Name: Introducción al Laboratorio de Worm: El cultivo de gusanos de Mutagénesis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T22:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprende dos métodos de mutagénesis, EMS y TMP/UV, para generar mutantes en Pristionchus pacificus. Esta técnica permite identificar genes involucrados en procesos biológicos mediante el análisis de fenotipos mutantes.

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Este trabajo ha sido financiado por la NSF subvención IOB # 0615996.

Parte 1: Preparación de medios de cultivo de nematodos (NGM) placas de Petri Nematodos experimentales, como C. elegans y P. pacificus se suelen cultivar en el laboratorio de 6 cm placas de Petri que contenían medio de nematodos Crecimiento (NGM) 1. Los gusanos se mantienen a 20 ° C, pero se pueden incubar en un rango de temperaturas (entre 4 ° C - 25 ° C), dependiendo de las especies de nematodos y el diseño experimental. Para preparar platos con NGM, las técnicas estériles tienen que ser utilizados para prevenir la contaminación por hongos y bacterias. A continuación se presenta el protocolo para preparar platos NGM: <ol><li> Pesar 15 g de agar, 2,4 g de NaCl, 2 g de triptona, y 2,72 g KH 2 PO 4 en un matraz de 2 L cónica, que el volumen hasta 1 litro con agua, autoclave y deje que se enfríe a 60 ° C en un baño de agua. </li><li> Añadir 0,8 ml cada una de 1 M de CaCl 2, el colesterol (5 mg / ml en etanol), y 1 M MgSO 4. Para prevenir la contaminación por hongos y bacterias, un ml de estreptomicina (100 mg / ml) y 1 ml de nistatina (10 mg / ml) se pueden agregar a cada litro de medio. </li><li> Usando una máquina Unispense y mantener condiciones estériles, vierta los medios de comunicación en los platos que desee. Las placas deben ser llenados con cerca de 2 / 3 de lleno. Una placa estándar de 60 mm de diámetro requiere alrededor de 10 ml de los medios de comunicación. No se mueven las placas hasta que el agar esté completamente gelificada, de lo contrario habrá una superficie irregular de agar, por lo que es difícil de enfocar los gusanos en el microscopio estereoscópico. </li><li> Una vez seco, las placas pueden ser sembradas inmediatamente o almacenarse a 4 ° C hasta la siembra de bacterias. </li></ol> Parte 2: Preparación de las bacterias y OP50 siembra NGM placas de Petri P. pacificus se cultiva en el laboratorio por la alimentación de la cepa de E. coli OP50. OP50 tiene un crecimiento limitado en las placas de NGM, formando un césped fino que facilita la visualización de los gusanos 1. Para cultivar una cultura de la OP50, use LB caldo: <ol><li> Añadir 5 g bactotryptone, 2,5 g de extracto de levadura y 2,5 g de NaCl a una botella de 500 ml con tapón de rosca, completar el volumen a 500 ml con agua destilada y autoclave. </li><li> Inocular el caldo con una sola colonia de OP50 de la placa de cultivo en condiciones estériles y se deja crecer la noche a 37 ° C. </li><li> LB-OP50 está listo para ser utilizado y se puede almacenar a 4 ° C durante varios meses si se mantiene la esterilidad. Cada vez que las placas deben ser cabeza de serie, vierta una pequeña cantidad del caldo en un vaso estéril pequeño y esto ayudará a evitar la contaminación de la cultura de valores. </li><li> A las placas de la semilla, prescindir de 100 a 120 l de la OP50 a los 60 mm de diámetro placa Petri NGM y agitar para que se extendiera. </li><li> Incubar las placas sembradas durante la noche a temperatura ambiente para el césped a crecer. Estas placas sembradas se pueden almacenar a 4 ° C durante un máximo de 3 semanas. El almacenamiento en una posición invertida ayuda a prevenir el secado rápido. </li></ol> Parte 3: Hacer una selección de En esta sección se describe cómo hacer una selección para los gusanos. La recogida se utiliza para transferir los gusanos de un lugar a otro. La selección se hace de calibre 30, un 90% de alambre de platino iridio 10%, aunque algunos investigadores prefieren composiciones de metal un poco diferente: <ol><li> Cortar unos 3-4 cm de alambre, el lugar de 0,5 cm de la misma