Name: Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-22T17:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Aprenda a generar células T antigénico-específicas en ratones mediante transducción retroviral de receptores de células T. Este protocolo eficiente facilita la investigación inmunológica y terapias contra el cáncer.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH (5U01CA137070) y la Sociedad Americana del Cáncer (RSG-09-070-01-LIB), un Premio de Investigación del Cáncer del Instituto Investigador (MK), una Asociación Americana del Corazón beca predoctoral (KM) y el Ministerio español de Educación y Ciencia Becas (APG). Nos gustaría agradecer a la Dr. Nicholas Restifo y el Dr. Zhiya Yu (NIH / NCI) por sus útiles sugerencias para el protocolo.

1. Prepare Construir retrovirales <ol><li> Sub-clon del receptor de células T (TCR) de genes de interés en un vector retroviral (Figura 1, los vectores de ejemplo pMSG 7, pMIGII 5,8, pMXs de Cellbiolabs). El TCR α y β gen de la cadena debe estar en el mismo vector bajo el control del mismo promotor para garantizar la igualdad de expresión. Si el TCR de interés humano, los dominios constantes humanos deben ser reemplazados por los dominios del ratón constante 9. Nuestra observación es que los TCR de cuerpo entero humanos no expresan establemente en el ratón de células-T. </li><li> Preparar ADN de alta calidad utilizando el plásmido Qiagen Maxi Kit de Preparación o producto similar. La concentración del plásmido debe estar en alrededor de 1 mg / mL. </li></ol> 2. Transfección y aislamiento de las células T Día 1 (células de la placa de embalaje) <ol><li> Desalojar de platino-E (Plat-E, Cellbiolabs) células retroviral envases con tripsina-EDTA y neutralizar con DMEM los medios de comunicación. </li><li> Centrifugar las células a 1000 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el botón celular en DMEM los medios de comunicación. </li><li> Determinar el número de células y diluir las células a 0.6x10 6 / mL. Placa 10 ml de suspensión celular en un 10 mm poli-lisina placa recubierta de cultivo de tejidos y crecer durante la noche en una celda de la incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> El día 0 (transfección) <ol start="4"><li> A la mañana siguiente, examinar las células bajo un microscopio de luz. Las células deben ser aproximadamente el 80% confluente. </li><li> Retire con cuidado los medios de comunicación de la placa. Lave las células una vez con PBS 1x y agregar 10 ml previamente calentada, fresco medios DMEM sin penicilina-estreptomicina (penicilina / estreptomicina). (Nota: penicilina / estreptomicina puede interferir con la transfección) </li><li> Preparar complejos de transfección. Prepare la mezcla de A y B de la siguiente manera: <table border="0"><tbody><tr><td> Mezcla A: El ADN del plásmido </td><td> 9 mg </td></tr><tr><td> PCL-Eco plásmido auxiliar </td><td> 6,3 mg </td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> 1,5 ml </td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td> Mezcla B: Lipopfectime 2000 </td><td> 60 l </td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> 1,5 ml </td></tr></tbody></table> Incubar A y B por separado durante 5 minutos a temperatura ambiente Mezcla de A y B juntos suavemente e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente para formar complejos de transfección. </li><li> Lentamente por goteo la mezcla (un total de 3 ml) en las células Plat-E. Agite suavemente la placa de un lado a otro para distribuir uniformemente la mezcla de transfección. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C / 5% CO 2 en un incubador de células. </li><li> Después de 6-8 horas, sustituya medio con 10 ml de medio DMEM fresco (con penicilina / estreptomicina) para la producción viral. </li></ol> Escudo plato con anticuerpos <ol start="10"><li> Ratón las células T necesitan ser activadas antes de transducción viral. Hay varias formas diferentes para activar las células T. Aquí se utiliza la placa de obligado anticuerpos anti-CD3e y anti-CD28. Prepare una mezcla de anticuerpos de 1 mg / ml de anti-CD3e y 2 mg / ml de anti-CD28 en PBS estéril. </li><li> Prescindir de 250 l de la mezcla de anticuerpos a cada pocillo de una placa de tejidos de 24 pocillos. La placa se puede recubrir toda la noche a 4 ° C o 2 horas a 37 ° C. </li></ol> Preparación de una sola célula de suspensión de bazo de ratón <ol start="12"><li> Cosecha de bazo de ratón y traslado al medio RPMI. </li><li> Colocar el bazo en un colador de la célula. Mash el bazo con un émbolo de la jeringa en una placa de cultivo de 5 cm de tejido. Enjuague las células de la células colador con PBS estéril. </li><li> Centrífuga 1000 xg, 5 min. </li><li> Desechar el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular en tampón de lisis ACK (2 ml por bazo). Incubar 2 a 3 minutos a temperatura ambiente. Añadir medio RPMI hasta 20 ml y centrifugar 1000 xg durante 5 min. </li><li> Desechar el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular en PBS estéril. Determinar el número de células y centrifugar 1000 xg durante 5 min a 4 ° C. Proceder al aislamiento de las células T. </li></ol> El aislamiento y la activación de las