Imágenes en tiempo real de los leucotrienos B ₄ La migración mediada por células y BLT1 interacciones con β-arrestina

El leucotrieno B cuatro es una molécula proinflamatoria que media sus acciones a través de los receptores acoplados a proteínas G, BT uno y BT dos, en una variedad de células inflamatorias. Se ha demostrado que la vía LTB cuatro B LT uno es fundamental en varias enfermedades inflamatorias, incluyendo asma, artritis y aterosclerosis. Los receptores acoplados a proteínas G, o RCPG, median la transducción de señales extracelulares que generan respuestas intracelulares como quimiotaxis, liberación de calcio intracelular y regulación génica.

La unión del ligando extracelular induce una serie de cambios conformacionales que conducen a la activación de proteínas G heterotriméricas. Las proteínas G modulan entonces los niveles de mensajeros secundarios, como el adenosín monofosfato cíclico, un acetol trifosfato y el diglicerol, para monitorear en tiempo real la migración celular mediada por leucotrieno B4. Se obtienen imágenes de células dendríticas derivadas de médula ósea, o BMDC, mientras se administra el quimioatractante mediante flujo controlado desde una micropipeta. Se realiza imágenes de lapso de tiempo para evaluar la migración.

Mediante el uso de estas técnicas de imagen en tiempo real en células vivas, nuestro laboratorio descubrió que el receptor leucotrieno B4 BT1 se expresa funcionalmente en células dendríticas. También identificamos mecanismos de fosforilación y de internalización dependientes de beta-arrestina del BT1. La Dra. Jla, profesora asistente en nuestro laboratorio, quien ha desarrollado muchas de estas técnicas, demostrará tanto la migración de células vivas como la internalización del receptor. Para preparar células dendríticas derivadas de médula ósea (B MDCs) para ensayos de migración celular, sembrar 0,5 millones de células en medio de cultivo RPMI 1640 que contenga FPS, G-M-C-S-F recombinante y FLT3 recombinante en una placa de fondo de vidrio de 35 milímetros.

Una vez sembradas, incubar las células durante 16 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Añadir tres mililitros de PBS y luego aspirar. Repetir este lavado al menos dos veces más; tras la última aspiración, añadir dos mililitros de PBS a la placa.

Las células ya están listas para el experimento y deben mantenerse a 37 grados Celsius. Hasta entonces, el sistema de imagen utilizado para los experimentos en este video consiste en un sistema epi fluorescente A-T-E-F-M acoplado a un microscopio invertido Nikon Eclipse TE 300, equipado con una platina calefactora y una cámara digital CCD en blanco y negro Cool SNAP HQ.

Las longitudes de onda de excitación y emisión se controlan mediante ruedas de filtros y un controlador de ruedas de filtros Lambda 10 dash two. El software Metamorph controla el hardware y la adquisición de imágenes. Dos micromanipuladores están conectados al portaobjetos del microscopio para sostener las pipetas, que pueden fabricarse siguiendo las instrucciones del texto adjunto o adquirirse comercialmente.

Transfiera 1,5 mililitros de un stock de 100 nanomolar del ligando proinflamatorio leucotrieno B cuatro o LTB cuatro a un tubo fuge de 1,5 mililitros. Rellene la micropipeta colocando la punta de la micropipeta en la solución y permitiendo que la solución entre; este método de carga evitará la formación de burbujas de aire en el extremo de la micropipeta. A continuación, cargue una jeringa tuberculínica de un centímetro cúbico conectada a una aguja microfill con un mililitro de LTB cuatro.

Luego, utilícelo para llenar lentamente una micropipeta desde la parte superior; conecte el tubo a la micropipeta LTB ya llena. A continuación, conecte la micropipeta y el tubo a una aguja de calibre 21 de una pulgada y media, unida a una jeringa de un mililitro que también esté llena de ligando. Ahora, fije cuidadosamente la micropipeta cargada con ligando a uno de los micromanipuladores sobre la platina del microscopio para realizar imágenes en tiempo real de células dendríticas derivadas de médula ósea.

En respuesta a la aplicación del ligando LTB cuatro, retire las bMDC inmaduras cultivadas de la incubadora y colóquelas sobre la platina calentada del microscopio. Visualice las células utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 60 x. Localice un área en la que las células no estén demasiado congestionadas, de modo que la migración pueda monitorearse adecuadamente.

