Estrategia de transfección optimizados para la expresión y el registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes del voltaje en las células HEK-293T

La electrofisiología se usa comúnmente para estudiar la actividad de los canales iónicos recombinantes dependientes de voltaje en células de riñón embrionarias humanas cultivadas. El registro exitoso requiere que las células expresen canales a niveles suficientes en la membrana celular para la detección y que las células se siembren con una densidad celular lo suficientemente baja para el aislamiento de células individuales. La realización de registros celulares se ve frecuentemente obstaculizada por los largos períodos de incubación a 28 grados Celsius necesarios para dicha expresión, donde normalmente hay una pérdida de adhesión celular y estabilidad de la membrana.

Aquí, se demuestra un método optimizado para el cultivo celular y la transfección que evita estos problemas. Las células se transfectan a una fluidez moderada, luego se incuban a 28 grados centígrados hasta que se logra una expresión adecuada del canal iónico. A continuación, las células transfectadas se colocan en cubreobjetos de vidrio a baja densidad y se incuban a 37 grados centígrados durante varias horas para permitir la unión de las células y la estabilización de la membrana.

Una vez que están adecuadamente plachadas, las células se identifican mediante EGFP coexpresado y pinza de parche de célula completa. Se puede realizar un registro o las células se pueden incubar una vez más a 28 grados centígrados. Para aumentar aún más, la expresión de la superficie del canal, los resultados de los experimentos de registro en células transfectadas con canales de calcio dependientes de voltaje, como L CAV, uno, L, CAV, dos o L cav tres, indican que los canales han sido transfectados y expresados con éxito por las células.

Aunque en nuestro laboratorio solo se muestran resultados representativos para L CAV tres, hemos desarrollado un método para mejorar la expresión de genes de canales iónicos de mala expresión para el registro de patch clamp en líneas celulares humanas. Ahora, el enfoque convencional es dividir primero las células en los cubreobjetos y transfectarlas con CDNA plasmáticos que contienen los genes de los canales iónicos, y luego incubar durante muchos días a 28 grados Celsius para lograr una expresión de canales iónicos de alta eficiencia antes del registro electrofisiológico. Nuestro nuevo enfoque reduce en gran medida el tiempo de incubación requerido a 28 grados centígrados antes del registro.

Ahora, al disminuir el tiempo de incubación de 28 grados, encontramos que las membranas celulares son mucho más estables y las células transfectadas se adhieren mucho más a los cubreobjetos. Esto aumenta el número de celdas registrables y hace que la experimentación sea significativamente más eficiente. Antes de la transfección, se dividió un matraz completamente confluente de células T HEK 2 9 3, de una a cuatro, en un nuevo matraz de 25 centímetros cuadrados y se colocaron las células en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius.

Deje que las celdas se conecten durante tres o cuatro horas después de cuatro horas, examine las celdas mediante contraste de interferencia diferencial para verificar la conexión. Tenga en cuenta que las celdas ya no se ven redondas y se están aplanando. Las extensiones o seudópodos son visibles.

Las celdas menos confluencias tendrían el mismo aspecto, pero estarían más espaciadas. Una vez que las células se hayan unido, combine los reactivos necesarios para realizar una transfección estándar de fosfato de calcio. Prepare un total de 12 microgramos de ADN en 600 microlitros de solución de transfección por matraz.

Aquí, los CDNA de varios canales iónicos se clonan en el P-I-R-E-S dos plásmidos EGFP Transfección de este vector de expresión en una línea celular de mamífero. Los resultados son la producción de una proteína verde fluorescente mejorada a partir del mismo ARNm que el inserto clonado a través de la traducción iniciada en un sitio de entrada de ribosoma interno justo aguas abajo de la secuencia de recubrimiento del canal iónico y aguas arriba de la secuencia de recubrimiento de EGFP. Esto permite identificar las células transfectadas positivamente sin posibles interferencias en la función de la proteína que pueden ser causadas por la fusión de la proteína EGFP directamente con la proteína de interés.

Pipetee la solución de transfección sobre las células gota a gota, luego agite suavemente el matraz y colóquelo en la incubadora a 37 grados Celsius durante la noche del día siguiente. Verifique la eficiencia de la transfección observando las células bajo un microscopio de fluorescencia. Las células transfectadas positivamente deben aparecer de color verde en toda la célula.