células T de ratón <ol start="17"><li> Magnéticamente identificar a las células de acuerdo con el manual del producto (CD8 + T-cell kit de aislamiento de Miltenyi Biotec). </li><li> Coloque una columna LS (Miltenyi Biotec) en el magnetic campo. Solicitar la suspensión de células etiquetadas en la columna. Recoge el flujo a través de (enriquecido ratón CD8 + células T). Lavar la columna tres veces con tampón 3 ml de acuerdo con el manual del producto y se combinan con las anteriores de flujo continuo. </li><li> Tinción de las células con anticuerpos anti-CD3e y anti-CD8a y analizar por citometría de flujo (Figura 2a). Para una separación típica, ~ 8.10% del total de células pueden ser aisladas. ~ 90% de las células aisladas son CD8 + T-células. </li><li> Centrifugar las células a 1000 xg, 5 min. Eliminar el sobrenadante. Resuspender el botón celular en medio RPMI con recombinante humano IL-2 (rhIL2, 20 ng / ml) a 1x10 6 / mL. </li><li> Justo antes de la adición de las células, eliminar la solución de anticuerpos de la placa (preparado previamente en 2.11). Enjuague cada pocillo con PBS estéril y PBS quitar. </li><li> Añadir 1 ml de la suspensión celular a cada pocillo. Poner la placa a 37 ° C / 5% CO 2 en una celda de la incubadora. </li></ol> 3. (Día 2 y Día 3) La infección de células T activadas <ol><li> Después de 2 días de producción de virus, el medio de la placa celular Plat-E debe ser de color amarillo. Transferir el sobrenadante viral a un tubo cónico de 15 ml. Agregar 10 ml de medio DMEM fresco a la plancha para la producción de más virus (Opcional). </li><li> Centrifugar el sobrenadante del virus a 1000 xg durante 5 min para eliminar los restos células. Transferir cuidadosamente el sobrenadante del virus a un nuevo tubo. Deje un poco de líquido en la parte inferior del tubo y no molestar a los restos células. </li><li> Recoger las células T activadas a partir de la placa en un tubo cónico de 50 ml. Determinar el número de células. Ahorra un poco de las células en un tubo separado para ser utilizado como negativos (sin transducidas) control. Centrifugar a 1000 xg durante 5 minutos y desechar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el botón celular en virus sobrenadante a 10 6 células por 1 ml con 20 ng / mL rhIL2 y 10 mg / mL de sulfato de protamina. Añadir 1 ml de suspensión celular a cada pocillo de una placa y 24. Resuspender las células en el tubo de control en el medio RPMI a la misma densidad celular con la misma cantidad de sulfato de protamina y rhIL2. Añadir a las células a la misma placa. </li><li> Envuelva el plato con film de plástico. Centrifugar 90 minutos a 2000 xg, a 32 ° C sin freno. </li><li> Después de la centrifugación, quite la película plástica. Añadir 1 ml de medio fresco RPMI con 20 ng / mL rhIL2 a cada pocillo. Colocar la placa de nuevo a la incubadora. </li><li> (Opcional) Mayor nivel de expresión de TCR se puede lograr mediante la recopilación de los virus sobrenadante y repetir el procedimiento de la infección en el día 3. </li></ol> 4. Expansión de las células y la evaluación de la eficiencia de transducción <ol><li> Examinar la transducción de células T al día. División de las células en proporciones 01:03, cuando sea necesario en medio RPMI rhIL2. No deje que un crecimiento excesivo de las células (medio se vuelve amarilla). </li><li> En el día 6 o 7 días, teñir las células con el anticuerpo y tetrámero MHC específicos para el TCR para evaluar la expresión de TCR en las células T a la superficie. Uso de la ONU-transduced las células T como de control (Figura 2c). </li><li> La transducción de células T están preparados para más aplicaciones posteriores. </li></ol> 5. Resultados representante A menudo es ventajoso para purificar subconjuntos de células T antes de la transducción de esplenocitos, aunque pueden ser transducidas sin purificación. De alta pureza subconjuntos de células T se pueden obtener utilizando comerciales bolas magnéticas (Figura 2a). Para evaluar el nivel de expresión de TCR en las células T, anticuerpos específicos para el TCR alfa o beta cadenas se pueden utilizar. Por lo general 30% al 80% de las células transducidas pueden expresar TCR (Figura 2b) en función de los genes de TCR y los títulos de virus. MHC específicos tetrámero para el TCR también se puede utilizar para verificar a fondo la expresión funcional del TCR (Figura 2c). <img src="/files/ftp_upload/2307/2307fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Ejemplo de gen del receptor de células T construcción de sub-clonado en un vector retroviral. Alpha de longitud completa y los genes de la cadena beta están unidos por un conector de auto-2A escindibles péptido 8. <img src="/files/ftp_upload/2307/2307fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Ejemplo de éxito en el aislamiento y la transducción de las células T de ratón. (A) células T CD8 fueron aislados a partir de esplenocitos con CD8a + T celda de aislamiento Kit (Miltenyi Biotec) y teñidas con anticuerpos anti-CD3e y anti-CD8a. Aisladas células T CD8 fueron transducidas con R6C12 TCR específico para humanos gp100: 209 -217 4 de péptidos y teñidas con anti-anticuerpos humanos vbeta 8 (b) y HLA-A2kb gp100 tetrámero (c).