dentro de la punta de una pipeta Pasteur (cuya punta estaba rota a una menor longitud), y luego se junta en el vaso con un mechero Bunsen. La longitud de los cables que sobresalen de la copa es de unos 3-3,5 cm, pero puede variar de acuerdo a las preferencias individuales. </li><li> Aplanar el extremo del alambre que sobresale con un martillo o unos alicates. Luego, doblar hacia arriba la parte aplanada para formar una bola. </li><li> Suavizar los bordes afilados de la selección con un papel de lija para evitar que se dañe el gusano o el agar. </li></ol> Parte 4: gusanos Picking <ol><li> Para recoger los gusanos, esterilizar el alambre de platino en una llama y arrastre la punta plana de la selección a lo largo del césped bacteriano para cubrir la punta con un grueso bacteria pegajosa, teniendo cuidado de no perforar o dañar la superficie del agar. </li><li> Usando el microscopio estereoscópico, muy ligeramente el pincel punta pegajosa contra el gusano gusanos / para ser recogidos hasta el gusano se pega a las bacterias en la selección. </li><li> Una vez que el gusano está en la punta del pico, se transferirá inmediatamente a la nueva placa de toque o deslizando la punta de la selección contra el césped de bacterias de la placa nueva, y el gusano que se arrastran fuera. Se debe tener cuidado de no dañar la superficie del agar en la placa más que los gusanos se arrastran en los agujeros por lo que es difícil de recuperar. Si el gusano se queda en la selección por mucho tiempo, podría secarse. </li></ol> Parte 5: Sistemas de gestión de mutagénesis Sulfonato de metano etílico (EMS) induce un amplio espectro de mutaciones en el genoma en el 2. Mutantes pueden ser identificados por los defectos, como la puesta de huevos, defecto del músculos, la determinación del sexo, la formación de Dauer, el comportamiento y la formación de las gónadas. El protocolo de mutagénesis EMS es similar a la descrita para el C. elegans 1. <ol><li> Preparar 500 ml (o más) de NaOH 1N. </li><li> Tome 4-5, 6 cm de diámetro, las placas de Petri llenas de gusanos, que contiene unos pocos cientos de gusanos en la tercera larva juvenil (J3) y ​​la etapa de lavado de los gusanos con 2-3 ml de agua estéril M9 por placa. </li><li> Recoge todos los gusanos en un recipiente estéril, desechable 15 ml tubo de centrífuga. Centrifugar a 1500 xg durante 5-7 minutos o hasta que los gusanos forma una bolita. </li><li> Aspirar el líquido y el uso de 2 ml de M9 para volver a suspender los gusanos. Añadir 20 l EMS a un tubo que contiene 2 ml de M9 y agitar para que se disuelva. Después agregar esta solución a la EMS 2 ml de la suspensión de gusano y agitar suavemente. La concentración final de EMS será de 47 mm. Atención: EMS es un mutágeno muy fuerte y debe ser manejado en una campana extractora. Todos los materiales (guantes, pipetas, puntas) que entran en contacto con este mutágeno debe ser tratado con NaOH 1N para inactivar la EMS. Use guantes durante el procedimiento de mutagénesis toda la EMS. Disponer los residuos peligrosos de acuerdo a las directrices de su institución. </li><li> Coloque el tubo de centrífuga y cubierta de la tapa con parafilm y colóquelo horizontalmente en la campana extractora de humos y dejar que los gusanos se incuban durante 3,5 horas. El tubo también puede ser colocado en un agitador de baja velocidad. </li><li> A su vez el tubo y la cubierta de la tapa con parafilm, coloque en posición vertical y se incuban hasta que el disipador gusanos. </li><li> Aspirar el sobrenadante y desecharlo en un vaso / frasco que contiene NaOH 1N. Esto inactivar el SME. </li><li> Añadir 5 ml M9 a los gusanos, invertir el tubo 25-30 veces para lavar los gusanos, se centrifuga a 1.500 g durante 5-7 minutos o hasta que los gusanos forma una bolita. Aspirar el sobrenadante y desecharlo en el vaso de NaOH 1N. </li><li> Repita el paso de lavado por lo menos 3 veces. </li><li> Después del último lavado, vuelva a suspender el gusano de pellets en cantidad mínima (~ 500 l) de la M9 y una pipeta a cabo en placas de NGM contiene un césped de bacterias