En la cuantificación in vivo de interacciones de proteínas G del receptor acoplado con espectralmente resuelve de dos fotones de Microscopía

El objetivo general del siguiente experimento es determinar la información métrica y estructural de la proteína stoia. Todos los complejos de ligamentos que expresan células biológicas vivas, las células de levadura, están genéticamente modificadas para expresar las proteínas de interés unidas a una sonda fluorescente donante o aceptora. Las sondas donantes pueden ser excitadas directamente por un láser.

Mientras que los aceptores solo pueden ser excitados a través de una transferencia de energía de un donante excitado cercano, las células están expuestas a la luz de un láser pulsado de infrarrojo cercano. La inseminación fluorescente de las sondas se separa en sus componentes espectrales mediante una rejilla de transmisión y se proyecta sobre la superficie de una matriz CCD de multiplicación de electrones. Por lo tanto, se obtienen espectros fluorescentes completos de forma individual, todos los ligamentos para cada posición en la muestra.

El perfil espectral de la fluorescencia detectada depende de la interacción específica de las proteínas de interés. Los datos se analizan para determinar, para cada píxel de la imagen de una célula de escaneo, las emisiones separadas de las sondas donante y aceptora. La eficiencia de la transferencia de energía se determina en cada píxel de la imagen, y luego los píxeles se doblan de acuerdo con su eficiencia de traste e histograma.

La interpretación del histograma permite la determinación in vivo de la proteína, el tamaño del complejo y la configuración. Hola, mi nombre es Michael Stoneman del Grupo de Investigación Riku de la Universidad de Wisconsin Milwaukee. Mi nombre es Singh.

Soy de Rikus Lab en Wisconsin, Milwaukee. La principal ventaja de esta técnica es que los perfiles de emisión completos de cientos de todos los complejos de ligamentos dentro de una célula se obtienen con un escaneo completo de la célula. Por lo general, la mayoría de los métodos de microscopía de fluorescencia requieren que la celda de interés se escanee varias veces para acumular suficiente información espectral para determinar la eficiencia del traste en varias regiones de interés dentro de la celda.

Sin embargo, las reacciones bioquímicas de difusión pueden cambiar la composición molecular de estas regiones de interés y, por lo tanto, limitar la información obtenida en el escaneo de la imagen. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de las proteínas, la interacción de las proteínas en las células vivas, como ¿cuál es el tamaño del daño de los oligómeros? ¿En qué etapa del ciclo de vida de la proteína se cultivan los oligómeros y cuál es el papel del oligómero de esta proteína en la función celular?

El fotomicroscopio de dos resoluciones espectrales acumula información espectral sobre los complejos de olima en la celda de la imagen mediante el escaneo del foco del haz de excitación a través de la muestra de interés en una serie de ubicaciones. Se utiliza un par de espejos de escaneo ortogonales para trasladar el foco del rayo láser a través de la muestra en dos direcciones diferentes. El movimiento de los espejos de escaneo está controlado por computadora y sincronizado con la extracción de datos de intensidad de fluorescencia de la cámara CCD de los escaneos lineales, se pueden reconstruir los mapas espaciales de intensidad de fluorescencia correspondientes a una longitud de onda de luz particular.

Con el fin de reconstruir con precisión los mapas espaciales de intensidad fluorescente de rayos X y calcular la longitud de onda real correspondiente a cada uno de estos mapas, el protocolo de escaneo lineal debe calibrarse utilizando una solución de fluoresceína. Para comenzar el procedimiento de calibración, envíe al espectro de excitación a una longitud de onda de 800 nanómetros, que es dos veces la longitud de onda de excitación máxima de la etiqueta donante GFP dos dos para enviar al espectro de excitación, traslade el prisma ubicado dentro de la cavidad láser para modificar la dispersión de la velocidad de grupo utilizando el programa informático al que está interconectada la cámara. Envíe un comando al chip CCD para bajar la temperatura del chip CCD a su temperatura más baja posible.

