Bloque de agar-microcosmos de descomposición controlada de Tejidos Vegetales de hongos aerobios

El objetivo general de este procedimiento es inocular un hongo aeróbico que degrada la madera en un microcosmos de placa de Petri donde la humedad de la madera y los sustratos exógenos están estrictamente controlados. Esto se logra preparando primero microcosmos con volúmenes exactos de edia conocidos. A continuación, la madera que se va a degradar y los sustratos sólidos exógenos se ensamblan sobre una rejilla de plástico en la superficie agrícola sin permitir el contacto entre los sustratos.

A continuación, el microcosmos se inocula y se incuba con el hongo de prueba. Después de la incubación, se cosechan bloques de madera para determinar la pérdida de masa y preparar los tejidos para los análisis. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren el grado de biodegradación de la madera y el papel de las fuentes de elementos exógenos a través de mediciones de pérdida de masa, observaciones de la morfología micelial y análisis elementales específicos como la espectroscopia de plasma acoplado inductivamente.

Hola, mi nombre es Brooke Jacobson y pertenezco al laboratorio del Dr. Jonathan Schilling en el Departamento de Bioproductos e Ingeniería de Biosistemas de la Universidad de Minnesota. Hoy vamos a mostrarte un procedimiento para utilizar placas de Petri como microambientes para la descomposición de tejidos vegetales por hongos aeróbicos. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los mecanismos de descomposición de la lignocelulosa fúngica.

La lignocelulosa es el tejido vegetal compuesto por lignina, celulosa y hemicelulosa. El tejido que estudiamos con mayor frecuencia es la madera, los errores con los aspectos menos técnicos del diseño del bloque de barrena son las causas más comunes de falla y las fuentes clave de variabilidad entre los estudios, lo que hace que la publicación de video de la configuración de nuestro bloque de barrena sea útil. Sabemos por experiencia que este procedimiento produce resultados de alta calidad y baja variabilidad.

Así que comencemos. Para estos experimentos, use placas de Petri que sean un centímetro más profundas que las placas de Petri típicas para aumentar el espacio de cabeza por encima del bloque de madera. En el microcosmos.

Comience la preparación del microcosmos haciendo una edia suficiente para 20 mililitros por placa de Petri sin calcio ni hierro. Tipo un agar de 15 gramos de agar en un matraz aforado de 500 mililitros que contiene aproximadamente 400 mililitros de agua desionizada modificada con suplementos. Utilice soluciones madre previamente preparadas para añadir micronutrientes a la mezcla.

Una vez añadidos los nutrientes, llene el matraz aforado hasta la línea de 500 mililitros. A continuación, transfiera el medio a un matraz de 1000 mililitros. El autoclave a 121 grados Celsius y 16 PSI durante 20 minutos.

Tenga cuidado de no exceder un volumen de 500 mililitros por matraz para evitar que el agrio se solidifique antes de administrar las placas de prueba. Después de la esterilización en autoclave, deje que los medios se enfríen al tacto para minimizar la condensación. Minimizar la humedad es fundamental en estos experimentos, ya que el contenido de humedad o mc.

Más del 80% causará anoxia en los tejidos. Limite la descomposición por hongos aeróbicos y aumente la variabilidad una vez. Fresco. Utilice una pipeta portátil y pipetas de poliestireno estériles de 10 mililitros para realizar de forma aséptica.

Transfiera el agar a una pila alta de placas en un gabinete de bioseguridad. A continuación, corte generosamente las rejillas de malla de plástico para que quepan dentro de la parte inferior de la placa. Después de cortar y lavar a fondo las rejillas con agua y jabón, prepare las rejillas de malla para el secado y el autoclave para esta demostración.

Se utiliza el pino amarillo del sur o SYP, ya que representa una fuente importante de madera. En las viviendas residenciales de los EE. UU., use madera sin tratar y corte bloques sin nudos de 19 por 19 milímetros de un solo corte longitudinal a lo largo de la veta. Corta esta longitud en bloques cúbicos de 19 milímetros.

