Name: Las sinapsis cuantificar: un ensayo basado en inmunocitoquímica para cuantificar número de sinapsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-16T17:30:00.000+00:00
Duration: 18 min 11 s
Description: Aprende a cuantificar sinapsis mediante inmunocitoquímica en cultivos neuronales y tejido cerebral. Este protocolo utiliza marcadores pre y postsinápticos con análisis de colocalización para estudiar conectividad sináptica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

En el laboratorio de Ben A. Barres (Stanford University).: Puntos lagrimales Plug-in para la imagen J fue escrito por Barry Wark (Consultoría Physion dirección actual) Analizador Financiación; <ul><li> Alfred P. Sloan Foundation </li><li> El A. Esther y José Klingenstein Fund Inc., </li><li> Fundación Broad Investigación Biomédica </li><li> Cura para la Iniciativa de la Enfermedad de Huntington s </li></ul>

<ol><li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological%2C+morphological%2C+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li>
<li>Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+signaling+interactions+that+promote+the+survival+and+growth+of+developing+retinal+ganglion+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture.</a> Neuron. 15, 805-819 (1995).</li>
<li>Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gabapentin+receptor+alpha2delta-1+is+a+neuronal+thrombospondin+receptor+responsible+for+excitatory+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis.</a> Cell. 139, 380-392 (2009).</li>
<li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277, 1684-1687 Forthcoming.</li>
<li>Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+synapse+number+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of synapse number by glia.</a> Science. 291, 657-661 (2001).</li>
<li>Christopherson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li>
<li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+and+postnatal+development+of+retinocollicular+projections+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse.</a> J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).</li>
<li>Schmidt, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+retinotopic+connections%3A+selective+stabilization+by+an+activity-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).</li>
<li>Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+changes+in+arborization+patterns+of+murine+retinocollicular+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons.</a> J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).</li>
<li>Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+regulate+inhibitory+synapse+formation+via+Trk-mediated+modulation+of+postsynaptic+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors.</a> J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).</li>
<li>Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+secreted+proteins+selectively+increase+hippocampal+GABAergic+length%2C+branching+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Moll.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis.</a> Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).</li>
</ol>

El ensayo de sinapsis se ha descrito anteriormente se basa en el contexto de nuestros objetivos experimentales, en el que nos centramos principalmente en las proyecciones de excitación de la CGR, ya sea en la cultura purificada o en la sección del cerebro. Hemos proporcionado un listado de anticuerpos tabla de referencia que funcionan bien para el etiquetado de las sinapsis excitadoras (Tabla 1). Este ensayo sinapsis pueden ser adaptados para cuantificar el número de sinapsis de una població...

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Antígeno </td><td> Especies </td><td> Monoclonal / policlonales </td><td> Vendedor </td><td> Número de catálogo </td><td> Dilución </td><td> Obras en Cultura </td><td> Obras en las secciones </td></tr><tr><td rowspan="10"> Presináptica </td><td> Sinapsina </td><td> Conejo </td><td> Policlonal </td><td> Sistemas de Synaptic </td><td> 106004 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Sinapsina </td><td> Ratón </td><td> Monoclonales </td><td> Sistemas de Synaptic </td><td> 106001 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Fagot </td><td> Ratón </td><td> Monoclonales </td><td> Diseño del ensayo </td><td> VAM-PS003F </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Fagot </td><td> Conejillo de Indias </td><td> Policlonal </td><td> Sistemas de Synaptic </td><td> 141004 </td><td> 1:1000 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Sinaptotagmina 1 </td><td> Conejo </td><td> Policlonal </td><td> Sistemas de Synaptic </td><td> 105002 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> Sinaptobrevina 2 (C1.69.1) </td><td> Ratón </td><td> Monoclonales </td><td> Sistemas de Synaptic </td><td> 104211 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Sinaptofisina (C1.7.2) </td><td> Ratón </td><td> Monoclonales </td><td> Sistemas de Synaptic </td><td> 101011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> Ratón </td><td> Monoclonales </td><td> Millipore </td><td> MAB5502 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> Conejillo de Indias </td><td> Policlonal </td><td> Millipore </td><td> AB5905 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut2 </td><td> Conejillo de Indias </td><td> Policlonal </td><td> Millipore </td><td> AB2251 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td rowspan="6"> Postsinápticos </td><td> PSD-95 (6G6-1C9 clon) </td><td> Ratón </td><td> Monoclonales </td><td> Afinidad Bio Reactivos </td><td> MA1-045 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> PSD-95 </td><td> Conejo </td><td> Policlonal </td><td> Zymed </td><td> 51-6900 </td><td> 1:500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> Homer </td><td> Ratón </td><td> Monoclonales </td><td> Sistemas de Synaptic </td><td> 160011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Homer </td><td> Rata </td><td> Policlonal </td><td> Millipore </td><td> AB5875 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> Conejo </td><td> Policlonal </td><td> Sistemas de Synaptic </td><td> 147003 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> Ratón </td><td> Monoclonales </td><td> Sistemas de Synaptic </td><td> 147 </td><td> 1:200 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr></tbody></table> Tabla 1: lista de ejemplos de buenos marcadores pre-y post-sinápticas que se han utilizado con éxito en nuestro ensayo sinapsis. Tenga en cuenta que esto no es una lista exhaustiva de todas las marcas disponibles. Y = Sí, N = No, ND = no determinado. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Gato. No. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 20012-027 </td></tr><tr><td> poli-D-lisina </td><td> Sigma </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminina </td><td> Cultrex </td><td> 3400-010-01 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Roche Diagnostics GmbH </td><td> 9002-93-1 </td></tr><tr><td> Suero normal de cabra </td><td> Gibco </td><td> 16210 </td></tr><tr><td> Vectashield con DAPI </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-1200 </td></tr><tr><td> Octubre </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Tris-base (50 mM) </td><td> Pescador </td><td> BP152-5 </td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino </td><td> Sigma </td><td> A2153 </td></tr><tr><td> l-lisina </td><td> Sigma </td><td> L-1137 </td></tr><tr><td> 16% PFA solución </td><td> Microscopía electrónica de Ciencias </td><td> 15711 </td></tr><tr><td> Granular PFA </td><td> Microscopía electrónica de Ciencias </td><td> 19210 </td></tr><tr><td> De 24 pocillos placa </td><td> Halcón </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> Cabra anti-ratón conjugado con anticuerpos Alexa </td><td> Invitrogen </td><td> --- </td></tr><tr><td> Suministro </td><td> Empresa </td><td> Gato. No. </td></tr><tr><td> 12 mm, n º 0 de vidrio cubreobjetos </td><td> Karl Hecht Gmbh </td><td> 1105209 </td></tr><tr><td> No. 1.5 cubreobjetos de vidrio (para cortes) </td><td> VWR Ciencia </td><td> 48393241 </td></tr><tr><td> Portaobjetos de vidrio </td><td> VWR Ciencia </td><td> 48311-703 </td></tr></tbody></table>

