El uso de diacetato de carboxifluoresceína Ester succinimidil (CFSE) para controlar la proliferación de linfocitos
October 12th, 2010
CFSE etiquetas covalentemente moléculas de larga vida intracelular con el colorante fluorescente, carboxifluoresceína. Por lo tanto, cuando una célula se divide CFSE marcado, todos sus descendientes tienen la mitad de la cantidad de fluorescencia, que de ese modo se puede utilizar para evaluar la división celular. En este artículo se describen los procedimientos normalmente utilizados para el etiquetado de linfocitos de ratón con CFSE.
El objetivo general de este experimento es marcar los linfocitos con el colorante fluorescente intracelular, CFSE, de modo que los linfocitos puedan ser monitoreados para la división celular mediante citometría de flujo. Esto se logra mezclando linfocitos con CFDA se, que es la forma diacetil de CFSE. Los dos grupos acetilo permiten que el colorante ingrese rápidamente a las células dentro de los linfocitos.
Las esterasas eliminan los grupos acetilo del C-F-D-A-S-E, formando la forma CFSE del colorante. Sin los grupos acetilo, el CFSE se vuelve fluorescente y también es menos permeante a la membrana, concentrando así el tinte dentro de las células. La cadena lateral amino-reactiva AL de la CFSE acopla covalentemente el colorante a las proteínas intracelulares, lo que hace que las células sean fluorescentes casi permanentemente.
La CFSE se puede utilizar para controlar la división de los linfocitos en función de la intensidad secuencial de fluorescencia de las células hijas. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la incorporación de timidina tritiada, es que se puede monitorizar la división celular de células individuales. El encargado de demostrar el procedimiento estará a cargo de Ben Qua, un investigador de mi laboratorio para etiquetar las células.
Comience con linfocitos recién aislados del bazo o de los ganglios linfáticos de ratones y agregue una concentración de entre medio y 10 millones de células por mililitro de medio de cultivo, suplementado con 5% de calor. El suero fetal de ternero inactivado resuspende completamente las células y transfiere cuidadosamente un mililitro al fondo de un tubo cónico nuevo de 10 mililitros. Coloque el tubo horizontalmente con cuidado.
Agregue 110 microlitros de PBS a la parte superior del tubo en la parte no mojada del plástico, asegurándose de que no entre en contacto con la solución celular. Agregue una solución de tinte fresca de 1,1 microlitros de los cinco milimolares de C-F-D-A-S-E a los 110 microlitros de PBS. Tape rápidamente el tubo e invierta bien el vórtice para obtener una mezcla rápida y uniforme de las soluciones, ya que el tinte se vuelve fluorescente y, por lo tanto, propenso al blanqueo.
Proteja el tubo de la luz cubriéndolo con papel de aluminio. Incubar las células durante cinco minutos a temperatura ambiente, lavar las celdas diluyendo en 10 volúmenes de 20 grados centígrados, sedimentando el PBS que contiene 5%H-I-F-C-S por centrifugación a 300 Gs durante cinco minutos a 20 grados centígrados y desechar el sobrenadante. Repite el lavado dos veces más.
A continuación, las células se pueden aplicar a un protocolo de interés para la inducción de la división celular. Las células marcadas se pueden utilizar tanto en ensayos in vitro como in vivo. Al finalizar el ensayo de proliferación, las células se recolectan y se analizan mediante citometría de flujo.
En este ejemplo, el marcaje CFSE se utiliza in vitro para medir cómo responden las células T de ratones transgénicos modificados genéticamente a las células dendríticas pulsadas con diferentes concentraciones de antígeno. Los picos de dilución de CFSE sin sombreado representan células T CD ocho positivas transgénicas que se han dividido de una a tres veces. Se puede ver que más células T se dividen a las concentraciones más altas del antígeno.
El método de marcaje CFSE también es susceptible de ensayos in vivo como los experimentos de transferencia adoptiva. En este caso, el fax se utiliza para identificar la población de células T que son de interés en los ratones receptores. Un perfil de proliferación de CFSE posterior muestra células T CD ocho positivas que se han dividido de una a seis veces en función de los picos de dilución de CFSE después de su desarrollo.
Este procedimiento allanó el camino para que los investigadores y la inmunología exploraran la proliferación de linfocitos durante una respuesta inmunitaria.
Visión general
Este artículo describe el procedimiento para etiquetar linfocitos de ratón con el tinte fluorescente CFSE, permitiendo el monitoreo de la división celular mediante citometría de flujo. El método permite a los investigadores rastrear la proliferación de linfocitos durante las respuestas inmunes.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Biología celular
- Citometría de flujo
Antecedentes
- CFSE es un tinte fluorescente utilizado para etiquetar proteínas intracelulares.