<ol><li>Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+T+cells+%27see%27+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">How T cells 'see' antigen.</a> Nat. Immunol. 6, 239-245 (2005).</li>
<li>Berg, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen%2FMHC-specific+T+cells+are+preferentially+exported+from+the+thymus+in+the+presence+of+their+MHC+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Antigen/MHC-specific T cells are preferentially exported from the thymus in the presence of their MHC ligand.</a> Cell. 58, 1035-1046 (1989).</li>
<li>Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+antagonist+peptides+induce+positive+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">T cell receptor antagonist peptides induce positive selection.</a> Cell. 76, 17-27 (1994).</li>
<li>Yu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poor+immunogenicity+of+a+self%2Ftumor+antigen+derives+from+peptide-MHC-I+instability+and+is+independent+of+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Poor immunogenicity of a self/tumor antigen derives from peptide-MHC-I instability and is independent of tolerance.</a> J. Clin. Invest. 114, 551-559 (2004).</li>
<li>Holst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+T-cell+receptor+retrogenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of T-cell receptor retrogenic mice.</a> Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).</li>
<li>Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+regression+in+patients+after+transfer+of+genetically+engineered+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes.</a> Science. 314, 126-129 (2006).</li>
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<li>Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+antitumor+activity+of+murine-human+hybrid+T-cell+receptor+%28TCR%29+in+human+lymphocytes+is+associated+with+improved+pairing+and+TCR%2FCD3+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability.</a> Cancer Res. 66, 8878-8886 (2006).</li>
<li>Letourneur, F., Malissen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+a+T+cell+hybridoma+variant+deprived+of+functional+T+cell+receptor+alpha+and+beta+chain+transcripts+reveals+a+nonfunctional+alpha-mRNA+of+BW5147+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Derivation of a T cell hybridoma variant deprived of functional T cell receptor alpha and beta chain transcripts reveals a nonfunctional alpha-mRNA of BW5147 origin.</a> Eur. J. Immunol. 19, 2269-2274 (1989).</li>
<li>Bendle, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lethal+graft-versus-host+disease+in+mouse+models+of+T+cell+receptor+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Lethal graft-versus-host disease in mouse models of T cell receptor gene therapy.</a> Nat. Med. 16, 565-570 (2010).</li>
</ol>