Divida los bloques cúbicos de 19 milímetros por la mitad a lo largo de la fibra con un cincel y un martillo en lugar de una sierra. Esto hace que un borde de bloque rugoso mire hacia abajo en la malla de plástico en el microcosmos de bloque agrícola y un borde superior liso para etiquetar. Etiquetar el borde liso de los bloques con un lápiz, cortar suficientes bloques para cumplir con los tratamientos, así como los controles no inoculados que servirán como monitores de contaminación y como muestras de datos de referencia acondicionadas en paralelo para material secado en horno, colocar las muestras en bandejas de suero de aluminio y en un horno de convección a 100 grados centígrados durante 48 horas.

Transfiera las muestras del horno a un desecador para enfriarlas una vez. Fresco. Pesa previamente las muestras para determinar el peso seco inicial del horno. Finalmente, prepare las muestras, incluidas las rejillas de plástico y la madera para el autoclave, envolviéndolas herméticamente con papel de aluminio para minimizar la humectación.

Esto no requiere que cada muestra se envuelva individualmente, sino que la exposición al vapor sea baja y constante. Esterilizar las muestras etiquetadas en autoclave a 121 grados Celsius y 16 PSI durante una hora. En un gabinete de bioseguridad estéril, ensamble los AE vacíos, una placa fuente para materiales exógenos de sustrato vegetal de malla de inóculo, tiras de paraforma, pinzas y herramientas de transferencia.

El siguiente paso de la inoculación es agregar los artículos al agri, contener placas de Petri para minimizar el riesgo de contaminación. Herramientas de transferencia de llama y pinzas con etanol al 95% a medida que se utilizan. Primero, agregue la malla de plástico a la placa de Petri.

A continuación, añade aquí el sustrato de madera. Se agregan dos bloques de madera a lo largo de la malla para que los datos se puedan emparejar de las cosechas tempranas y tardías. Estos bloques se agregan al lado del grano y mirando hacia el punto de la fuente de inóculo fúngico.

A continuación, agregue los materiales exógenos. Aquí. El papel del yeso está siendo probado en la descomposición por un hongo filamentoso. Por lo tanto, el hongo debe encontrarse con estos discos de yeso antes de llegar a la madera.

Se agrega un disco de yeso entre cada bloque y punto de inóculo en la parte superior de la malla. Tenga cuidado de evitar el contacto entre los discos de la madera mientras los mantiene juntos. Para el inóculo fúngico, use un corcho Boer número cuatro con siete milímetros de diámetro para hacer tapones a partir de cultivos de dos semanas cultivados en 20 mililitros de agar.

Esto ayuda a controlar el volumen del inóculo. Para los controles no inoculados, es mejor agregar un tapón de una placa estéril. No permita el contacto entre el inóculo y los sustratos exógenos o la madera, sino colóquelos juntos.

Utilice un tapón de inóculo por bloque. Selle los platos con el param que se ha cortado con una navaja, sostenga las placas horizontales y envuelva el param con un movimiento suave y continuo. Finalmente, etiquete las tapas de los platos con un marcador resistente al alcohol que etiquete los números de bloque directamente sobre los sustratos respectivos.

También dibuja círculos sobre los discos de yeso. Transfiera las placas con cuidado a una incubadora biológica para evitar empujones el contenido y minimizar la condensación debido a las fluctuaciones de temperatura. Las condiciones utilizadas aquí son a 20 grados centígrados y en la oscuridad realizan las cosechas de series temporales de forma aséptica, a excepción de la última cosecha.

En el punto de cosecha de la semana cinco, retire todo el lote de tratamiento. Rocíe cada parte inferior y superior con etanol al 70% y use pinzas flameadas para eliminar el material dentro de la cabina de bioseguridad. Tome fotografías antes de destruir las placas agrícolas, concentrándose en cualquier morfo F o melón.