las sinapsis cuantificar: un ensayo basado en inmunocitoquímica para cuantificar número de sinapsis

Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number

Uno de los objetivos más importantes de la neurociencia es comprender las señales moleculares que dan instrucciones a las primeras etapas de la formación de sinapsis. Como tal, se ha convertido en imprescindible para desarrollar métodos objetivos para cuantificar los cambios en la conectividad sináptica. A partir de la fijación de la muestra, este protocolo detalles de cómo cuantificar el número de sinapsis en cultivos neuronales disociadas y en las secciones del cerebro utilizando inmunocitoquímica. Utilizando anticuerpos específicos contra el compartimiento, que etiqueta los terminales presinápticos, así como los sitios de especialización post-sináptica. Se define como puntos de sinapsis de colocalización entre las señales generadas por estos marcadores. El número de estos colocalizations se cuantifica mediante un enchufe en el Analizador de puntos lagrimales (escrito por Bary Wark, disponibles bajo petición, c.eroglu cellbio.duke.edu @) en la plataforma de software ImageJ análisis. El ensayo de sinapsis se describe en este protocolo se puede aplicar a cualquier tejido neural preparación o la cultura para los que tiene marcadores selectivos de pre-y post-sinápticas. Este ensayo sinapsis es una herramienta valiosa que puede ser ampliamente utilizada en el estudio del desarrollo sináptico.

Este protocolo detalla la forma de cuantificar el número de sinapsis en cultivos neuronales disociadas y en las secciones del cerebro utilizando inmunocitoquímica. Utilizando anticuerpos específicos contra el compartimiento, que etiqueta los terminales presinápticos, así como los sitios de especialización post-sináptica. Se define como puntos de sinapsis de colocalización entre las señales generadas por estos marcadores.

Las sinapsis cuantificar: un ensayo basado en inmunocitoquímica para cuantificar número de sinapsis

Uno de los objetivos más importantes de la neurociencia es comprender las señales moleculares que instruyen las etapas tempranas de la formación de las sinapsis. Como tal, se ha vuelto...

Uno de los objetivos más importantes en neurociencia es comprender las señales moleculares que dirigen las etapas iniciales de la formación de sinapsis. Por ello, se ha vuelto imprescindible desarrollar enfoques objetivos para cuantificar los cambios en la conectividad sináptica. Para cuantificar el número de sinapsis en diversas preparaciones experimentales, se tiñen neuronas cultivadas o preparaciones de secciones criostáticas de tejido cerebral con marcadores sinápticos pre y postsinápticos selectivos, con el fin de etiquetar los puntos de contacto sináptico entre neuronas.A continuación, las células o el tejido se observan mediante microscopía de fluorescencia y se requieren imágenes de ocho bits para cada uno de los canales correspondientes a los dos marcadores inmunohistoquímicos. Las imágenes se analizan utilizando ImageJ 1.29 con el analizador de puntos. Para determinar el grado de colocalización entre los marcadores presinápticos y postsinápticos, los puntos de colocalización pueden utilizarse entonces para determinar el número de sinapsis presentes en la preparación.La principal ventaja de la técnica descrita aquí frente a métodos existentes como la microscopía electrónic

quantifying-synapses-an-immunocytochemistry-based-assay-to-quantify

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

La abundancia de receptores de neurotransmisores en las sinapsis agrupadas influye fuertemente en la fuerza sináptica. Este método cuantifica marcadas con fluorescencia receptores de neurotransmisores en tres dimensiones con una sola sinapsis resolución...