- Permite la evaluación de la división celular mediante la medición de la dilución de la fluorescencia en las células hijas.
- Esta técnica ofrece ventajas sobre los métodos tradicionales como la incorporación de timidina tritiada.
- El etiquetado CFSE puede aplicarse tanto en ensayos in vitro como in vivo.
Propósito del estudio
- Demostrar la técnica de etiquetado CFSE para monitorear la división de linfocitos.
- Proporcionar un protocolo detallado para que los investigadores sigan.
- Destacar la aplicación de CFSE en el estudio de las respuestas de células T a antígenos.
Métodos utilizados
- Aislamiento de linfocitos del bazo o los ganglios linfáticos del ratón.
- Mezcla de linfocitos con CFDA SE para facilitar la entrada del tinte.
- Incubación y lavado de células para eliminar el exceso de tinte.
- Análisis de citometría de flujo para evaluar la división celular basándose en la dilución de CFSE.
Resultados principales
- El etiquetado CFSE permite el seguimiento de la división de células T en respuesta a diferentes concentraciones de antígeno.
- La citometría de flujo revela picos distintos correspondientes a diferentes niveles de división de células T.
- El método es efectivo tanto para aplicaciones in vitro como in vivo.
- Los resultados demuestran la utilidad de CFSE en la investigación inmunológica.
Conclusiones
- El etiquetado CFSE es un método confiable para estudiar la proliferación de linfocitos.
- Esta técnica mejora la comprensión de las respuestas inmunes.
- Los investigadores pueden utilizar este método para varios diseños experimentales.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
CFSE labeling enables precise tracking of lymphocyte proliferation, supporting target validation in immunology-focused drug discovery. By quantifying division at single-cell resolution, it de-risks mechanistic hypotheses and informs go/no-go decisions in early discovery. The method’s compatibility with multi-color flow cytometry enhances assay scalability and cross-functional data integration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring antigen-driven T cell division in response to varying stimulus concentrations.
- Operational Value: Provides quantitative, single-cell readouts that clarify pathway activation and functional target engagement.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing biologically active compounds from inert controls based on proliferation profiles.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, low-variance fluorescent labeling compatible with high-throughput flow cytometry workflows.
- Reproducibility: Enables consistent detection of up to eight division cycles, supporting assay qualification across sites and operators.
- Multiplexing Capacity: Integrates with other fluorochromes for simultaneous phenotyping and functional readouts in complex immune assays.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models antigen-specific T cell responses applicable to vaccine, autoimmune, and oncology indications.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo validation via adoptive transfer models, preserving proliferation tracking fidelity.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs preclinical go/no-go decisions by correlating proliferation depth with mechanistic potency and target modulation.
Pipeline & Workflow Integration
CFSE labeling functions as a discovery-phase tool that connects hypothesis testing in early immunology to lead optimization through quantifiable proliferation metrics.
- Discovery Biology: Tests mechanistic hypotheses by linking antigen exposure to lymphocyte division kinetics, reducing ambiguity in target function.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence dilution data enabling reliable comparison of test conditions across compound libraries.
- Analytics: Generates resolvable flow cytometry peaks corresponding to division cycles, supporting statistical comparison of proliferation indices.
- Translational Research: Enables continuity from reductionist in vitro assays to physiologically relevant in vivo models without re-labeling or assay redesign.
- Enterprise Reuse: Serves as a modular, plug-and-play labeling platform applicable across multiple immune cell types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving individual cell division histories obscured in bulk assays.
- Operational Value: Ensures assay standardization through covalent, stable labeling with minimal technical variance and no requirement for radioactive handling.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by confirming target-mediated biological activity early in the discovery cascade.
- Portfolio Impact: Enables objective, data-driven prioritization of immunomodulatory candidates based on proliferation efficacy and specificity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile cell handling, flow cytometry compensation, and fluorescence interpretation to avoid artifacts from dye quenching or aggregation.
- Dependent on access to calibrated flow cytometers with appropriate laser and filter sets for FITC-channel detection.
- Necessitates standardized washing protocols to remove extracellular dye and ensure signal specificity to intracellularly retained CFSE.
- Must account for potential dye toxicity at high concentrations or prolonged incubation, though source notes low toxicity under standard conditions.
- Requires light protection during staining and handling to prevent photobleaching and maintain signal integrity.