Varios pasos son críticos para lograr resultados óptimos. Plat-E línea celular de empaquetamiento se debe mantener en buenas condiciones. Si es necesario, las células pueden ser pasados ​​un par de veces en medio DMEM con 1 mg / ml puromycin, mg 10 / blasticidin ml para evitar la pérdida de expresión retroviral estructura de proteínas. En el día de la transfección, las células deben ser confluentes ~ 80%. Muy pocas células o demasiadas puede reducir el título del virus. La calidad virus se puede comprobar mediante ensayos con líneas celulares que pueden ser fácilmente transducidas. Desde TCR requiere CD3 complejos que se expresa en la superficie celular, que utilizan de forma habitual 58α-/β- células de hibridoma 10 (una línea celular que no expresa endógeno α TCR o la cadena β, pero no expresa complejo CD3). Se obtiene casi el 100% de eficiencia de transducción de células de hibridoma cuando transducción de las células con 1 ml de sobrenadante de virus. Finalmente, las células T necesitan ser activados y proliferan porque retrovirus sólo puede infectar a las células en división activa. El método que aquí se presenta para la producción de antígenos específicos de células T tiene varias limitaciones. En primer lugar, es difícil alcanzar el 100% de eficiencia de la transducción de principal del ratón las células-T. Una parte de las células no expresan el TCR de interés. En segundo lugar, el TCR α transducidas y las cadenas de β puede mispair con TCR endógeno 9, que puede reducir el nivel de expresión del TCR de interés. Además, el TCR mispaired puede causar autoinmunidad en vivo 11. Finalmente, sólo hay un tiempo limitado de la transducción de células T puede ser utilizado. Después de aproximadamente una semana, las células sufren apoptosis a menos que se re-estimulado. Sin embargo, las células pueden agotarse y perder con funciones repetitivas re-estimulaciones.

Los medios de comunicación: Medio DMEM (calor DMEM +10% FBS inactivado + penicilina / estreptomicina + L-Glu + + piruvato de sodio no aminoácidos esenciales). Medio DMEM sin penicilina / estreptomicina (Igual que el medio DMEM, pero sin la adición de penicilina / estreptomicina). Medio RPMI (calor RPMI 10% FBS inactivado + L-Glu + no aminoácidos esenciales + β-Mercaphoethanol + penicilina / estreptomicina + piruvato sódico).

transducción retroviral de receptores de células t en ratones las células t

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Receptores de células T (TCR) juegan un papel central en el sistema inmunológico. TCR en la superficie de las células T pueden reconocer específicamente antígenos peptídicos presentados por las células presentadoras de antígeno (APC) 1. Este reconocimiento conduce a la activación de las células T y una serie de resultados funcionales (por ejemplo la producción de citoquinas, causando la muerte de las células diana). La comprensión del papel funcional de la TCR es fundamental para aprovechar el poder del sistema inmunológico para tratar una variedad de enfermedades relacionadas con la inmunología (por ejemplo el cáncer o la autoinmunidad). Es conveniente estudiar TCR en modelos de ratón, que se puede lograr de varias maneras. Hacer TCR transgénicos modelos de ratón es costoso y requiere mucho tiempo y en la actualidad sólo hay un número limitado de ellos dispone de 2-4. Por otra parte, los ratones con antígenos específicos de células T pueden ser generados por la médula ósea quimera. Este método también toma varias semanas y requiere de experiencia 5. Transducción retroviral de TCR en ratón in vitro activa las células T es un método rápido y relativamente fácil de obtener las células T de la deseada péptido-MHC especificidad. De antígenos específicos de células T se pueden generar en una semana y se utiliza en las aplicaciones posteriores. El estudio de las células T transducidas también tiene aplicación directa a la inmunoterapia humanos, como la transferencia adoptiva de células T humanas transducidas con el antígeno específico de TCR es una nueva estrategia para el tratamiento del cáncer 6. Aquí se presenta un protocolo para la transducción retroviral TCR en activa in vitro de las células T de ratón. Humanos y los genes del ratón TCR se puede utilizar. Retrovirus llevar genes específicos TCR se generan y se utilizan para infectar las células T de ratón activados con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. Después de la expansión in vitro, las células T transducidas son analizadas por citometría de flujo.

Se presenta un protocolo para producir antígenos específicos de células T de ratón usando la transducción retroviral

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

Los receptores de células T (TCR) desempeñan un papel central en el sistema inmunitario. Los TCR en la superficie de las células T pueden reconocer específicamente antígenos peptídicos presentados por antígenos...

