Las sinapsis cuantificar: un ensayo basado en inmunocitoquímica para cuantificar número de sinapsis

Uno de los objetivos más importantes en neurociencia es comprender las señales moleculares que dirigen las primeras etapas de la formación de sinapsis. Por ello, se ha vuelto fundamental desarrollar enfoques objetivos para cuantificar los cambios en la conectividad sináptica. Para cuantificar el número de sinapsis en diversas preparaciones experimentales, se tiñen neuronas cultivadas o preparaciones de secciones cerebrales criogenizadas con marcadores selectivos pre y postsinápticos que etiquetan los puntos de contacto sináptico entre neuronas.

A continuación, las células o el tejido se observan mediante un microscopio fluorescente y se requieren imágenes de ocho bits para cada uno de los canales correspondientes a los dos marcadores inmunohistoquímicos. Las imágenes se analizan utilizando ImageJ 1.29 con el analizador de puntos. Para determinar el grado de colocalización entre los marcadores presinápticos y postsinápticos, los puntos de colocalización pueden utilizarse entonces para determinar el número de sinapsis presentes en la preparación.

La principal ventaja de la técnica descrita aquí frente a métodos existentes como la microscopía electrónica es que el ensayo de sinapsis permite un análisis y una cuantificación del número de sinapsis con un rendimiento mucho mayor. Las principales implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico y la terapia de trastornos clínicos como la enfermedad de Alzheimer, la epilepsia o el autismo, en los cuales se ha implicado a anomalías en la conectividad sináptica como base de la patología subyacente. Esta técnica puede utilizarse para identificar formas de intervención que puedan reducir o mejorar las deficiencias que observamos en la capacidad de las neuronas afectadas para formar sinapsis entre sí.

Aunque este método es útil para estudiar el desarrollo cerebral, también puede aplicarse a otros organismos modelo o sistemas de órganos en los que esté interesado en estudiar o cuantificar el número de contactos entre célula y célula, siempre que tenga la capacidad de etiquetar selectivamente cada cara opuesta de cada sitio de contacto. Prepare cultivos neuronales sembrando células ganglionares de la retina de rata purificadas a partir de la retina de rata, obtenidas de animales P cinco a siete, sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-d-lisina. En una placa de 24 pocillos, se permite que las células crezcan a 37 grados Celsius durante tres a cinco días antes de la transfección.

Después de la transfección, incubar las células durante siete u ocho días adicionales para permitir el desarrollo de sinapsis cuando las células sembradas hayan madurado suficientemente. Retirar el medio de cultivo de los pocillos y añadir 500 microlitros de paraformaldehído al 4% precalentado a cada pocillo, fijando durante siete minutos. A temperatura ambiente, tras la fijación, lavar las células tres veces con solución salina tamponada con fosfato.

Es importante asegurarse de que las células nunca se sequen en los pocillos. Una vez que se elimina un tampón de un pocillo, debe reemplazarse inmediatamente por el siguiente tampón. Prepare el tampón de bloqueo que contenga 50% de suero normal de cabra y 0,2% de Triton X-100.

Después de eliminar el PBS de cada pozo, añadir 200 microlitros del tampón de bloqueo a cada pozo y bloquear durante 30 minutos. A temperatura ambiente, eliminar el tampón de bloqueo y enjuagar tres veces. Con PBS, preparar una dilución del anticuerpo primario en tampón de anticuerpo al 90 %, solución de NGS al 10 %, que contenga el par de anticuerpos pre y postsinápticos de elección.

Aquí se utilizan un anticuerpo de conejo antisinapsina, un marcador pre-sináptico, y un anticuerpo de ratón anti-homer, un marcador post-sináptico. Centrifugue la dilución del anticuerpo primario durante cinco minutos a velocidad máxima en una centrífuga de banco para eliminar cualquier anticuerpo precipitado, luego agregue 200 microlitros de solución de anticuerpo primario a cada pozo. Coloque la placa en un recipiente humedecido para evitar el secado de la solución primaria.