Retire la tapa del recipiente de fluoro. Luego, utilizando el manipulador manual grueso, baje cuidadosamente la pipeta cargada con el ligando e introdúzcala. Acérquese a las células utilizando el micromanipulador hidráulico fino.

Enfoque la pipeta. Aplique una pequeña cantidad de presión desde la jeringa para iniciar la liberación lenta del ligando LTB cuatro desde la punta; el ligando debe difundirse lentamente en el medio por difusión. A continuación, utilizando el software Metamorph, configure los parámetros de adquisición de imágenes para obtener una imagen de campo claro cada 15 segundos durante dos horas.

Continúe monitoreando cada cinco minutos la progresión de la migración hacia el ligando. El método descrito en este protocolo se utilizó para determinar la migración de células dendríticas hacia el leucotrieno B cuatro. Aquí, la migración de células dendríticas derivadas de médula ósea de ratón hacia 100.

La imagen de lapso de tiempo muestra la migración celular en vivo de las CDBM hacia LTB4. Métodos similares pueden aplicarse para determinar la respuesta quimiotáctica de muchos tipos celulares frente a una variedad de quimioatractivos. Este tipo de imagen, en combinación con moléculas marcadas con proteínas fluorescentes, puede utilizarse para rastrear los movimientos e interacciones de moléculas en tiempo real en células vivas.

Aquí demostramos en tiempo real las interacciones del receptor uno de leucotrieno B cuatro marcado con un fluoróforo con la beta arrestina. RBL 2H3 es una línea celular de leucemia basofílica de rata aislada de ratas Wistar, que puede obtenerse de ATCC. Estas células no expresan muchos receptores de quimioquinas, pero poseen los componentes celulares necesarios para mediar vías de señalización dependientes de quimioquinas.

Para evaluar la internalización inducida por ligando de BT uno en tiempo real, las células RBL dos H tres se transfectan con BT uno RFP y beta arrestina GFP. Durante la adquisición de imágenes en lapso de tiempo, se añade ligando a la placa. Los cambios en la localización de estas proteínas pueden evaluarse mediante análisis de imágenes.

Para estudiar la internalización del receptor acoplado a proteína G en tiempo real, transfecte las células RBL-2H3 con RFP marcado con el receptor B-LT1 y betaarrestina-GFP según las instrucciones del texto adjunto. Luego, transfiera 300 microlitros de la mezcla de células electro poradas y medio de crecimiento regular a placas fluoradas de 35 milímetros que contengan dos mililitros de medio de crecimiento regular. Incube las células a 37 grados Celsius en una atmósfera humedecida con 95% de aire y 5% de dióxido de carbono para permitir que se adhieran al fondo de la placa.

Después de una hora, sustituya el medio de transfección por medio de crecimiento regular y coloque las células de nuevo en el incubador durante 18 a 24 horas adicionales. Tras la incubación, lave las células dos o tres veces añadiendo dos mililitros de RPMI tibio sin rojo fenol que contenga 10 milimolares de hippies directamente a la placa y aspirando los medios. Luego añada otros 1,8 mililitros.

A continuación, coloque la placa de cultivo sobre la platina del microscopio calentada. Recolecte imágenes a 600 x de magnificación utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 60 x. Luego cambie al filtro de fluorescencia adecuado.

Seleccione una célula sana que exprese HBL BT one RFP en la superficie celular y capture aquí la imagen. Usando el filtro RFP, cambie al filtro GFP y asegúrese de que beta arrestina y GFP se expresen en el citoplasma; luego capture la imagen. A continuación, examine las imágenes fusionadas con pseudocolores para asegurarse de que no haya fuga de fluorescencia, que puede ocurrir como resultado de un error.

La localización de los receptores no ocurre entre RFP y GFP. A continuación, introduzca los parámetros para la adquisición de imágenes con lapso de tiempo aquí. Las imágenes de 16 bits se adquieren con la configuración de binning de la cámara establecida en uno por uno.

Las imágenes de fluorescencia roja y verde se capturan secuencialmente utilizando filtros de fluorocromo RFP y GFP mediante un divisor de haz R-F-P-G-F-P. Instruya al software para capturar imágenes a intervalos de tiempo de 1/32 durante una hora. Ajuste los tiempos de exposición de la cámara de modo que se obtengan rangos dinámicos similares.