El objetivo de este procedimiento es expresar receptores de células T específicos del antígeno funcionales en células T de ratón. Primero, transfecte una línea celular productora de retrovirus con un plásmido que contenga el gen del TCR de interés para empaquetar un retrovirus que exprese el TCR. A continuación, aísle y purifique células T de los bazo de ratón e infecte estas células T purificadas con el retrovirus producido en el primer paso.Finalmente, amplifique las células T transducidas para expresar y obtener niveles apreciables de receptor. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren la expresión de TCR funcionales específicos para antígenos en células T de ratón mediante citometría de flujo. Hola, mi nombre es Michelle Crow Guard.Estoy en el Instituto de Cáncer de la Escuela de Medicina de la Universidad de Nueva York (NYU). Hoy les mostraremos cómo transducir linfocitos T primarios; las personas que les mostrarán cómo hacerlo son Shiong, investigadora posdoctoral del laboratorio, Kaleena Melek, estudiante de posgrado del laboratorio, y Arian Perez Garcia, investigador posdoctoral del laboratorio. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como los ratones transgénicos es que requiere mucho menos tiempo.Este método puede ayudar a responder preguntas inmunológicas clave, como cuál TCR puede generar una mejor respuesta contra los antígenos. Esta técnica puede aplicarse en la terapia de transferencia adoptiva de linfocitos T, que ha demostrado ser prometedora para el tratamiento de pacientes con cáncer y consiste en la modificación in vitro de linfocitos T humanos para asegurar una expresión equitativa de las cadenas alfa y beta del receptor de linfocitos T. Subclonar el gen de interés en el mismo vector retroviral bajo control del mismo promotor.Prepare ADN de plasma de alta calidad utilizando el kit Kyogen Maxi prep y haga un stock de un microgramo por microlitro. Retire el medio de la placa con células empaquetadoras retrovirales de platino E y lave la placa una vez con un XPBS. Desprenda las células añadiendo tripsina-EDTA e incube a 37 grados Celsius durante unos minutos.Neutralice las células desprendidas con medio DMEM y transfiera a un tubo falcon. A continuación, centrifugue las células a 1000 veces G durante cinco minutos. Aspire el sobrenadante y re suspenda el sedimento celular en medio DMEM.Determine el número de células y diluya las células a 0,6 veces 10 a la seis por mililitro en una placa. Incube 10 mililitros de suspensión celular en una placa de cultivo tisular recubierta con polilisina de 10 milímetros durante la noche en una incubadora celular a 37 grados Celsius en un 5% de dióxido de carbono. A la mañana siguiente, examine las células bajo un microscopio óptico para verificar una confluencia aproximada del 80%.Retire suavemente el medio de la placa. Lave las células una vez con PBS 1X y agregue 10 mililitros de medio DMEM fresco precalentado sin penicilina ni estreptomicina. Para el complejo de transfección lipídico, prepare dos mezclas: una de Opti-MEM con ADN y la otra con el reactivo de lipofección, equilibre cada una por separado durante cinco minutos a temperatura ambiente.Luego mezcle suavemente y incube durante 20 minutos. A temperatura ambiente, gotee lentamente la mezcla en las células E de platino. Mueva suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás para distribuir uniformemente la mezcla de transfección.Luego incubar las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono en un incubador celular. Tras seis a ocho horas, sustituir el medio por 10 mililitros de medio DMEM fresco para la producción viral. Extraer el bazo de un ratón y transferirlo al medio RPMI.Coloque el bazo en un filtro celular. Triture el bazo con el émbolo de una jeringa en una placa de cultivo de tejidos de cinco centímetros. Enjuague las células del filtro celular con PBS estéril para recolectar las células y centrifugue a 1000 veces G durante cinco minutos.Deseche el sobrenadante. A continuación, resuspenda el botón celular en un tampón de lisis CK. Añada dos mililitros por bazo e incube durante dos minutos.A temperatura ambiente. Añada medio RPMI hasta 20 mililitros y centrifugue a 1000 ×g durante cinco minutos. Finalmente, re suspenda el botón celular en PBS estéril.Determine el número de células y centrifugue a 1000 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Con el fin de activar las células T de ratón antes de la transducción viral, recubra placas con anticuerpos activadores, específicamente anti CD tres épsilon y anti CD 28. Prepare una mezcla de anticuerpos de un microgramo por mililitro de anti CD tres épsilon y