Con el fin de reducir el ruido oscuro. Pipetear 10 microlitros de solución de fluoresceína en una cubierta de portaobjetos de microscopio con un cubreobjetos de modo que una capa delgada de la muestra se disperse uniformemente en la región entre el cubreobjetos y el portaobjetos del microscopio, coloque una pequeña gota de aceite de inmersión en la superficie del cubreobjetos. Ahora sujete el microscopio, deslícelo a la etapa de traducción XY, Z y traslade el portaobjetos y la etapa en la dirección del eje óptico Ajustando manualmente el actuador lineal, traslade el portaobjetos hasta que el objetivo del microscopio entre en contacto con la gota de aceite de inmersión, cambie la cámara a un modo de video de adquisición de datos para que la luz admitida que incide en la matriz CCD se muestre en la pantalla de la computadora en tiempo real.

Apague todas las luces ambientales de la habitación para disminuir el ruido de fondo detectado en la matriz CCD. Ajuste lentamente el micrómetro que controla la etapa de traslación en la dirección del eje óptico para llevar la muestra al punto focal del rayo láser. Cuando la muestra de fluoresceína está enfocada, la emisión aparecerá como una línea nítida en la matriz CCD.

Descargue la lectura de las intensidades de píxeles de la matriz CCD en la computadora. Mida la intensidad de los píxeles en función de la posición en la matriz CCD abriendo la matriz descargada de valores de intensidad en la imagen J y dibujando una línea a través de la región fluorescente. Utilice el comando día de la imagen.

Analice el perfil de la gráfica para crear una gráfica que ilustre el espectro de emisión de la muestra de fluoresceína. Ajuste el parámetro incremental del espejo, que controla el movimiento del láser. Enfoque en la dirección Y, de modo que las posiciones y adyacentes dentro de la muestra den como resultado el movimiento del pico de los espectros fluorescentes exactamente un píxel a lo largo de la dimensión espectral en la matriz CCD.

Para monitorizar esto, descargue la intensidad de los espectros de fluoresceína para dos posiciones Y diferentes en la muestra. A continuación, abra las imágenes de intensidad con la imagen J y encuentre la posición máxima de los píxeles para cada uno de los espectros fluorescentes. Usando el cursor de la imagen J, dejando el obturador del CCD abierto, escanee el enfoque láser a través de la muestra en la dirección X.

La luz emitida por cada vóxel a lo largo de la línea de escaneo debe caer incidente sobre la matriz CCD al final de cada escaneo en línea, almacenar los datos de la matriz CCD obtenidos para este escaneo en línea y luego borrar los píxeles de la matriz CCD. Mueva la posición del láser. Enfoque en la dirección Y en la cantidad determinada anteriormente.

A continuación, escanee el rayo láser en la dirección X a través de la muestra. Una vez más, dejando abierto el obturador del CCD almacenamos los datos. Repita este procedimiento de escaneo de líneas hasta que la luz láser haya iluminado un área física aproximadamente un 50% más grande que las dimensiones de una sola celda biológica.

La relación entre el número de fila de una imagen de escaneo lineal en particular y la longitud de onda debe usarse para reconstruir las imágenes para obtener múltiples mapas faciales de intensidades fluorescentes de la ex esposa en diferentes longitudes de onda. Para obtener la imagen fluorescente de la ex esposa para una longitud de onda en particular, busque el número de fila en la imagen obtenida del escaneo de primera línea que corresponde a esta longitud de onda. A continuación, la fila adyacente de la imagen de escaneo lineal siguiente corresponde a la siguiente fila de la imagen de emisión fluorescente.

Para esa longitud de onda en particular, apile todas las filas de imágenes que corresponden a esta longitud de onda para obtener los mapas espaciales de intensidad fluorescente XY de la muestra en esa longitud de onda. Repita este procedimiento para todas las demás longitudes de onda obtenibles para recopilar datos en sus muestras. Primero, retire de la incubadora las placas con colonias de levadura transformadas.

Debe haber al menos tres tipos de células transformadas. Células que expresan las proteínas de interés marcadas con ambos tipos de sondas fluorescentes. Células que expresan solo proteínas marcadas con las sondas fluorescentes del donante y células que expresan solo proteínas marcadas con las sondas fluorescentes aceptoras.

