Name: Estrategia de transfección optimizados para la expresión y el registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes del voltaje en las células HEK-293T (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-19T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Aprende una estrategia de transfección optimizada para la expresión y registro electrofisiológico de canales iónicos recombinantes en células HEK-293T. Este método mejora la adhesión celular y la estabilidad de la membrana.

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Este trabajo fue apoyado por una subvención de funcionamiento Discovery para JDS de la de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación (NSERC) de Canadá, una NSERC Alexander Graham Bell Canada Becas de Posgrado (doctorado) (A. Senatore) y la Fundación Heart and Stroke, Grant -En-Aid NA # 6284.

<ol><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).</li>
<li>Senatore, A., Spafford, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+big+are+key+features+of+an+invertebrate+T-type+channel+%28LCav3%29+from+the+central+nervous+system+of+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).</li>
<li>Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOgden%2C+D+%22Microelectrode+techniques%3A+the+Plymouth+workshop+handbook%22">Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook</a>. , The Company of Biologists. Cambridge. (1987).</li>
<li>Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. England. (2003).</li>
<li>Peng, S. -Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow-induced+increase+in+inward+Ba2%2B+current+expressed+in+HEK293+cells+transiently+transfected+with+human+neuronal+L-type+Ca2%2Bchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels.</a> Brain Research. 1045, 116-123 (2005).</li>
</ol>

Ser capaz de grabar de células enteras corrientes utilizando los protocolos descritos y las soluciones indica que la transfección se ha realizado correctamente y que la tensión deseada canales iónicos o complejos de los canales iónicos están presentes con importantes cantidades en la membrana celular. En caso de que las células transfectadas de manera positiva (es decir, verde fluorescente), pero no tienen corrientes de grabación, el tiempo adicional a los 28 ° C puede ser necesaria para permitir la proteína del canal d...

<table border="1"><tr><td> Material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentario </td></tr><tr><td> pIRES2-EGFP plásmido </td><td> Clontech </td><td> 6029-1 </td><td></td></tr><tr><td> Círculo de vidrio cubreobjetos </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-545-80 </td><td> Círculos No. 1 - 0,17 mm de espesor de 0,13 a, Tamaño: 12 mm </td></tr><tr><td> Amplificador </td><td> Axon Instruments </td><td> Axopatch 200B o 700B MultiClamp </td><td></td></tr><tr><td> Sistema de Adquisición de Datos </td><td> Axon Instruments </td><td> Digidata 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Software de Electrofisiología </td><td> Axon Instruments </td><td> pClamp10.1 </td><td></td></tr><tr><td> Pipeta de manipuladores </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> MPC-385 a 2 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio invertido de epifluorescencia </td><td> Zeiss Canadá </td><td> Axiovert 40 CFL </td><td></td></tr><tr><td> Headstage </td><td> Axon Instruments </td><td> CV-7B </td><td></td></tr><tr><td> Headstage portaelectrodos </td><td> Axon Instruments </td><td> 1-HL-U </td><td></td></tr><tr><td> Microelectrodo soporte para electrodo de tierra </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> MEH3RF 15 </td><td></td></tr><tr><td> Electrofisiología tubos capilares </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> BF-150-86-15 </td><td> Vidrio de borosilicato con filamento, OD 1.5mm OD, 0.86mm, 15 cm de largo </td></tr><tr><td> Flaming / Brown Micropipeta Extractor </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipeta fuego pulidor </td><td> Narishige </td><td> Micro Forge MF-830 </td><td></td></tr><tr><td> Micro sistema de perfusión de drogas </td><td> AutoMate Científico </td><td> SmartSquirt8 Valvelink8.2 </td><td></td></tr><tr><td> Sistema de perfusión de drogas </td><td> AutoMate Científico </td><td> Valvelink8.2 con Teflon válvulas </td><td></td></tr></table>

estrategia de transfección optimizados para la expresión y el registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes del voltaje en las células hek-293t