Una vez que se haya verificado la transfección, pipetear cuidadosamente de cuatro a cinco mililitros de medio caliente en el matraz invertido. Lave las celdas girando lentamente el matraz para que la superficie de la celda quede hacia abajo y balanceando el matraz para que la solución de lavado se mueva suavemente sobre ellas. Retire el medio y repita este lavado.

Da dos pasos más. A continuación, añada seis mililitros de medio al matraz e incube a 37 grados centígrados durante dos horas. La expresión de los canales iónicos de los invertebrados presenta algunos desafíos.

En primer lugar, suelen ser de gran tamaño y, por lo tanto, pueden tardar mucho tiempo en traducirse en el retículo endoplásmico. Además, es posible que no se dirijan de manera eficiente a la membrana celular en una línea celular de mamíferos. Finalmente, dado que las diferentes especies exhiben diferentes frecuencias de uso de codones, los CDNA heterólogos pueden albergar altas frecuencias de codones que son poco comunes en células de mamíferos como HEK 2 9 3 T para superar algunas de estas dificultades.

Después de la incubación de dos horas a 37 grados centígrados después del lavado transfectivo, transfiera los matraces a una incubadora a 28 grados centígrados durante dos a seis días para extender el período de extracción. El tiempo de incubación debe determinarse empíricamente para cada tipo de canal iónico que se exprese. Dado que la incubación a 28 grados centígrados durante períodos de tiempo prolongados conduce al desprendimiento de células y a una mala estabilidad de la membrana.

Es necesaria una mayor preparación de la célula antes de realizar estudios electrofisiológicos. En primer lugar, retire el medio de las células transfectadas mediante una pipeta de aspiración de un mililitro de solución de tripsina a 37 grados centígrados en un matraz invertido. A continuación, vuelva a colocar suavemente el matraz en la posición de la superficie de la célula hacia abajo para permitir que la tripsina corra suavemente sobre las células.

Vuelva a dar la vuelta al matraz y retire la tripsina. Luego agregue 250 microlitros de tripsina tibia directamente sobre las células e incube a 37 grados centígrados durante tres a cinco minutos hasta que las células se desprendan. Mientras tanto, coloque de tres a ocho cubreobjetos recubiertos de poli L lisina en un plato de cultivo de 60 milímetros y agregue cinco mililitros de medio de cultivo tibio.

Una vez que las células se hayan desprendido, suspenderlas en cuatro mililitros de medio tibio pipeteando hacia arriba y hacia abajo unas seis veces, con la punta de la micropipeta, empuje hacia abajo los cubreobjetos para asegurarse de que están en el fondo de la placa. Luego agregue de 250 a 500 microlitros de células resuspendidas. Incubar las células a 37 grados centígrados durante tres horas para permitir que se adhieran a los cubreobjetos.

Dejar las células durante demasiado tiempo a 37 grados dará lugar a la división celular y a la dilución de los plásmidos transfectados. Las células transfectadas deben sembrarse a una densidad lo suficientemente baja como para que estén aisladas unas de otras, como se muestra aquí. Esto facilitará el registro electrofisiológico.

Para las células que requieren subunidades accesorias, a menudo es necesario transferir las células a 28 grados centígrados e incubarlas durante tres o cuatro días adicionales antes de la electrofisiología. El registro se lleva a cabo para las células que no requieren subunidades accesorias. El registro se puede realizar inmediatamente después de esta incubación.

El equipo de electrofisiología utilizado aquí incluye un amplificador, manipuladores motorizados de doble pipeta, microscopio de epifluorescencia y sistemas de perfusión. El equipo se ha montado sobre una mesa de aislamiento de vibraciones y se ha desplazado. El ruido eléctrico está limitado por un sistema de control electrónico de 40 pulgadas de alto tipo dos jaulas de hurones, incluida una PC equipada con un dígito de datos 1440, una interfaz de convertidor de analógico a digital junto con el software P clamp 10.1.