La cuantificación automática de la fluorescencia en el Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Este video muestra imágenes de células vivas de la topología inmunológica de la sinapsis, investigando las interacciones entre los linfocitos T y las células epiteliales portadoras de antígenos fluorescentes. La microscopía de fluorescencia revela un desplazamiento rojo del citoplasma y anillos amarillos en la membrana de las células endoteliales, lo que indica la formación de sinapsis inmunológicas.

Evaluación de la topología de la sinapsis inmunológica a través de imágenes de células vivas

Este video muestra la tinción de inmunofluorescencia de un corte de cerebro de ratón para cuantificar la distribución de una proteína presináptica específica. El proceso consiste en el bloqueo de sitios inespecíficos, la aplicación de anticuerpos primarios para la proteína diana y un marcador de referencia, seguido de un marcaje de anticuerpos secundarios y una contratinción nuclear. El marcador de referencia garantiza una cuantificación precisa al proporcionar una línea de base consistente, y...

Cuantificación de la distribución de una proteína presináptica en el cerebro de ratón mediante inmunofluorescencia

Fuente: McLeod, F., et al. Evaluación de la densidad de sinapsis en cortes de cerebro de roedores hipocampales. J. Vis. Exp. (2017). Este video muestra un método para visualizar marcadores sinápticos en cortes de cerebro del hipocampo utilizando el análisis de inmunofluorescencia confocal. Los cortes se inmunotiñen con anticuerpos primarios dirigidos a marcadores presinápticos y postsinápticos, seguidos de anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos. A continuación, los marcadores...

Análisis microscópico de sinapsis en cortes de hipocampo de ratón mediante inmunofluorescencia

Aquí, describimos un completo flujo de trabajo para el análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmunes entre las células de T humanas primarias y células presentadoras de antígeno. El método se basa en imágenes por citometría de flujo, que permite la adquisición y evaluación de varias imágenes de miles de células en un período relativamente corto de tiempo.

Análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmune en el sistema humano utilizando imágenes de citometría de flujo

Un protocolo para identificar con precisión y analizar sinapsis en rebanadas hippocampal mediante inmunofluorescencia se describe en este artículo.

Evaluación de la densidad de sinapsis en rebanadas de hipocampo cerebral de roedor

Describimos un análisis óptico para la vesícula sináptica (SV) reciclado en neuronas cultivadas. Combinar este protocolo con doble transfección para expresar un marcador presináptico y la proteína de interés nos permite localizar sitios presinápticos, su vesícula sináptica capacidad de reciclaje y determinar el papel de la proteína de interés.

Un análisis óptico para el reciclaje de la vesícula sináptica en neuronas cultivadas Overexpressing proteínas presinápticas

Aquí, describimos un enfoque cuantitativo para determinar la distribución de una proteína sináptica en relación con un marcador proteico utilizando tinción de inmunofluorescencia, microscopia confocal y análisis basados en computadoras.

Cuantificar la distribución heterogénea de una proteína sináptica en el cerebro de ratón mediante inmunofluorescencia

Este protocolo analiza tanto la formación de la sinapsis inmunológica como el posterior tráfico secretor polarizado posterior hacia la sinapsis inmunológica. Se formaron conjugados celulares entre una célula Raji con pulso de superantígenos (que actúa como una célula que presenta antígenos) y un clon de Jurkat (actuando como un linfocito T auxiliar del efector).

Imagen de la Sinapsis Inmunológica Humana

DetectSyn es un ensayo fluorescente rápido e imparcial que mide los cambios en el número relativo de sinapsis (compromiso pre y postsináptico) en todos los tratamientos o estados de enfermedad. Esta técnica utiliza una técnica de ligadura de proximidad que se puede utilizar tanto en neuronas cultivadas como en tejido fijo.

DetectSyn: un método fluorescente rápido e imparcial para detectar cambios en la densidad de la sinapsis

Aquí presentamos dos protocolos para cuantificar el envolvimiento microglial de sinapsis positivas para vGLUT1 y sinaptosomas crudos marcados con pHRodo Red mediante citometría de flujo.

Cuantificación de la envolvimiento microglial de material sináptico mediante citometría de flujo

Aprende a cuantificar sinapsis mediante inmunocitoquímica en cultivos neuronales y tejido cerebral. Este protocolo utiliza marcadores pre y postsinápticos con análisis de colocalización para estudiar conectividad sináptica.

Las sinapsis cuantificar: un ensayo basado en inmunocitoquímica para cuantificar número de sinapsis

Explorar más videos