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

La expresión in vitro y de registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes dependientes de voltaje en cultivos de células de riñón embrionario humano (HEK-293T) es una estrategia de investigación en todas partes. HEK-293T las células deben ser sembradas en cubreobjetos de vidrio con una densidad lo suficientemente baja para que no estén en contacto unos con otros con el fin de permitir registro electrofisiológico, sin factores de confusión debido al contacto con las células adyacentes. Canales transfectadas también debe expresarse con la máxima eficiencia en la membrana plasmática de células enteras de grabación de patch clamp de las corrientes detectables por encima de los niveles de ruido. Canales de iones heteróloga a menudo requieren largos períodos de incubación a 28 ° C después de la transfección con el fin de lograr la adecuada expresión en la membrana, pero cada vez hay más pérdidas de adhesión célula-cubreobjetos y estabilidad de la membrana a esta temperatura. Para evitar este problema, hemos desarrollado una estrategia optimizada para transfectar y la placa de HEK-293T las células. Este método requiere que las células se transfectaron en una confluencia relativamente alto, y se incuba a 28 ° C durante diferentes períodos de incubación después de la transfección para permitir la expresión de la proteína adecuada de los canales iónicos. Células transfectadas se está chapada en cubreobjetos de vidrio y se incuba a 37 ° C durante varias horas, lo que permite la adhesión celular rígido para los cubreobjetos y re-estabilización de la membrana. Las células se pueden grabar poco después de la siembra, o pueden ser transferidos a 28 ° C de incubación. Nos encontramos con que la incubación inicial a 28 ° C, después de la transfección de las placas, pero, es la clave para la expresión eficaz de los canales iónicos heteróloga que normalmente no se expresan así en la membrana plasmática. Positivamente transfectadas, las células cultivadas se identifican por co-expresó eGFP o eGFP expresa a partir de un vector bicistrónico (por ejemplo, pIRES2-EGFP) que contiene el canal de iones cDNA recombinante justo aguas arriba de un sitio interno de entrada de ribosomas y una secuencia de codificación eGFP. De células enteras de grabación de patch clamp requiere equipo especializado, además de la elaboración de electrodos de registro y pulido en forma de L electrodos de masa de vidrio de borosilicato. La administración de fármacos para el estudio de la farmacología de los canales iónicos se puede conseguir directamente micropipetting drogas en el plato de grabación, o mediante el uso de microperfusión o sistemas de desagüe que producen flujos ininterrumpidos de solución del fármaco sobre las células registrado.

Método fiable para alta eficiencia<em&gt; In vitro</em&gt; Expresión y posterior registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes dependientes de voltaje en cultivos de células de riñón embrionario humano (HEK-293T).

Estrategia de transfección optimizados para la expresión y el registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes del voltaje en las células HEK-293T

La expresión in vitro y el registro electrofisiológico de canales iónicos dependientes de voltaje recombinantes en células cultivadas de riñón embrionario humano (HEK-293T)...

La electrofisiología se utiliza comúnmente para estudiar la actividad de canales iónicos regulados por voltaje recombinantes en células de riñón embrionario humano cultivadas. Para obtener grabaciones exitosas, es necesario que las células expresen los canales a niveles suficientes en la membrana celular para su detección y que se siembren a una densidad celular lo suficientemente baja como para aislar células individuales. La realización de grabaciones celulares se ve frecuentemente obstaculizada por los largos períodos de incubación a 28 grados Celsius necesarios para dicha expresión, durante los cuales suele producirse una pérdida de adhesión celular y estabilidad de la membrana.Aquí se muestra un método optimizado para el cultivo celular y la transfección que evita estos problemas. Las células se transfectan a una confluencia moderada, luego se incuban a 28 grados Celsius hasta alcanzar una expresión adecuada de canales iónicos. A continuación, las células transfectadas se siembran sobre cubreobjetos de vidrio a baja densidad y se incuban a 37 grados Celsius durante varias horas para permitir la adhesión celular y la estabilización de la membrana.Una vez que las células adecuad

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Biology

Biología

Vamos a demostrar la forma de estudiar el efecto de un único punto de mutación en la función de un canal iónico.

Mutagénesis y análisis funcional de los canales iónicos heteróloga se expresa en células de mamífero

Descrito aquí es un procedimiento para la obtención de largos tramos de grabación actual de un canal de iones con la técnica de patch-clamp de células-adjunto. Este método permite observar, en tiempo real, el modelo de open-close conformaciones de canales que son la base de la señal biológica. Estos datos informan acerca de las propiedades de los canales en las membranas biológicas inalteradas.

Un canal celular conectado a Patch-clamp grabación

La expresión de proteínas recombinantes por sistemas de mamíferos se está convirtiendo en un método atractivo para producir complejos de proteínas para biología estructural. Aquí presentamos un sistema de expresión simple pero altamente eficiente utilizando células de mamíferos cultivadas en suspensión para purificar complejos de proteínas para estudios estructurales.