A continuación, retire los bloques que se van a tratar. Retire el exceso de pha, pero tenga cuidado de no perder ningún material descompuesto del horno. Seque los bloques en las bandejas de aluminio y determine la pérdida de masa utilizando los pesos frescos y secos de los controles para controlar la absorción excesiva.

Los datos de pérdida de masa ayudan a medir el progreso de la descomposición y son datos importantes. Si las concentraciones elementales se van a calcular sobre la base del peso en gramos, los datos porcentuales deben normalizarse. Para las estadísticas, etiquete y realice un seguimiento de los bloques de color marrón oscuro, que están claramente anegados.

Finalmente destruir los cultivos en bolsas esterilizables en autoclave, ahorrando malla de soporte de plástico y cualquier otro componente que pueda reciclarse para su uso en futuros experimentos. Usando la configuración del microcosmos de bloques agrícolas, los bloques de madera de pino descansan sobre una malla de plástico para elevar los bloques por encima del contacto con los bloques agrícolas. Los cráneos circulares crecían en contacto directo con las superficies de yeso y en los bloques de madera.

Este micelio representa una conexión importante entre la madera y las fuentes de elementos nutritivos exógenos. En el control de estas fuentes de materiales exógenos en el agar o en materiales sólidos es una ventaja clave de un diseño de bloques agrícolas frente al diseño de bloques de suelo, la pérdida de peso porcentual promedio como medida de la extensión de la descomposición de la madera por parte de los productores después de cinco y 15 semanas. Aquí se muestra la incubación con pino en microcosmos de bloques agrícolas.

Los tratamientos fueron ninguno. Cinco milimolares de cloruro de calcio añadidos a agar con más de un 99% de yeso puro o un 1% de yeso modificado con hierro para cada cosecha, las barras bajo la misma letra no son significativamente diferentes. Con las barras de error que representan la desviación estándar, se observó una pérdida de peso de más del 60% en los bloques de pino marrón podrido de control, lo que satisface el objetivo estándar de la Sociedad Americana de Pruebas y Materiales de más del 50% de descomposición.

El coeficiente medio de variación en el decaimiento fue de 0,055 en la semana 16. Además de la baja variabilidad, se observó un efecto del tratamiento. La descomposición fúngica se inhibió con adiciones de calcio, ya sea al agar como cloruro de calcio o como yeso puro.

Curiosamente, las tasas de descomposición se recuperan con la adición de hierro al yeso. Sugerir hierro y no calcio es fundamental para observar las cinco réplicas en la semana 15 de descomposición. Por la misma podredumbre marrón, hongo de prueba, laminas circulares, el color del micelio revela meína.

Diferencias en las hifas externas entre los tratamientos, los bloques se eliminaron y se secaron. Revelando la falta de mein en el tratamiento libre de calcio. El amarilleo en los tratamientos de calcio puro y la aparición de óxido en el tratamiento modificado con hierro.

El control representa los bloques no inoculados para la comparación. Curiosamente, los efectos de mein se pierden utilizando un medio con alto contenido de hierro. En conjunto, se sugiere que este hongo utiliza hierro, no calcio.

En estos materiales, acabamos de mostrarle cómo usar una configuración de bloque de barrena para probar con éxito la biodegradación de tejidos vegetales por hongos filamentosos aeróbicos. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que debe evitar que los sustratos entren en contacto entre sí, especialmente el tejido vegetal y la barrena, minimizar el contenido de humedad de la barrena y las plaquetas, y verificar dos veces para asegurarse de que el contenido de cada placa no se haya movido antes de la incubación. Teniendo en cuenta estas variables, puede controlar el entorno de descomposición mucho mejor que cuando se utiliza una configuración de bloques de suelo.

Puede generar datos con la potencia estadística necesaria para responder a sus preguntas de investigación. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.