Incubar durante la noche a cuatro grados Celsius tras la incubación con el anticuerpo primario. Enjuagar cada pocillo tres veces. Con PBS, añadir 200 microlitros de los anticuerpos secundarios adecuados, diluidos uno a 1000 en tampón para anticuerpos que contiene 10 % NGS preparado.

Como antes, coloque la placa en la cámara humidificada e incube durante dos horas a temperatura ambiente en la oscuridad tras la incubación con los anticuerpos secundarios. Enjuague cada pocillo de tres a cuatro veces con PBS. Coloque una gota de medio de montaje Vector Shield con DPI sobre un portaobjetos de vidrio.

Luego invierta el cubreobjetos con las células sobre la gota para montar. Finalmente, aplique esmalte de uñas transparente alrededor de los bordes del cubreobjetos. Tenga cuidado de evitar mover o desplazar los cubreobjetos durante la aplicación.

Dado que esto compartirá las células, deje secar las laminillas durante al menos 30 minutos en un lugar seco y oscuro. Aquí, la adquisición de imágenes se realiza mediante un microscopio de fluorescencia Zeiss Axio Imager equipado con conjuntos de filtros adecuados y un objetivo de inmersión en aceite de 63 aumentos. Coloque una laminilla que contenga células no transfectadas sobre la platina del microscopio.

Utilizando el conjunto de filtros DPI para visualizar los núcleos celulares, seleccione células que estén a al menos dos diámetros celulares de distancia de sus vecinas más cercanas. El uso de DPI en este paso ayudará a evitar sesgos y garantizará la aleatoriedad en la selección celular. Para cada célula seleccionada, obtenga imágenes de ocho bits utilizando los conjuntos de filtros apropiados, en este caso GFP y Texas Red.

La imagen superpuesta con pseudocolores debe mostrar los marcadores pre y post-sinápticos en rojo y verde, respectivamente. A continuación, coloque una preparación que contenga células transfectadas sobre la platina del microscopio. En este caso, las células han sido transfectadas con un vector de expresión de tomate TD.

Utilice este marcador para seleccionar células como antes. Para cada célula seleccionada, obtenga ocho imágenes de pozos utilizando los conjuntos de filtros apropiados, en este caso GFP, Texas Red y Sci cinco. La imagen superpuesta con pseudocolores debe tener los marcadores post-sinápticos en rojo, verde y azul.

Aquí, el programa analizador de púnticos se utiliza para la cuantificación de púnticos sinápticos co-localizados. El complemento Puncta Analyzer fue escrito por Barry Walk y está disponible previa solicitud en ImageJ 1.26. Abra una de las imágenes recopiladas.

Utilice la herramienta de selección circular para seleccionar una región con un diámetro aproximado al de una célula alrededor de la SOR de interés. Con la región de interés seleccionada, vaya al menú de complementos y seleccione el analizador de perforaciones en la ventana de opciones de análisis que aparece. Seleccione Canal Rojo Canal Verde. Primero reste el fondo y configure el archivo de resultados.

Haga clic en aceptar. A continuación, defina una ubicación en la que guardar los resultados. Estos resultados pueden exportarse a Excel para su posterior análisis en la ventana que aparece.

A continuación, asegúrese de seleccionar un radio de bola rodante de 50 y desactive la opción de fondo blanco. Esta modificación no es obligatoria, pero a menudo es preferida por los usuarios de la aplicación. Para facilitar la visualización, haga clic en aceptar.

Aparecerá una nueva ventana junto con una máscara correspondiente a la imagen del canal rojo. Ajuste el umbral hasta que la máscara roja coincida lo mejor posible con la mayor cantidad de perforaciones individuales discretas, sin introducir demasiado ruido, y haga clic en listo.

Establezca el tamaño mínimo del punto en cuatro píxeles. No modifique nada más. Haga clic en aceptar.