Para la intensidad de fluorescencia de RFP y GFP. Recolecte imágenes durante un minuto, luego en t igual a cero. Añada los 200 microlitros del ligando directamente en la placa sin perturbarla.

Continúe recolectando imágenes de fluorescencia durante 60 minutos. Después de agregar el ligando, a medida que se adquieren las imágenes, estas se almacenarán automáticamente como imágenes TIFF con nombres de archivo secuenciales. Luego, los archivos pueden visualizarse como imágenes individuales o combinadas utilizando el software.

Finalmente, después de haber adquirido todas las imágenes celulares, adquiera imágenes con medio sin células utilizando los mismos ajustes. Guarde los archivos para usarlos como imágenes de fondo al analizar las imágenes. Utilice la función de sustracción de imagen en Metamorph para restar el fondo de las imágenes de datos reales obtenidas anteriormente.

Esto tendrá en cuenta cualquier fondo o autofluorescencia del medio. A continuación, en el menú de archivo, abra la opción de archivo de pila generado final y abra las pilas individuales de imágenes. Luego, en mediciones de región, seleccione trazado de región elíptica y dibuje las regiones de interés; seleccione las regiones superficiales y citosólicas para medir la intensidad de fluorescencia de RFP y GFP correspondientes a la translocación de BLT uno y beta arrestina.

Utilizando la opción de datos logarítmicos, que se vincula automáticamente a Excel, coloque la cantidad de intensidades de fluorescencia en función del tiempo. Este gráfico proporcionará información sobre la cinética de translocación de una molécula determinada. En el análisis de imágenes se puede revelar la localización del receptor acoplado a proteína G y de proteínas citosólicas y del núcleo.

Aquí se observa la expresión de BT uno RFP en la superficie de una célula RBL dos H tres. Esta imagen muestra la localización de beta rest y GFP en el citosol de la misma célula y aquí se observa p nuke CFP en el núcleo. La imagen combinada en color que se muestra aquí indica la localización celular distinta de cada fluorocromo; la interacción inducida por ligandos de GPCR de superficie con proteínas citosólicas también puede evaluarse aquí.

Translocación inducida por ligando del receptor BLT uno y beta arrestina. Este video muestra imágenes en vivo de una célula que expresa BLT uno RFP y beta arrestina GFP. Tras la adición de un micromolar de LTB cuatro, los patrones de translocación pueden cuantificarse mediante el software Metamorph.

Se muestra un escaneo lineal de intensidades de fluorescencia en una célula representativa en T igual a cero. BT1 RFP se observa en la membrana y beta arrestina GFP se observa en el citosol. Tras la adición del ligando, se observa superposición de las líneas RFP y GFP, lo que sugiere la colocalización del receptor y la beta arrestina.

Además, aquí se puede determinar la cinética del movimiento de proteínas. La cinética de la internalización del receptor y la translocación de beta arrestina. Se examinó tras la adición de un micromolar de LTB cuatro.

Las intensidades de fluorescencia se midieron como una función del tiempo en las localizaciones de la membrana y el citosol de la célula. La adición del ligando LTB4 a células RRB2H3 transfectadas con BT1-RFP y beta-arrestina1-GFP conduce a la translocación de beta-arrestina1-GFP desde el citosol hacia la membrana, observable como la formación de un anillo amarillo dentro de un minuto. Tras la interacción con beta-arrestina1-GFP, el BT1-RFP forma un complejo receptor-beta-arrestina1-GFP y se transloca a través del citosol en forma de endosomas, como queda evidenciado por la aparición de puntos amarillos dentro de los cinco minutos. Mediante estos métodos, puede determinarse el estado de activación del receptor dependiente del ligando, así como los motivos críticos o procesos implicados en la activación del receptor.

Lo más importante en el experimento es vigilar el tampón en la placa mientras se manipula. A medida que el experimento sobrepasa una hora después de su inicio. Esta técnica surgió entre los investigadores en el campo de las quimiocinas y sus receptores para explorar la migración celular y las interacciones entre receptores y ligandos en diversos tipos de células de mamíferos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar experimentos de imágenes en tiempo real que involucren quimioquinas y sus receptores, así como sus interacciones con proteínas citosólicas como las beta arrestinas.