Las sinapsis cuantificar: un ensayo basado en inmunocitoquímica para cuantificar número de sinapsis

Uno de los objetivos más importantes de la neurociencia es comprender las señales moleculares que instruyen las primeras etapas de la formación de sinapsis. Como tal, se ha vuelto imperativo desarrollar enfoques objetivos para cuantificar los cambios en la conectividad sináptica. Para cuantificar el número de sinapsis en una variedad de preparaciones experimentales, las neuronas cultivadas o las preparaciones de tejido cerebral de criosección se tiñen con marcadores pre y post sinápticos selectivos para etiquetar los puntos de contacto sináptico entre las neuronas.

A continuación, se obtienen imágenes de las células o el tejido en un microscopio fluorescente y se requieren imágenes de ocho bits para cada uno de los canales correspondientes a los dos marcadores inmunohistoquímicos. Las imágenes se analizan utilizando la imagen J 1.29 con analizador de puntos. Para determinar el grado de colocalización entre los marcadores pre y post sinápticos, se pueden utilizar puntos de colocalización para determinar el número de sinapsis presentes en la preparación.

La principal ventaja de la técnica descrita aquí sobre los métodos existentes, como la microscopía electrónica, es que el ensayo de sinapsis permite un análisis de rendimiento mucho mayor y la cuantificación del número de sinapsis. Las principales implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico y tratamiento de trastornos clínicos como la enfermedad de Alzheimer, la epilepsia o el autismo en los que se han implicado anomalías y conectividad sináptica como base de la patología subyacente. Esta técnica se puede utilizar para identificar formas de intervención que pueden reducir o mejorar las deficiencias que vemos en la capacidad de las neuronas afectadas para formar sinapsis entre sí.

Aunque este método es útil para estudiar el desarrollo del cerebro, también se puede aplicar a otros organismos modelo o sistemas de órganos en los que esté interesado en estudiar o cuantificar el número de contactos de célula a célula para los que tiene la capacidad de etiquetar selectivamente cada cara opuesta de cada sitio de contacto. Preparar cultivos neuronales mediante la siembra de células ganglionares de retina de rata purificadas a partir de retina de rata, recolectadas de P 5 a siete animales en cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli de licina. En una placa de 24 pocillos, se permite que las células crezcan a 37 grados centígrados durante tres a cinco días antes de la transfección.

Después de la transfección, incube las células durante siete u ocho días adicionales para permitir que se desarrollen sinapsis cuando las células en placa hayan madurado lo suficiente. Retire los medios de cultivo de los pocillos y agregue 500 microlitros de formaldehído precalentado al 4% a cada pocillo fijado durante siete minutos. A temperatura ambiente después de la fijación, enjuague las células tres veces con solución salina tamponada con fosfato.

Es importante asegurarse de que las celdas nunca se sequen en los pozos. Una vez que se retira un tampón de un pozo, debe ser reemplazado de inmediato por el siguiente tampón. Prepare un tampón de bloqueo que contenga 50%suero de cabra normal y 0,2%Triton X 100.

Después de eliminar el PBS de cada pocillo, agregue 200 microlitros del tampón de bloqueo a cada pocillo y bloquee durante 30 minutos. A temperatura ambiente, retire el tampón de bloqueo y enjuague tres veces. Con PBS, prepare una dilución de anticuerpos primarios en una solución de tampón de 90 % de anticuerpos, 10 % de NGS que contenga el par de anticuerpos pre y post sinápticos de elección.

Aquí un conejo antis sinapsina, un marcador presináptico y un ratón anti homero. Se utiliza una centrífuga de marcador postsináptico, la dilución del anticuerpo primario durante cinco minutos a máxima velocidad en una centrífuga de sobremesa para eliminar cualquier anticuerpo precipitado, luego se agregan 200 microlitros de solución de anticuerpo primario a cada uno. Coloque la placa en un recipiente humidificado para evitar que la solución primaria se seque.

Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados después de la incubación con anticuerpo primario. Enjuague cada pocillo tres veces. Con PBS, añadir 200 microlitros de los anticuerpos secundarios adecuados, diluidos de uno a 1000 en tampón de anticuerpos que contenga un 10% de NGS preparado.

Como antes, coloque el plato en la cámara humidificada e incube durante dos horas a temperatura ambiente en la oscuridad después de la incubación con secundarios. Enjuague cada pocillo tres o cuatro veces con PBS. Coloque una gota de medio de montaje de escudo vectorial con DPI en un portaobjetos de vidrio.

A continuación, invierta el cubreobjetos con las celdas en la gota para montar. Por último, aplica un esmalte de uñas transparente alrededor de los bordes del cubreobjetos. Tenga cuidado de evitar empujar o mover los cubreobjetos durante la aplicación.

Dado que esto compartirá las celdas, deje que los portaobjetos se sequen durante al menos 30 minutos en un lugar seco y oscuro. En este caso, las imágenes se realizan utilizando un microscopio de fluorescencia zes axio imager equipado con conjuntos de filtros adecuados y un objetivo de inmersión en aceite de 63 veces. Coloque un portaobjetos que contenga células no transfectadas en la platina del microscopio.