OP50. En este punto ya no es necesario trabajar en la campana química. </li><li> Deje el líquido en seco durante unos minutos y luego recoger y transferencia de aspecto saludable J4 larvas frescas placas sembradas. Deseche la placa original de acuerdo con las directrices de su institución de residuos peligrosos. </li><li> Deje que el auto gusanos mutagenizadas fertilizar. El uso de un microscopio estereoscópico, la pantalla de los fenotipos de la generación F2 de mutantes recesivos de interés. </li></ol> Parte 6: Psoralen mutagénesis En esta sección se describe el procedimiento para la mutagénesis con TMP en conjunto con luz ultravioleta de onda larga (UV). TMP / UV método de mutagénesis es ampliamente utilizado para inducir mutaciones de deleción en el genoma 3. <ol><li> Recoger los gusanos de 4-5, 6 cm de diámetro, las placas de Petri en un tubo de centrífuga de 15 ml, tal como se describe en el procedimiento anterior. </li><li> Agregar 10 ml de M9, invertir 20 veces para lavar los gusanos, y se centrifuga a 1500 xg durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante y repetir el lavado con un total de 3 veces. Aspirar el líquido y vuelva a suspender los gusanos en alrededor de 10 veces su volumen de M9 que contiene 30 mg / ml de TMP. Pipeta de 20 l de TMP (3 mg / ml) en 2 ml de M9. Como EMS, TMP es un potente cancerígeno y se debe manejar la adopción de medidas de seguridad adecuadas. Para evitar el riesgo potencial de la UV ojos la luz adecuada usa debe ser utilizado. Los materiales desechables se deben desechar en bolsas de bioseguridad adecuadas. </li><li> Incubar el tubo en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura ambiente en un agitador de baja velocidad (40 UPM). Ajuste el tubo cubierto verticalmente durante 10 minutos para permitir que todos los gusanos del fregadero. </li><li> Eliminar los gusanos de la parte inferior del tubo con una pipeta Pasteur y transferirlos a una placa de NGM cabeza de serie. Descartar el sobrenadante siguiendo las directrices de su institución químicos peligrosos. </li><li> Mantener la placa en la oscuridad hasta que el exceso de TMP se absorbe en el plato. </li><li> El uso de un medidor de intensidad de los rayos UV, establecer la distancia entre la fuente de luz UV de onda larga y la placa de tal manera que la intensidad de la placa es de 500 mW / cm 2 4. Quite la cubierta de aluminio y la tapa y la tapa y exponer la placa que contiene los gusanos TMP tratados con la radiación UV de onda larga de 50 segundos. </li><li> Tapar y dejar a los gusanos en la oscuridad durante 5 horas a temperatura ambiente. </li><li> Recogida y traslado de aspecto saludable J4 larvas frescas placas sembradas. Deseche la placa original siguiendo las directrices de su institución químicos peligrosos. </li><li> El uso de un microscopio estereoscópico, la pantalla de los fenotipos de la generación F2 de la mutación de interés. </li></ol> Parte 7: Resultados de Representante Algunos de los P. fenotipos mutantes pacificus resultantes de la mutagénesis (ya sea por EMS o TMP / UV) se muestran en la Figura 1. Cada mutante tiene un fenotipo característico que se distingue fácilmente de los animales de tipo salvaje. De los gusanosque fueron tratados con el mutágeno, 30 J3/J4 larvas de la generación parental (P0) se colocaron en platos separados y se les permite poner sus huevos, que son la generación F1. De las placas que mostraban plantas de la F1 saludable, un total de 1000 F1 fueron transferidos a platos individuales y la progenie F2 fue proyectado por los fenotipos. Los animales con Cochambrosa 5,6, falta de coordinación 6 y 7 fenotipos transformador se encontraron. <img src="/files/ftp_upload/2293/2293fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Pristionchus pacificus tipo salvaje y los animales mutantes. A. B. hermafrodita peso en peso masculino C. dpy mutante D. unc mutante E. tra mutante. Los dos primeros paneles que muestran de tipo salvaje hermafroditas (izquierda) y machos (derecha) para comparar con los diferentes mutantes en los paneles restantes.