dos microgramos por mililitro de anti CD 28 en PBS estéril, distribuya 250 microlitros de la mezcla de anticuerpos en cada pocillo de la placa de cultivo celular de 24 pocillos e incube durante dos horas a 37 grados Celsius.Etiquete magnéticamente las células del bazo según el manual del producto. Coloque una columna LS en el campo magnético. Aplique la suspensión de células etiquetadas sobre la columna.Recoger el flujo de salida de las células T CD8+ enriquecidas de ratón. Lavar la columna tres veces con tres mililitros de tampón y combinar con el flujo previo. Marcar las células con anticuerpos anti-CD3 epsilon y anti-CD8 alfa y analizar mediante citometría de flujo.A continuación, centrifugue las células a 1000 veces G durante cinco minutos y re suspenda el sedimento celular a 1 millón de células por mililitro en medio RPMI con IL humana recombinante dos. Retire la solución de anticuerpos de la placa de activación. Enjuague cada pocillo con PBS estéril.Añada un mililitro de la suspensión celular a cada pocillo y coloque la placa a 37 grados Celsius, con 5% de dióxido de carbono, en un incubador de células. Después de dos días de producción del virus, el medio en la placa de células ESE platino debe volverse amarillo.Transfiera el sobrenadante viral a un tubo cónico de 15 mililitros para eliminar los restos celulares. Centrifugue el sobrenadante del virus S a 1000 ×g durante cinco minutos. Transfiera cuidadosamente el sobrenadante viral a un tubo nuevo.Deje algo de líquido en el fondo del tubo y no perturbe los restos celulares. Recopile las células T activadas de la placa en un tubo cónico de 50 milímetros. Determine el número de células.Guarde algunas células en un tubo separado para usarlas como control negativo. Centrifugue a 1000 veces G durante cinco minutos y deseche el sobrenadante. Luego, re suspenda el sedimento celular en sobrenadante vírico a 10⁶ células por mililitro con 20 nanogramos por mililitro de interleucina dos humana recombinante y 10 microgramos por mililitro de sulfato de proteína.Añada un mililitro de suspensión celular a cada pocillo de la placa de 24 pocillos para el tubo control. Resuspenda las células en medio RPMI a la misma densidad celular con la misma cantidad de proteína sulfato e interleucina humana recombinante dos. Añada las células a la misma placa.Envuelva la placa con una película de plástico y centrifugue durante 90 minutos a 2000 × g a 32 grados Celsius sin frenado. Después de la centrifugación, retire la película de plástico. Añada un mililitro de medio RPMI fresco con 20 nanogramos por mililitro de interleucina-2 humana recombinante a cada pocillo y regrese la placa al incubador.Es importante examinar diariamente las células T transducidas. Divida las células en relaciones de uno a tres según sea necesario. No permita que las células sobrepasen su capacidad de crecimiento ni que el medio se vuelva amarillo en el día seis o en el día siete.Coloque un tinte en las células con un anticuerpo y un tetrámero de MHC específicos para el TCR para evaluar la expresión del TCR en la superficie de las células T. Utilice las células T UNSD como control. Estas células T transducidas ya están listas para aplicaciones posteriores. Antes de la transducción viral, es ventajoso obtener subpoblaciones de linfocitos T de alta pureza utilizando perlas magnéticas comerciales para evaluar el nivel de expresión de los TCR en linfocitos T. Se pueden usar anticuerpos específicos para las cadenas alfa o beta del TCR.Típicamente, entre el 30 % y el 80 % de las células pueden expresar el TCR transducido, dependiendo de los genes del TCR y de los títulos virales. También se puede utilizar el tetrámero de MHC específico para el TCR para verificar adicionalmente la expresión funcional de los TCR. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en una semana si se lleva a cabo adecuadamente.Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener las células en condiciones saludables tras seguir este protocolo. Se pueden realizar otros métodos, como ensayos de citotoxicidad ácida o de liberación de citoquinas, con el fin de responder preguntas adicionales, como la especificidad y la sensibilidad de la transducción de los TCR.Después de ver este video, debería ser un experto en la transducción de su TCR favorito en linfocitos T primarios. Así que nos vemos en el laboratorio.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Esta técnica demuestra una forma eficiente de preparación defectuosa replicación retroviral acciones que codifica un oncogén humano, y, posteriormente, utilizado para la inducción de la enfermedad mieloproliferativa en el modelo de ratón.