Con el filtro DPI establecido para visualizar los núcleos de las células, seleccione las células que estén al menos a dos diámetros de célula de distancia de sus vecinas más cercanas. El uso de DPI para este paso ayudará a evitar sesgos y garantizará la aleatoriedad de la selección de celdas. Para cada celda seleccionada, obtenga imágenes de ocho bits utilizando los conjuntos de filtros apropiados, en este caso, GFP y Texas Red.

La imagen pseudo coloreada superpuesta debe mostrar marcadores pre y postsinápticos en rojo y verde respectivamente. A continuación, coloque un portaobjetos que contenga células transfectadas en la platina del microscopio. Aquí, las células se han transfectado con un vector de expresión de tomate TD.

Utilice este marcador para seleccionar celdas como antes. Para cada celda seleccionada, obtenga ocho imágenes de pozo utilizando los conjuntos de filtros apropiados en este caso, GFP, Texas Red y Sci five. La imagen pseudo coloreada superpuesta debe tener los marcadores postsinápticos en rojo, verde y azul.

En este caso, el programa del analizador de punción se utiliza para la cuantificación de la punción sináptica colocalizada. El complemento del analizador Puncta fue escrito por Barry Walk y está disponible a pedido en la imagen J 1.26. Abra una de las imágenes recopiladas.

Utilice la herramienta de selección circular para seleccionar una región de aproximadamente un diámetro de celda radialmente alrededor del SOR de interés. Con la región de interés seleccionada, vaya al menú de complementos y seleccione Analizador de pinchazos en la ventana de opciones de análisis que aparece Seleccionar canal rojo Canal verde. El primero resta el fondo y establece el archivo de resultados.

Haga clic en Aceptar. A continuación, defina una ubicación en la que guardar los resultados. Estos resultados se pueden exportar a Excel para su posterior análisis en la ventana que aparece.

A continuación, asegúrese de que esté seleccionado un radio de bola rodante de 50 y desmarque la opción fondo blanco. Esta modificación no es necesaria, pero a menudo es la preferida por los usuarios de la aplicación. Para facilitar la visualización, haga clic en Aceptar.

Aparecerá una nueva ventana junto a una máscara correspondiente a la imagen del canal rojo. Ajuste el umbral hasta que la máscara roja corresponda lo mejor posible con la mayor cantidad de punciones individuales discretas. Sin introducir demasiado ruido, haga clic en listo.

Establezca el tamaño mínimo de puntuación en cuatro píxeles. No modifique nada más. Haga clic en Aceptar.

Repita el paso anterior, esta vez para el canal verde. Después de repetir esto con el canal verde, el plugin proporcionará una cuantificación correspondiente a los puntos en cada canal por separado y un punto colocalizado entre los dos canales. El ensayo de sinapsis que se muestra aquí se puede aplicar a secciones criogénicas del cerebro y a cualquier otro tejido del sistema nervioso, como la médula espinal o la retina.

Siempre que exista un par de marcadores pre y postsinápticos adecuados. Comience por recolectar tejido cerebral de un ratón que ha sido sacrificado por exanguinación y profusión con PBS. Coloque todo el cerebro en paraldehído al 4% en PBS a cuatro grados centígrados durante la noche del día siguiente.

Enjuague el cerebro tres veces con PBS. Cryo protege el cerebro colocándolo en sacarosa al 30%. En PBS.

Inicialmente, el tejido flotará a cuatro grados centígrados hasta que el tejido se hunda hasta el fondo. En esa etapa, la protección criogénica está completa. A continuación, en una solución de dos a uno de sacarosa al 20% para OCT y PBS, incruste la cerebrona en la orientación deseada para el corte.

Por ejemplo, sagital o coronal. A continuación, coloque una superficie metálica plana encima de un cubo de hielo seco. Coloque el cerebro incrustado sobre él para congelarlo una vez congelado, transfiera el cerebro a una bolsa para congelar y colóquelos a menos 80 grados Celsius hasta por un año antes de seccionarlos.

Usando un criostato, corte el tejido en secciones de 12 a 16 micras y móntelo en portaobjetos de vidrio. A continuación, seca los portaobjetos colocándolos en un horno a 37 grados centígrados. A continuación, enjuáguelos tres veces con PBS para eliminar los restos de OCT.

Se utiliza una pluma de parafina para crear una barrera hidrofóbica alrededor del portaobjetos y se añade un tampón de bloqueo al portaobjetos que evita que fluya fuera del portaobjetos por el borde de la parafina. Coloque los portaobjetos en suero de cabra normal al 20% en PBS durante una hora a temperatura ambiente para bloquear el siguiente lugar. Las secciones en anticuerpos primarios diluidos en PBS con 0,3% de tritón y 10% de suero de cabra normal.

Aquí, el conejo antit, PSD 95 se usa para etiquetar los compartimentos glutamatérgicos postsinápticos y el conejillo de indias anti v glu dos se usa para marcar las terminales presinápticas glutamatérgicas. Coloque los portaobjetos a cuatro grados centígrados e incube durante 36 a 60 horas después de la incubación. Lave el anticuerpo primario sumergiendo los portaobjetos tres veces en PBS durante 15 minutos cada uno.