El amplificador de monitor de computadora, el manipulador motorizado y un sistema de control de profusión de enlace de válvula están montados fuera de la jaula de Faraday. En un rack eléctrico metálico independiente de 19 pulgadas, todo el equipo eléctrico está conectado a tierra a un distribuidor de cobre y conectado a un transformador de aislamiento de grado médico, que proporciona aislamiento de línea, una conexión a tierra constante y supresión de sobretensiones. Prepárese para los experimentos montando micropipetas pulidas al fuego con una resistencia de dos a cinco mega ohmios en el soporte de micropipetas en la etapa principal.

Las pipetas de parche se llenan con una solución interna para eliminar las burbujas de aire y finalmente se montan en la etapa principal. A continuación, con pinzas, transfiera un cubreobjetos con celdas chapadas a una placa de Petri de plástico de 35 milímetros que contenga tres mililitros de solución de registro externa a temperatura ambiente. El volumen de la solución de registro debe medirse con precisión cuando se realizan experimentos con medicamentos durante los cuales se agregan cantidades conocidas de medicamento a la placa con una micropipeta, coloque la placa en la platina del microscopio.

A continuación, llene una media celda de soporte de microelectrodos con cloruro de cesio de tres molares. A continuación, inserte el electrodo de referencia en la media celda y coloque el electrodo de tierra en el baño con el manipulador de microm, baje la pipeta de parche en la solución de baño. Visualice las células en modo de fluorescencia y centre una célula verde adherente aislada y transfectada positivamente en el centro del campo de visión.

Mientras está en modo de baño, acerque la pipeta de parche a la celda. Ponga a cero la traza de onda cuadrada observada en la pantalla de la computadora. Ajuste la posición de la pipeta de parche para que solo toque la celda y la traza de corriente cuadrada en la pantalla comience a fluctuar.

Aplique una succión suave con una jeringa adjunta hasta que se forme un sello de giga ohmios. Una vez que se logre un sello de giga ohmios, cambie el programa al modo de parche. Aplique un pulso rápido de succión con la jeringa para romper la membrana celular.

A continuación, cambie al modo de célula y utilice los parámetros de toda la célula en el amplificador. Para compensar el transitorio capacitivo, es necesario equilibrar el parche para que la solución de registro intracelular se dialice en la célula parcheada. Ingrese los protocolos de pinza de voltaje escritos para este experimento aquí.

El experimentador ha diseñado un protocolo para medir las corrientes iónicas a través de canales iónicos dependientes de voltaje que se producen cuando se modula el voltaje a través de la membrana celular. En este caso, estamos ante un protocolo IV que especifica que el software mantiene la celda a menos 110 milivoltios y luego SEP a menos 70 milivoltios durante 250 milisegundos. Luego vuelva a bajar a menos 110 milivoltios de potencial de retención cada vez que el paso aumente en 10 milivoltios para que los pasos sean a menos 70 milivoltios, menos 60 milivoltios, etc., hasta que el último paso sea a más 20 milivoltios.

Filtre las corrientes registradas a 10 kilohercios usando un filtro Bessel de paso bajo en el amplificador y digitalice a una frecuencia de muestreo de dos kilohercios usando el software clamp X 10.1 use solo grabaciones con fuga mínima inferior al 10%Para el análisis, las células T HEK 2 93 se cultivaron y transfectaron con L Cav. Tres canales de calcio como se muestra aquí. La transfección exitosa de CDNAs de canal iónico heterólogo fue indicada por fluorescencia generada a partir del vector P-I-R-E-S dos eeg FP.

Aquí mostramos la expresión exitosa de un canal de calcio cav de tres voltajes de invertebrados. Cuando las células no se transfectan, no se pueden provocar corrientes de calcio. Mientras que las celdas transfectadas generan grandes corrientes cuando se aplican protocolos de pinza de voltaje de celda completa a las celdas.

Los experimentadores pueden utilizar diversas condiciones electrofisiológicas y regímenes de análisis de datos en función de sus necesidades. Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar su propio juicio con respecto al momento de los experimentos. Dado que los diferentes canales se expresan con diferentes eficiencias en la membrana celular, depende de usted determinar la estrategia óptima a utilizar para aumentar la viabilidad de las células, así como maximizar la expresión superficial de los canales que le interesan.

Después de ver este video, esperamos que haya adquirido una buena comprensión de cómo cultivar y mantener una línea celular humana, así como cómo transfectar CDNA de canales iónicos heterólogos y CDNA de subunidades en estas células. Para registro electrofisiológico.