Repita el paso anterior esta vez para el canal verde. Después de repetir esto con el canal verde, el complemento proporcionará la cuantificación correspondiente a los puntos en cada canal por separado y a los puntos co-localizados entre los dos canales. El ensayo de sinapsis mostrado aquí puede aplicarse a secciones criostáticas del cerebro y a cualquier otro tejido del sistema nervioso, como la médula espinal o la retina.

Siempre que exista un par adecuado de marcadores pre y post-sinápticos. Comience por extraer el tejido cerebral de un ratón que haya sido sacrificado mediante exsanguinación y perfusión con PBS. Coloque todo el cerebro en paraformaldehído al 4 % en PBS a cuatro grados Celsius durante la noche; al día siguiente continúe con el procedimiento.

Lave el cerebro tres veces con PBS. Proteja el cerebro mediante congelación colocándolo en sacarosa al 30 % en PBS.

El tejido inicialmente flotará; manténgalo a cuatro grados Celsius hasta que se hunda al fondo. En ese momento, la crioprotección estará completa. A continuación, incruste el cerebro en una solución de dos a uno de sacarosa al 20% en OCT y PBS, en la orientación deseada para el corte.

Por ejemplo, sagital o coronal. A continuación, coloque una superficie metálica plana encima de un recipiente con hielo seco. Coloque el cerebro incluido sobre esta superficie para congelarlo; una vez congelado, transfiera el cerebro a una bolsa hermética y guárdelo a menos 80 grados Celsius durante hasta un año antes de seccionarlo.

Utilizando un criostato, corte el tejido en secciones de 12 a 16 micrones y monte sobre portaobjetos de vidrio. A continuación, seque los portaobjetos colocándolos en una estufa a 37 grados Celsius. Luego, enjuáguelos tres veces con PBS para eliminar el OCT residual.

Se utiliza un lápiz de parafina para crear una barrera hidrofóbica alrededor del portaobjetos y se añade tampón de bloqueo al portaobjetos, evitando que se derrame gracias al borde de parafina. Coloque los portaobjetos en suero de cabra normal al 20 % en PBS durante una hora a temperatura ambiente para realizar el bloqueo. A continuación, coloque las secciones en anticuerpos primarios diluidos en PBS con triton al 0,3 % y suero de cabra normal al 10 %.

Aquí, el anticuerpo de conejo anti-PSD 95 se utiliza para marcar los compartimentos postsinápticos glutamatérgicos y el anticuerpo de hámster anti-VGLUT2 se utiliza para marcar los terminales presinápticos glutamatérgicos. Coloque los portaobjetos a cuatro grados Celsius e incube durante 36 a 60 horas. Después de la incubación, lave el anticuerpo primario sumergiendo los portaobjetos tres veces en PBS durante 15 minutos cada vez.

Después de este paso, asegúrese de proteger los portaobjetos de la luz directa. Aplique anticuerpos secundarios diluidos uno a 200 en PBS con 0,3% de triton y 10% de suero de cabra normal. En este caso, cabra anti cuy.

Alexa 488 y cabra anti conejo. Se utilizan Alexa 594. Incubar durante dos horas a temperatura ambiente en la oscuridad.

Lave las laminillas sumergiéndolas cuatro veces en PBS durante 15 minutos cada vez para montarlas. Añada pequeñas gotas de medio de montaje vector shield con dappy y cubra las laminillas con cubreobjetos. Aplique esmalte de uñas para inhibir el movimiento de los cubreobjetos.

La obtención de imágenes de cortes de tejido debe realizarse mediante un microscopio confocal con láseres apropiados, utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 63 aumentos para cada imagen de corte, con secciones ópticas en serie a intervalos de 0,33 micrones a lo largo de una profundidad total de cinco micrones, para un total de 15 secciones ópticas. Debe obtenerse imagen de al menos tres cortes por animal y deben incluirse al menos tres animales por condición experimental. Genere proyecciones de intensidad máxima a partir de grupos de tres secciones consecutivas, obteniendo cinco proyecciones que representen cada una un micrón de profundidad.