La producción de replicación defectuosa Retrovirus por transfección transitoria de células 293T

Estamos aquí demostrar que la reprogramación epigenética mediante transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) puede ser utilizado como una herramienta para generar modelos de ratones con la pre-definido de receptores de células T (TCR) especificidades. Estos ratones transnuclear expresar la correspondiente TCR de su locus endógeno bajo el control del promotor endógeno.

Los ratones con Transnuclear predefinidos Especificidades receptor de células T contra la Toxoplasma gondii Obtenidos a través de la SCNT

Adenoviral la transferencia génica en células T con la expresión transgénica del receptor de adenovirus Coxsackie ingenuo CD4 permite el análisis molecular de la diferenciación de células T...

La transducción adenoviral de células T CD4 + naïve a estudiar la diferenciación Treg

Presentamos un protocolo rápido y flexible para un sistema de expresión in vivo basado en un solo receptor de células T (TCR) retroviral.  Los vectores retrovirales se utilizan para transducir células progenitoras de la médula ósea con el fin de estudiar el desarrollo y la función de las células T in vivo como alternativa a los ratones transgénicos TCR.

Retroviral transducción de células progenitoras de médula ósea para generar las células T del receptor Retrogenic ratones

Aquí se describe un nuevo método para generar receptores de células T específicas de antígeno (TCR) por el emparejamiento de la TCRα o TCR de un TCR existente, que posee la especificidad de antígeno de interés, con hemichain complementaria del repertorio de receptores de células T periféricas. Los TCR de novo generados conservan especificidad de antígeno con afinidad variable.

Generando<em&gt; De Novo</em&gt; T humanas receptores de células específicas de antígeno por retroviral Transducción de Centric Hemichain

Muchos sistemas experimentales se han utilizado para entender los mecanismos que regulan el desarrollo de células T y la función en una respuesta inmune. Aquí se describe un enfoque genético usando la transducción retroviral, que es económico, eficiente en tiempo, y lo más importante, muy informativos en la identificación de las vías de regulación.

Retroviral transducción de células T colaboradoras como un enfoque genético para estudiar mecanismos que controlan su diferenciación y función

El actual combina protocolo célula emparejados humano TCR alfa y beta cadena secuenciación con optimiza generación de vectores retrovirales compatibles con expresión de TCR in vitro e in vivo .

Aerodinámico unicelular TCR aislamiento y generación de vectores retrovirales para In Vitro y In Vivo expresión de TCR humana

Delineamos un protocolo de 9 días para la transducción y expansión de células mononucleares de sangre periférica de rhesus macaque que produce células con excelente coexpresión de los genes de interés en número suficiente para estudios de infusión de eficacia celular.

Transducción y expansión de células T primarias en nueve días con mantenimiento del fenotipo de memoria central

Aquí describimos un método para la sobreexpresión retroviral y la transferencia adoptiva de células murinas B-1a para examinar la migración celular in vivo B-1a y la localización. Este protocolo puede ampliarse para diversos ensayos funcionales posteriores, incluida la cuantificación de la localización celular del donante B-1a o el análisis de factores secretos derivados de células de donantes después de la transferencia adoptiva.

Sobreexpresión retroviral de CXCR4 en células murinas B-1a y transferencia adoptiva para la migración celular B-1a dirigida a la médula ósea y la producción de IgM

El estudio actual muestra protocolos para evaluar el compromiso del destino temprano de las células TFH específicas del virus y manipular la expresión génica en estas células.

Acceso a la diferenciación temprana de células T CD4+ auxiliares foliculares específicas del virus en ratones infectados con LCMV agudo

Presentamos protocolos mejorados para la transducción retroviral de receptores de tráfico y el homing competitivo para estudiar el posicionamiento de linfocitos específicos de órganos y microambientes mediados por receptores. Este método ofrece información valiosa sobre los mecanismos de tráfico de células inmunitarias y tiene aplicaciones potenciales en futuras investigaciones básicas y terapéuticas.

Transducción retroviral eficiente y localización competitiva para investigar la localización de células T mediada por GPCR en diversos microentornos tisulares

Aprenda a generar células T antigénico-específicas en ratones mediante transducción retroviral de receptores de células T. Este protocolo eficiente facilita la investigación inmunológica y terapias contra el cáncer.

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

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