Después de este paso, asegúrese de proteger las diapositivas de la luz directa. Aplicar anticuerpos secundarios diluidos de uno a 200 en PBS con 0,3% de tritón y 10% de suero de cabra normal. Aquí, cabra anti conejillo de indias.

Alexa 4 8 8 y cabra anti conejo. Se utilizan Alexa 5, 9, 4. Incubar durante dos horas a temperatura ambiente en la oscuridad.

Lave las diapositivas sumergiéndolas cuatro veces en PBS durante 15 minutos cada una para montarlas. Agregue pequeñas gotas de medio de montaje de escudo vectorial con dappy y cubra las diapositivas con cubreobjetos. Aplique esmalte de uñas para inhibir los movimientos de los cubreobjetos.

La obtención de imágenes de la sección de tejido debe realizarse utilizando un microscopio confocal con láseres apropiados utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 63 veces para cada imagen de sección, secciones ópticas en serie a intervalos de 0,33 micras sobre una profundidad total de cinco micras para un total de 15 secciones ópticas. Se deben obtener imágenes de al menos tres secciones de cada animal y se deben incluir al menos tres animales de una condición experimental dada. Genere proyecciones de intensidad máxima a partir de grupos de tres secciones consecutivas, produciendo cinco proyecciones que representan una micra de profundidad cada una.

Estos se cuantifican utilizando la Imagen J como se describe para RG Cs con un ROI modificado para determinar el número de sinapsis formadas en ausencia de astrocitos. La inmunoquímica se realizó en rgc disociados tratados con medios de crecimiento basales utilizando anticuerpos contra el fagot que se muestra en rojo y homer que se muestra en verde, como se esperaba. Se observan muy pocos puntos de colocalización sináptica para determinar el efecto de las moléculas secretadas por los astrocitos sobre el número de sinapsis formadas: las RG Cs disociadas in vitro se trataron con medios condicionados de astrocitos de ratón cada tres días durante un total de 12 días después de la tinción.

Numerosas sinapsis eran evidentes en esta neurona, pero pronto se muestra en rojo. Homer se muestra en RDCs disociadas en verde transfectadas con tomate TD citoplasmático expresado por Lee que fueron tratados solo con crecimiento basal. No se observan sinapsis medias.

El tomate TD se ve en azul y la sinapsis en rojo. Se ve muy poca señal para el marcador postsináptico que se muestra en verde. Cuando las mismas células se tratan crónicamente con medio condicionado de astrocitos de rata, se observan muchas sinapsis.

El tomate TD está en azul, la sinapsina en rojo y el jonrón en verde aquí. Se muestra un RGC purificado que ha sido tratado con medio condicionado por astrocitos y ha sido teñido para presinapsis en rojo y marcadores postsinápticos en verde de Homer, las máscaras de umbral generadas mediante analizador de punción corresponden a los dos canales presentes. Al identificar los puntos de colocalización, el analizador Puncta genera una representación gráfica de estos puntos.

El analizador de puntos proporciona una salida numérica que indica el número de puntos discretos identificados en ambos canales y para los puntos de colocalización. Los datos producidos por el análisis de esta neurona ilustran la capacidad de las moléculas secretadas por astrocitos para promover la formación de sinapsis, que se muestran aquí como un ensayo de sinapsis en el que se cuantificó la colocalización del marcaje inmunohistoquímico pre y postsináptico para demostrar la potenciación de la formación de sinapsis inducida por astrocitos por sobreexpresión del receptor neuronal para la importante molécula génica de sinapis secretada por astrocitos, thrombo spon. En esta figura se muestra el número promedio de sinapsis por neurona tratada crónicamente con medios de crecimiento basales, gm, o con medios condicionados por astrocitos.

A-C-M-A-C-M promueve más fuertemente la formación de sinapsis en las células ganglionares de la retina que sobreexpresan el receptor de thrombo spon en comparación con las células que sobreexpresan un vector vacío. Para cuantificar la densidad sináptica en los compartimentos pre y postsinápticos del colículo superior del ratón, se marcaron por separado utilizando marcadores inmunohistoquímicos específicos del compartimento. Como se muestra aquí, hubo un aumento en el número de sinapsis desde el séptimo día postnatal hasta P 14.

Esto ilustra el aumento en el número de sinapsis en el ulus superior durante este período de tiempo de desarrollo. Una vez dominado, este protocolo puede completarse en unos dos días para los cultivos neuronales disociados y en unos cinco días para las secciones del cerebro procedentes de la recolección del animal siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como la electrofisiología y la microscopía electrónica, se utilizan para verificar que los cambios en el número sináptico reflejan cambios tanto en las sinapsis funcionales como en las sinapsis ultraestructuralmente normales, respectivamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar la inmunohistoquímica a su preparación experimental para cuantificar el número de sinapsis. Este protocolo detalla cómo usar anticuerpos específicos del compartimento para etiquetar selectivamente compartimentos pre y postsinápticos. En este contexto, definimos las sinapsis como puntos de colocalización entre las señales obtenidas de cada uno de estos marcadores.