Expresión de proteínas recombinantes para la Biología Estructural en HEK 293F Suspensión Células: Un enfoque novedoso y accesible

Se describe un método para obtener imágenes de los cambios en el potencial de membrana utilizando indicadores de voltaje codificados genéticamente.

Membrana de imagen potencial con dos tipos de sensores de tensión fluorescentes genéticamente codificados

La producción a escala de laboratorio de proteínas eucariotas con la modificación postraduccional adecuada representa una barrera significativa. Este es un protocolo robusto con un rápido establecimiento y respuesta para la expresión de proteínas utilizando un sistema de expresión de mamíferos. Este sistema admite aminoácidos selectivos, marcaje selectivo de proteínas y moduladores de moléculas pequeñas de la composición de glicanos.

High Yield La expresión de proteínas recombinantes humanos con la transfección transitoria de células HEK293 en Suspensión

El estudio de los canales iónicos a través de un sistema de expresión de forma heteróloga se ha convertido en una técnica básica en la investigación biomédica. En este manuscrito, se presenta un método eficiente de tiempo para conseguir la expresión del canal iónico fuertemente controlada mediante la realización de la transfección transitoria bajo el control de un promotor inducible.

Expresión Ion Channel controlable a través de la transfección transitoria inducible

Nuevas estrategias terapéuticas en medicina regenerativa cardiaca requieren extensos y detallados estudios en modelos animales preclínicos grandes antes que pueden ser considerados para el uso en seres humanos. Aquí, demostramos una técnica de inyección de contraste percutánea guiada por ecocardiografía intramiocárdica en conejos, que es valiosa para la hipótesis que prueba la eficacia de estas nuevas terapias.

Inyección de contraste percutánea guiada por ecocardiografía intramiocárdica y entrega de celular en un modelo preclínico grande

Aquí se presenta un protocolo para la electroporación unicelular que puede entregar genes en neuronas excitatorias e inhibitorias a través de un rango de edades in vitro de cultivo de rebanadas de hipocampo. Nuestro enfoque proporciona una expresión precisa y eficiente de genes en células individuales, que se pueden utilizar para examinar las funciones intercelulares y autónomas de la célula.

Electroporación Unicelular A Través De Diferentes Cultivos Organotípicos Slice De Ratón Excitatorio Hipocampal Y Neuronas Inhibitorias Específicas De Clase

Utilizando el polímero catiónico de bajo costo polietilenimina (PEI), producimos partículas lentivirales para la expresión estable de shRNAs en células madre embrionarias humanas H9 (hESC) y células progenitoras neurales derivadas de H9 (NPC) transducidas transitoriamente con alta eficiencia.

Administración mediada por lentiviral de shRNAs a hESCs y NPCs usando polietileno de polímero catiónico de bajo costo (PEI)

El virus adenoasociado recombinante (rAAV) se usa ampliamente para la administración clínica y preclínica de genes. Un uso poco apreciado de los rAAV es la transducción robusta de células cultivadas sin necesidad de purificación. Para los investigadores nuevos en rAAV, proporcionamos un protocolo para la clonación de casetes transgénicos, la producción de vectores crudos y la transducción de cultivos celulares.

Expresión de transgenes en células cultivadas utilizando vectores virales adenoasociados recombinantes no purificados

Para el estudio de las respuestas de las células excitables in vitro, el protocolo describe el seguimiento óptico de los cambios en la generación de potencial de acción debidos a la electroporación en un modelo simple de célula excitable simple de células HEK con spiging tet-on modificadas genéticamente, así como los cambios en el voltaje transmembrana con extracción automatizada de parámetros relevantes.

Monitoreo de cambios inducidos por electroporación en la generación de potencial de acción en celdas HEK de Tet-On Spiking diseñadas genéticamente

Aprende una estrategia de transfección optimizada para la expresión y registro electrofisiológico de canales iónicos recombinantes en células HEK-293T. Este método mejora la adhesión celular y la estabilidad de la membrana.

Estrategia de transfección optimizados para la expresión y el registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes del voltaje en las células HEK-293T (Video) | JoVE Journal

Estrategia de transfección optimizados para la expresión y el registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes del voltaje en las células HEK-293T

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