR logra gradiente de detección de factores quimiotácticos y los controles de la migración direccional de las células...

Receptor de imagen acoplados a proteína G (GPCR) mediada por eventos de señalización que la quimiotaxis de control de Dictyostelium discoideum</em

Hemos desarrollado una plataforma de software que utiliza Imaris Neuroscience, ImarisXT y MATLAB para medir los cambios en la morfología de una forma indefinida tomado de tres dimensiones de fluorescencia confocal de células individuales. Este nuevo enfoque se puede utilizar para cuantificar los cambios en la forma celular después de la activación del receptor y por lo tanto representa una posible herramienta adicional para el descubrimiento de fármacos.

Una herramienta de análisis que cuantifica los cambios celulares Morfología de imágenes tridimensionales de fluorescencia

Este protocolo describe cómo utilizar la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para visualizar y rastrear receptores individuales en la superficie de las células vivas y, por lo tanto, analizar la movilidad lateral del receptor, el tamaño de los complejos de receptores, así como para visualizar las interacciones transitorias receptor-receptor. Este protocolo puede extenderse a otras proteínas de membrana.

De alta resolución espacio-temporal Análisis de la Dinámica del receptor por Casa molécula de microscopía de fluorescencia

Los métodos sencillos para detectar la activación selectiva de proteínas G por receptores acoplados a proteínas G siguen siendo un desafío pendiente en la señalización celular. Aquí, los biosensores de transferencia de energía por resonancia (FRET) de Förster se han desarrollado mediante la unión por pares de un GPCR a péptidos de proteínas G para sondear los cambios conformacionales a concentraciones controladas en células vivas.

Conformaciones GPCR Proteína G-selectivos mide usando sensores FRET en un fluorómetro Ensayo de suspensión de células vivas

La unión a trifosfato de guanosina (GTP) es uno de los primeros eventos en la activación de receptores acoplados a proteína G (GPCR). Este protocolo describe cómo caracterizar farmacológicamente las interacciones específicas de GPCR-ligando mediante la monitorización de la unión del análogo de GTP marcado con radio, [35S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPγS), en Respuesta a un ligando de interés.

Medición de la señalización del receptor acoplado a la proteína G mediante unión de GTP marcada con radio

Se presenta un procedimiento para visualizar las actividades de proteína quinasa A en ratones que se fijan en la cabeza y se comportan. Un reportero mejorado de actividad de A-quinasa, tAKAR, se expresa en las neuronas corticales y se hace accesible para la toma de imágenes a través de una ventana craneal. La microscopía por imágenes de por vida de fluorescencia de dos fotones se utiliza para visualizar las actividades de PKA in vivo durante la locomoción forzada.

Visualización de la proteína quinasa Una actividad en ratones de trabajo fijos en la cabeza utilizando la microscopía de imágenes de por vida con fluorescencia de dos fotones in Vivo

Los cambios morfológicos ocurren en las células de fibroblastos inmune sensibles después de la activación y promueven alteraciones en el reclutamiento celular. Utilización de imágenes de 2 fotones junto con una proteína específica de fibroblastos de ingeniería genética 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) línea de ratón y verde fluorescently etiquetado lipopolysaccharide-FITC, podemos ilustrar la absorción altamente específica de lipopolisacárido en fibroblastos dérmicos y cambios...

In Vivo 2-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Debido a la baja relación señal-ruido (SNR) inherente de los sensores basados en transferencia de energía de resonancia Fӧrster (FRET), la medición de señales cAMP ha sido un desafío, especialmente en tres dimensiones espaciales. Aquí, describimos una metodología de imagen y análisis FRET hiperespectral que permite la medición de la distribución de cAMP en tres dimensiones espaciales.

Medición de distribuciones de cAMP tridimensionales en células vivas utilizando imágenes y análisis FRET hiperespectrales de 4 dimensiones (x, y, z y λ)

La imagen in vivo es una herramienta poderosa para el estudio de la biología en la salud y la enfermedad. Este protocolo describe imágenes transpupilares de la retina del ratón con un microscopio estándar de dos fotones. También demuestra diferentes métodos de imagen in vivo para etiquetar fluorescentemente múltiples cohortes celulares de la retina.

Imágenes transpupilares de dos fotones in vivo de la retina del ratón

La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) permite obtener imágenes sin etiquetas de biomoléculas en función de su vibración intrínseca de enlaces químicos específicos. En este protocolo, se describe la configuración instrumental de un SRS integrado y un microscopio de fluorescencia de dos fotones para visualizar las estructuras celulares en la médula espinal de ratones vivos.

In vivo Imágenes de tejidos biológicos con fluorescencia combinada de dos fotones y microscopía de dispersión Raman estimulada

Aprende a cuantificar interacciones de proteínas G en células vivas mediante microscopía de dos fotones con resolución espectral. Este método permite obtener mapas de eficiencia FRET a nivel de píxel.

En la cuantificación in vivo de interacciones de proteínas G del receptor acoplado con espectralmente resuelve de dos fotones de Microscopía (Video) | JoVE Journal

En la cuantificación in vivo de interacciones de proteínas G del receptor acoplado con espectralmente resuelve de dos fotones de Microscopía

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