Agregue 100 microlitros de cloruro de potasio de 100 milimolares a un tubo de microcentrífuga. Luego, con una punta de micropipeta, raspe de tres a cinco colonias de levadura de la placa de células que expresan proteínas marcadas con sondas donantes y fluorescentes y un inoculado el cloruro de potasio de 100 milimolares. Con estas células, retire 10 microlitros de la suspensión celular y dispense en un microscopio nuevo. Diapositiva.

Cubra la gota con un cubreobjetos y coloque una gota de aceite en la superficie del cubreobjetos. A continuación, cierre manualmente el obturador en la trayectoria del rayo láser para bloquear la luz láser y evitar que llegue al objetivo del microscopio. Fije el portaobjetos del microscopio a la etapa de traslación XY, Z y traslade la platina del portaobjetos en la dirección del eje óptico hasta que el objetivo del microscopio entre en contacto con la gota de aceite de inmersión.

Ahora encienda la iluminación de luz de campo amplio y vaya a la cámara. Modo de vídeo de recogida de datos. La imagen de campo amplio de la muestra será muy borrosa debido a la presencia de la rejilla de transmisión en el trayecto de emisión.

Por lo tanto, coloque un filtro de paso de banda con un pequeño ancho completo medio máximo en la ruta óptica que precede a la rejilla de transmisión. Transfiera lentamente la etapa de traslación en la dirección del eje óptico mientras visualiza la imagen de las células en la pantalla de la cámara hasta que las células se enfoquen. Transfiera la etapa en la dirección X o Y para llevar una sola celda a la ubicación del foco del rayo láser.

Apague la fuente de iluminación de campo amplio y retire el filtro de trayectoria de banda de la ruta de emisión. Desbloquee el rayo láser durante un breve período de tiempo mientras visualiza simultáneamente la señal recibida en la matriz CCD. Si se detecta una señal fluorescente en la matriz CCD durante el tiempo en que el rayo láser incide sobre la celda, realice un escaneo completo de adquisición de datos fluorescentes de esta celda.

Es vital utilizar los mismos parámetros de escaneo, específicamente el número de líneas y el por qué incremento, según lo determinado en el procedimiento de calibración demostrado anteriormente. Repita el proceso de adquisición de datos de fluorescencia y localización celular para un gran número de células que expresan proteínas adheridas a las etiquetas donantes y aceptoras. Después de acumular suficientes imágenes de fluorescencia de células que expresan proteínas marcadas con ambos receptores, repita todo el proceso para ambas células que expresan solo proteínas marcadas con las sondas fluorescentes donantes, y células que expresan solo proteínas marcadas con las sondas fluorescentes aceptoras.

Finalmente, reconstruya todos los escaneos para obtener una resolución espectral. Los mapas espaciales de intensidad fluorescente XY para cada conjunto de datos utilizando el procedimiento descrito anteriormente ilustrado en estas tres figuras son los mapas espaciales resultantes calculados a partir de dos mediciones de microscopía de fotones resueltas espectralmente realizadas en una célula de levadura que expresa el receptor estéril a factor alfa. Se obtuvieron mapas bidimensionales de las señales donantes y aceptoras a partir del análisis de los perfiles de emisión espectral obtenidos de cada ubicación de la célula.

A las intensidades de fluorescencia se les asignan colores falsos de acuerdo con sus valores, y la escala se muestra como un recuadro. A continuación, se calculó un mapa bidimensional de las eficiencias aparentes de los trastes utilizando las imágenes KDA y KAD, utilizando los valores extraídos del mapa de eficiencias aparentes de los trastes de la celda que se acaba de mostrar, se preparó un gráfico de histograma. Los valores EAPP medidos de la celda se representan mediante círculos.

La línea continua roja representa el mejor ajuste a los datos medidos utilizando la suma de las funciones individuales del calcio representadas por líneas verdes continuas. El análisis del histograma, que se describe en el texto del protocolo, confirma que el complejo estéril de dos receptores de factores alfa asume la forma de un tetrámero en forma de RBA in vivo. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 12 horas si se realiza correctamente.

Al realizar este experimento, es importante mantener baja la potencia de la fuente de excitación. Es importante evitar la excitación múltiple del donante por un solo pulso.