Estos se cuantifican utilizando ImageJ, como se describió para las CCR, con una ROI modificada para determinar el número de sinapsis formadas en ausencia de astrocitos. Se realizó inmunohistoquímica en CCR disociadas tratadas con medio de crecimiento basal utilizando anticuerpos contra bassoon mostrados en rojo y homer mostrados en verde, tal como se esperaba. Se observan muy pocos puntos de colocalización sináptica para determinar el efecto de las moléculas secretadas por astrocitos sobre el número de sinapsis formadas in vitro; las CCR disociadas se trataron con medio condicionado de astrocitos de ratón cada tres días durante un total de 12 días tras la tinción.

Se observaron numerosas sinapsis en esta neurona, pero pronto se muestra en rojo. Homer se muestra en verde en CDR disociadas transfectadas con tomate TD expresado en el citoplasma que fueron tratadas solo con crecimiento basal. Las sinapsis no se observan en el medio.

El tomate TD se observa en azul y la sinapsis se observa en rojo. Se observa muy poca señal para el marcador post-sináptico homer mostrado en verde. Cuando las mismas células se tratan crónicamente con medio condicionado de astrocitos de rata, se observan muchas sinapsis.

El tomate TD está en azul, la sinapsina en rojo y la homer en verde aquí. Se muestra una CRR purificada que ha sido tratada con medio condicionado de astrocitos y que ha sido marcada con marcadores rojos de pre-sinapsis y máscaras de umbral verdes de homer post-sináptico generadas utilizando el analizador de puntos. Tras identificar los puntos de colocalización, el analizador de puntos genera una representación gráfica de estos puntos.

El analizador de puntos proporciona un resultado numérico que indica el número de puntos discretos identificados en ambos canales y en los puntos de colocalización. Los datos obtenidos del análisis de esta neurona ilustran la capacidad de las moléculas secretadas por astrocitos para promover la formación de sinapsis, mostrado aquí como un ensayo de sinapsis en el que se cuantificó la colocalización de la marcación inmunohistoquímica pre y post-sináptica, demostrando así la potenciación de la formación de sinapsis inducida por astrocitos mediante la sobreexpresión del receptor neuronal para la molécula sinaptogénica secretada por astrocitos, trombospondina. En esta figura se muestra el número promedio de sinapsis por neurona tratada crónicamente con medio de crecimiento basal, gm, o con medio condicionado por astrocitos.

A-C-M-A-C-M promueve con mayor intensidad la formación de sinapsis en células ganglionares de la retina que sobreexpresan el receptor trombospondina en comparación con células que sobreexpresan un vector vacío. Para cuantificar la densidad sináptica en el colículo superior de ratón, los compartimentos pre y post-sinápticos se marcaron por separado utilizando marcadores inmunohistoquímicos específicos para cada compartimento. Como se muestra aquí, hubo un aumento en el número de sinapsis desde el día postnatal siete hasta P 14.

Esto ilustra el aumento en el número de sinapsis en el lóbulo superior durante este período de desarrollo. Una vez dominado, este protocolo puede completarse en aproximadamente dos días para cultivos neuronales disociados y en unos cinco días para secciones cerebrales, desde la obtención del animal tras seguir este procedimiento. Otros métodos, como la electrofisiología y la microscopía electrónica, se utilizan para verificar que los cambios en el número de sinapsis reflejan alteraciones tanto en sinapsis funcionales como en sinapsis con estructura ultraestructural normal, respectivamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar la inmunohistoquímica a su preparación experimental para cuantificar el número de sinapsis. Este protocolo detalla cómo utilizar anticuerpos específicos de compartimento para etiquetar selectivamente los compartimentos pre y postsinápticos. En este contexto, definimos las sinapsis como puntos de colocalización entre las señales obtenidas de cada uno de estos marcadores.