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Mutagénesis es una técnica ampliamente utilizada para los estudios genéticos en varios organismos modelo experimental. Experimentos de mutagénesis se utilizan a menudo para identificar la función de un gen 2. Los procedimientos de mutagénesis descritos aquí pueden ser utilizados no sólo para P. pacificus, sino también para C. elegans y otras especies de nematodos relacionados. Aquí se describen dos métodos, EMS y mutagénesis TMP / UV. EMS es una sustancia química...

introducción al laboratorio de worm: el cultivo de gusanos de mutagénesis

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

Este protocolo describe los procedimientos para mantener los nematodos en el laboratorio y la forma de mutagenizar utilizando dos métodos alternativos: etil metano sulfonato (EMS) y 4 &quot;, 5, 8 trimetilpsoraleno-combinada con la luz ultravioleta (TMP / UV). Los nematodos son potentes sistemas biológicos para estudios de genética, debido a su plan de cuerpo simple y el sistema de apareamiento, que se compone de auto-fertilización de los hermafroditas y los hombres que pueden generar cientos de progenie por animal. Los nematodos son mantenidos en placas de agar que contiene un césped de bacterias y se pueden transferir fácilmente a partir de un plato a otro con un pico. EMS es un agente alquilante comúnmente utilizadas para inducir mutaciones puntuales y deleciones pequeñas, mientras que TMP / UV induce principalmente supresiones. Dependiendo de las especies de nematodos que se utiliza, las concentraciones de EMS y TMP tendrá que ser optimizada. Para aislar las mutaciones recesivas del nematodo Pristionchus pacificus, los animales de la generación F2 fueron examinados visualmente para fenotipos. Para ilustrar estos métodos, mutagénesis gusanos y buscó falta de coordinación (UNC), Cochambrosa (dpy) y transformador (TRA) mutantes.

La detección de mutantes con defectos fenotípicos es un método sencillo para identificar los genes que funcionan en un determinado proceso biológico. En este artículo se describe cómo los gusanos que viven la cultura libre (por ejemplo,<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt;) En el laboratorio y mostrar dos métodos diferentes de mutagénesis, EMS y TMP / UV.

Introducción al Laboratorio de Worm: El cultivo de gusanos de Mutagénesis

Este protocolo describe los procedimientos para mantener nematodos en el laboratorio y cómo mutagenizarlos utilizando dos métodos alternativos: el etilmetansulfonato...

El objetivo general de este procedimiento es realizar dos protocolos de mutagénesis diferentes que se utilizan comúnmente para generar mutantes y nematodos, como ceno, hepatitis elegance y prisca. La mutagénesis por Pacificus es una herramienta poderosa para descubrir la función de los genes. Esto se logra primero preparando cultivos con un gran número de gusanos en la última etapa larval antes de la edad adulta, con los cuales se llevará a cabo la mutagénesis.El siguiente paso consiste en inducir mutaciones en los gusanos utilizando dos procedimientos alternativos: tratamiento con etil metanosulfonato o mutagénesis por rayos ultravioleta en combinación con calor. El tercer paso del procedimiento es transferir gusanos con aspecto saludable a placas de agar, recién sembradas con bacterias, que constituyen su fuente de alimento. El paso final del procedimiento es seleccionar fenotipos mutantes de interés en la primera, segunda o tercera generación.Hola, soy Jore del laboratorio del Dr. Andre Perez, el Silva del Departamento de Biología de la Universidad de Texas en Arlington. Los procedimientos de mutagénesis con T-M-P-U-V y EMS ayudan a responder preguntas clave en el campo de la investigación genética, como qué genes están involucrados en procesos biológicos que desempeñan un papel importante durante el desarrollo. Hola, me llamo Manish Phar; aunque los métodos de mutagénesis demostrados serán para Pristi Onca S Pacificus, pueden emplearse muy comúnmente en otros modelos experimentales como el nematodo Caenorhabditis elegans, e incluso en vertebrados como el pez cebra.Así que comencemos. Nuestra herramienta para