A 96 de microtitulación y placa basada en el método para la formación de Control y pruebas de sensibilidad antifúngica Candida albicans Las biopelículas

El objetivo general de este procedimiento es formar biopelículas de Candida albicans y examinar su susceptibilidad a los agentes antifúngicos. Esto se logra formando primero estas biopelículas fúngicas en los pozos de 96. A las biopelículas preformadas se les añaden placas de microtitulación y luego antifúngicos y se incuban durante 24 a 48 horas después de esta incubación.

Se utiliza un método cholémétrico que mide la actividad metabólica de las células dentro de las biopelículas para medir la actividad de estos antifúngicos con el fin de establecer la concentración inhibitoria mínima de antifúngicos contra las biopelículas. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la capacidad de formar biopelículas y pruebas de susceptibilidad a los hongos a través de un método simple y fácil basado en una placa de microtitulación de 96 pocillos junto con una lectura métrica de color. La principal ventaja de esta técnica es que es fácil, relativamente barata, altamente reproducible y permite la formación de múltiples biopelículas equivalentes.

Además, es compatible con la tecnología de plataforma de 96 pocillos comúnmente disponible en la mayoría de los laboratorios clínicos y de investigación. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de los cánidos. Ya que muy a menudo, estas infecciones se asocian con la formación de biopelículas.

Utilizando técnicas de manipulación microbiológica adecuadas, se extrajo un circuito lleno de células de un subcultivo fresco de albicans en una placa de cobre de dextrosa SAU Alan e inoculó en un matraz Erlenmeyer de 125 mililitros que contenía 25 mililitros de caldo de levadura pepano dextrosa, se colocó el cultivo en un agitador orbital a 180 RRP M y 30 grados Celsius, y se incubó durante la noche después de la incubación nocturna. Vierta los cultivos de levadura en tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugue a 3000 RBM durante cinco a 10 minutos. Descarte el vórtice sobrenadante.

El pellet vigorosamente para desegregar las células. A continuación, añada PBS estéril para lavar antes de volver a centrifugar los cultivos. Repita este paso de lavado una vez más antes de volver a doblar las celdas.

En unos 20 mililitros de RPMI 1640, el medio tamponado a pH 7,0. Usando una solución de trapeadores de 165 milimolares y precalentada a 37 grados Celsius de esta suspensión, prepare una dilución de uno a 100 usando un hemocitómetro estándar y un microscopio de campo brillante. Cuenta las celdas.

A continuación, prepare una suspensión final de las células a una vez 10 de las seis por mililitro en el uso de RPMI 1640 tamponado en caliente. Uso de una pipeta multicanal a 100 microlitros de suspensión de albican marino en pocillos seleccionados de una placa de microtitulación estéril de fondo plano de 96 pocillos. Deje vacíos los pozos de la columna 12, ya que servirán como controles negativos.

Después de cubrir y sellar la placa con paraform, incube a 37 grados centígrados durante 24 horas para permitir que se formen las biopelículas. Después de la incubación, aspire suavemente y deseche los medios de cada pocillo. Teniendo cuidado de no interrumpir las biopelículas formadas en la parte inferior.

Lavar a 200 microlitros de PBS en cada pocillo y escurrir invirtiendo y secando cuidadosamente el plato sobre una pila de toallas de papel. Repite este paso de lavado tres veces. En este punto, las biopelículas son detectables a simple vista y se pueden visualizar utilizando un microscopio invertido mediante SEM.

Podemos apreciar que los biofilms consisten en una mezcla entrelazada de filamentos y células de levadura. Una vez que se ha verificado la formación de biopelícula, se pueden comenzar las pruebas de agentes antifúngicos utilizando soluciones de trabajo de alta concentración de preparación media RPMI 1640 tamponadas de los agentes antifúngicos que se van a probar. Las concentraciones altas típicas son de 1024 microgramos por mililitro para el fluconazol y de 16 microgramos por mililitro para la anfotericina B y los hongos CASPO beri.

A continuación, agregue 200 microlitros de soluciones antifúngicas a los pocillos de la columna uno y 100 microlitros de RPMI 1640 tamponado. Medio a pozos en las columnas dos a 11. Realice una serie de diluciones de duplicación en serie transfiriendo 100 microlitros de las soluciones antifúngicas de alta concentración de los pocillos de la columna uno a los de la columna dos.

Después de pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar, pipetee 100 microlitros de los pocillos de la columna dos con los de la columna tres y así sucesivamente hasta la columna 10. No agregue ninguna solución antifúngica a la columna 11, ya que servirá como control positivo y deseche los últimos 100 microlitros de los pocillos de la columna 10. Todos los pozos, excepto los de la columna 12.

Ahora debería tener un volumen final de 100 microlitros. Cubra la placa, séllela con perfume e incubela a 37 grados centígrados durante 24 a 48 horas para permitir que los antifúngicos actúen después de la incubación. Y después de lavar la placa tres veces en PBS como se describió anteriormente, agregue 100 microlitros de solución de mediano XTT por pocillo a todos los pocillos, incluidos los pocillos de control negativo.

En la columna 12. Cubre la placa, envuélvela en papel de aluminio para protegerla de la luz e incuba a 37 grados centígrados durante dos horas. Para permitir el desarrollo del color después de la incubación, desenvuelva la placa.

La solución XTT inicialmente clara se habrá vuelto naranja después de ser procesada por células metabólicamente activas. Transfiera 80 microlitros de los sobrenadantes coloreados a una placa de microtitulación fresca de fondo plano. Utilice un lector de placas de microtitulación colormétrica configurado a una longitud de onda de 490 nanómetros para leer la placa como se muestra aquí En ausencia de antifúngicos, las lecturas colormétricas no se trataron.

Las biopelículas del solicitante de SEA en diferentes filas son equivalentes. Con el fin de evaluar primero el efecto de los compuestos antifúngicos analizados, se reste de todos los demás valores un valor medio de fondo obtenido de los pocillos de control negativos de la columna 12. A continuación, calcule el porcentaje de inhibición utilizando los controles positivos de la fila 11.

Como valores máximos, las concentraciones de antifúngicos a las que se detecta una disminución del 50% o del 80% en las lecturas colormétricas, se conocen como concentraciones inhibitorias mínimas de Cecil. Estos valores se utilizan normalmente como medida de referencia de la potencia de un compuesto. Con este sencillo método de alto rendimiento, las biopelículas fúngicas se pueden formar in vitro en 24 horas, y los compuestos seleccionados se pueden analizar para determinar la actividad antifúngica después de su desarrollo inicial.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la micología médica exploraran la formación de biopelículas y examinaran la actividad de los agentes antifúngicos. De nuevo, las células en biofilms.