transferir gusanos de un lugar a otro está hecha de alambre de platino al 90% y de iridio al 10%, calibre 30. Aunque algunos investigadores pueden preferir composiciones metálicas ligeramente diferentes para fabricar una herramienta, también se utiliza una pipeta de Pasteur para sostenerla.Comience por romper la punta alargada de la pipeta de pastoreo hasta la longitud requerida. Corte entre tres y cuatro centímetros de alambre y coloque 0,5 centímetros de él dentro de la punta de la pipeta de pastoreo; selle el alambre en el vidrio sobre un mechero Bunsen.La longitud del alambre que sobresale del vidrio es de aproximadamente tres a tres centímetros y medio, aunque puede variar según las preferencias individuales. Aplane el extremo del alambre que sobresale utilizando alicates. Luego, doble la parte aplanada hacia arriba para formar una cuchara.Finalmente, suavice los bordes afilados del punzón con papel de lija para evitar dañar al gusano o al agar. Para seleccionar gusanos, esterilice el alambre del punzón en una llama y luego arrastre la punta aplanada a lo largo de un césped bacteriano en una placa de árbol NGMP para recubrir la punta con bacterias espesas y pegajosas. Tenga cuidado de no perforar ni dañar la superficie de agar, utilizando un microscopio estéreo con mucha suavidad.Cepille la punta pegajosa contra el gusano que se desea recoger hasta que el gusano se adhiera a las bacterias de la punta. Una vez que el gusano esté en la punta del asa, transfiéralo inmediatamente a la nueva placa tocando o deslizando la punta del asa contra el césped bacteriano de la nueva placa. Se debe tener cuidado de no dañar la superficie de agar de la placa, ya que los gusanos podrían arrastrarse hacia los agujeros y volverse difíciles de recuperar.El gusano debe arrastrarse fuera de la punta cuando toque o deslice la punta del asa sobre el césped bacteriano. El gusano no debe permanecer en la punta durante demasiado tiempo, ya que podría desecarse. Demostraremos la mutagénesis con EMS en cuatro o cinco placas de Petri de seis centímetros de diámetro con gusanos de Prisca pacificus en la tercera etapa larval juvenil.Lave los gusanos de cada placa utilizando de dos a tres mililitros de M nueve estéril por placa. Debe haber unos pocos cientos de gusanos. Recolecte los gusanos en un tubo cónico estéril desechable de 15 mililitros.Centrifugar a 1500 G durante cinco a siete minutos o hasta que los gusanos formen un pellet. Aspirar el líquido y usar dos mililitros de M nueve para resuspender los gusanos usando guantes dobles y trabajando en una campana extractora. Añadir 20 microlitros de EMS a un tubo que contenga dos mililitros de M nueve y agitar para disolverlo. Luego, añadir esta mezcla a dos mililitros de suspensión de gusanos y mezclar suavemente mediante movimientos de giro.La concentración final de EMS será de 47 milimolares. Coloque el tubo de centrífuga con paraformo en un agitador de baja velocidad dentro de la campana extractora y deje que los gusanos se incuben durante tres horas y media. Al final de la incubación de tres horas y media, coloque el tubo en posición vertical y continúe la incubación hasta que los gusanos se sedimenten; a continuación, aspire el sobrenadante y deséchelo en un vaso de precipitados que contenga hidróxido de sodio 1 N para inactivar el EMS en el sobrenadante.Cada vez antes de retirar las manos de la campana extractora, asegúrese de enjuagarlas también en hidróxido de sodio uno molar. Para inactivar el EMS, añada cinco mililitros de M nueve a los gusanos. Invierta el tubo de 25 a 30 veces para lavar los gusanos y centrifugue a 1500 G durante cinco a siete minutos o hasta que los gusanos formen un botón tras la centrifugación, aspire el sobrenadante y deséchelo en el recipiente de hidróxido de sodio uno molar.Repita este paso de lavado de agregar M nueve y centrifugar, y eliminar el sobrenadante al menos tres veces. Después del lavado final, resuspenda el pellet de gusanos en una cantidad mínima de M nueve, aspire la suspensión de gusanos y colóquela en placas NGM que contengan un césped de bacterias OP 50. Después de dejar secar el líquido durante unos minutos, seleccione y transfiera larvas J cuatro con aspecto saludable a placas frescas sembradas.Deje que los gusanos mutagénicos se autofecunden unos ocho a diez días después; utilice un microscopio estereoscópico para analizar los fenotipos de la generación F2 en busca de mutantes excesivos de interés. Este procedimiento de mutagénesis se demostrará en gusanos de ppac pacificus procedentes de placas de Petri de cuatro a cinco/seis centímetros de diámetro, recolectados en un tubo cónico de 15 mililitros. Añada 10 mililitros de M nueve al pellet de gusanos.Dar la vuelta 20 veces para lavar los gusanos y centrifugar a 1500 Gs durante cinco minutos. Desechar el sobrenadante después de la centrifugación. Repetir el lavado de los gusanos con M nueve para un total de tres veces; después del lavado final, aspirar el líquido y resuspender los gusanos en aproximadamente 10 veces su volumen de M nueve.Luego, agregue 4 5 8 trimetil SOREIN o TMP desde un stock de tres miligramos por mililitro para obtener una concentración final de 30 microgramos por mililitro. Incube el tubo en oscuridad a temperatura ambiente sobre un agitador de baja velocidad durante 15 minutos. Después de la incubación, coloque el tubo verticalmente durante 10 minutos para permitir que todos los gusanos se hundan. En este video, el tubo se muestra descubierto, pero la solución de TMP no debe exponerse a la luz.Dado que este producto químico es sensible a la luz, utilice una pipeta Pasteur para retirar los gusanos del fondo del tubo y transfiéralos a una placa de NGM sin sembrar. Mantenga la placa en la oscuridad hasta que el TMP en exceso sea absorbido por la placa. Una vez que el TMP haya sido absorbido por la placa, los gusanos pueden tratarse con luz ultravioleta.Uno de los pasos más críticos en el procedimiento de neurogénesis por UV-TMP consiste en tener la distancia adecuada entre la fuente de UV de onda larga y la placa. Por ello, debemos ajustar la distancia varias veces para obtener la intensidad correcta de luz UV que incide sobre la placa. La intensidad debe registrarse mediante el medidor de intensidad y debe ser de 500 microvatios por centímetro cuadrado.Se debe utilizar protección ocular adecuada durante este paso debido al riesgo potencial de la luz ultravioleta. Utilizando un medidor de intensidad ultravioleta, determine la distancia desde la fuente de luz ultravioleta de onda larga que daría como resultado una intensidad de 500 microvatios por centímetro cuadrado.A continuación, retire el papel de aluminio y la tapa, y coloque la placa que contiene los gusanos tratados con TMP a una distancia de la lámpara de modo que la intensidad sobre la placa sea de 500 microvatios por centímetro cuadrado. Exponga la placa a la radiación UV de onda larga durante 50 segundos, cúbrala y deje los gusanos en la oscuridad durante cinco horas a temperatura ambiente. Después de cinco horas, seleccione y transfiera larvas J4 de aspecto saludable a placas frescas con siembra.Finalmente, analice la generación F1, F2 o F3 en busca de fenotipos de interés utilizando un microscopio estereoscópico. Aquí se muestran algunos de los fenotipos mutantes de ppac pacificus identificados en la generación F2 tras la mutagénesis con EMS o T-M-P-U-V. Los dos paneles superiores en estas imágenes son ejemplos de una hermafrodita silvestre y un macho silvestre.Cada mutante presenta un fenotipo característico que se puede distinguir fácilmente del animal de tipo silvestre. El panel C es un ejemplo de un mutante dumpy. El panel D muestra un mutante no coordinado y el panel E corresponde a un mutante transformer. Una vez dominada, la mutagénesis con EMS puede realizarse en cuatro horas y media, y la mutagénesis con TMP uuv puede llevarse a cabo en cinco horas y media si se realiza adecuadamente.Este período de tiempo también incluye el tiempo de incubación. No olvide que el EMS y el TMP son extremadamente peligrosos y que, al trabajar con ellos, siempre deben tomarse precauciones como usar una bata de laboratorio, guantes dobles, campana extractora y gafas de seguridad. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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