La construcción de un mosquito mejor: La identificación de los genes que permiten resistencia a la malaria y el dengue en A. gambiae y A. aegypti

Soy George Dimopoulos. Soy profesor asistente en la Escuela de Salud Pública Johns Hopkins, en el Departamento de Microbiología Molecular e Inmunología, Instituto de Investigación sobre la Malaria. Mi grupo de investigación trabaja con el mosquito Anopheles gambiae, que transmite la malaria, y estudiamos la biología molecular de este mosquito, con especial interés en su sistema inmune innato, que participa en la eliminación de los parásitos de la malaria.

Queremos comprender cómo funciona este sistema inmunitario y qué genes y moléculas son importantes para eliminar el parásito. Creemos que, al entender la biología de este sistema, podríamos utilizar ese conocimiento para desarrollar estrategias de control de la malaria en el futuro. La malaria es una de las enfermedades más graves del mundo.

Ha estado presente en la humanidad desde siempre, realmente, y es lamentable que aún la tengamos. La malaria infecta a 400 millones de personas cada año y mata a 2 millones de personas, principalmente en la región subsahariana de África, aunque también se encuentra en otros países en desarrollo de América del Sur y Asia. La malaria es causada por un parásito protozoario del género Plasmodium, y existen cuatro especies de Plasmodium que pueden provocar malaria humana.

El más importante de ellos es Plasmodium falciparum. Plasmodium falciparum es transmitido principalmente por mosquitos pertenecientes al género Anopheles, y los mosquitos vectores más importantes para la transmisión de la malaria en África subsahariana pertenecen al Complejo de Especies Anopheles gambiae, distribuyéndose principalmente en la región subsahariana de África. El virus del dengue es un flavivirus, y se transmite principalmente por el mosquito Aedes aegypti.

Su distribución geográfica es bastante similar a la de la malaria. La encontramos en América, en el sudeste asiático y en África. El virus del dengue causa fiebre hemorrágica.

Hay alrededor de 2.500 millones de personas en riesgo por el virus del dengue, y el virus provoca fiebre hemorrágica en millones de personas cada año. La fiebre hemorrágica del dengue ha surgido como una de las enfermedades transmitidas por vectores más graves en los últimos 10 años. Así, el parásito de la malaria tiene un ciclo vital complejo tanto en el vector mosquito que transmite entre el hospedador humano como en el hospedador humano.

Y mi grupo de investigación está estudiando la biología de la transmisión de la malaria en el mosquito. Cuando un mosquito ingiere una comida sanguínea infectada, también ingiere los parásitos Plasmodium falciparum. Los gametocitos del parásito se fertilizarán en el intestino medio y producirán una oociste o quiste en forma de tejado alrededor de las 18 a 35 horas posteriores a la ingestión de la sangre.

Estas formas de Orkin invadirán el epitelio intestinal de los mosquitos aquí. La mayoría de las formas de Orkin son eliminadas por el sistema inmunitario del mosquito en esta etapa, y es aquí donde centramos nuestros estudios. Esta también es una imagen de microscopía confocal de la orquinina; la orquinina que logra atravesar el intestino medio formará un quiste en el lado basal aquí, y dentro de este quiste se desarrollarán miles de parásitos en estadio de esporozoito, y estas formas móviles luego migrarán; aproximadamente 15 días después de que el mosquito haya ingerido la comida sanguínea, migrarán hacia las glándulas salivales, y desde las glándulas salivales, los esporozoitos pueden transmitirse a un nuevo huésped. El sistema inmunitario del mosquito también participa en la eliminación de esporozoitos en esta etapa, cuando son liberados en el hemocele del mosquito.

El genoma del mosquito fue secuenciado recientemente en 2002, lo que nos ha permitido desarrollar nuevas herramientas de biología molecular y genómica para estudiar la expresión génica de todos los mosquitos, aproximadamente 14.000 genes, bajo diferentes condiciones de infección en los llamados microarreglos. Este microarreglo, que desarrollamos hace un par de años, contiene el transcriptoma completo del mosquito, todos los genes del mosquito conocidos en ese momento, así como los genes del parásito plasmodium. De este modo, podemos analizar la actividad de los genes tanto en el mosquito como en el parásito simultáneamente durante la infección.

Una vez que identificamos los genes que se activan cuando el mosquito está infectado con parásitos de Plasmodium, necesitamos comprobar si estos genes participan en la eliminación del parásito, y lo hacemos mediante un método denominado silenciamiento génico por interferencia de ARN. Básicamente, inyectamos ARN de los genes que queremos atacar, y este ARN de doble cadena degradará los ARNm de los genes en el mosquito que estamos dirigiendo, con lo cual estos genes no producirán proteína. Luego, infectaremos al mosquito con un parásito.

Ahora, si hemos silenciado o inactivado un gen determinado en el mosquito, y tras este silenciamiento, el parásito puede establecer una infección mayor de lo normal en los mosquitos no tratados, esto sugeriría que dicho gen se utiliza de alguna manera para eliminar parásitos de la malaria. Y este es realmente el método principal que utilizamos para comprobar si los genes están implicados en la eliminación de parásitos en el mosquito.

La mayoría de los parásitos del género Plasmodium son eliminados en el mosquito, y contamos con evidencia sólida de que el sistema inmunitario innato del mosquito es principalmente responsable de esta eliminación. Nuestro laboratorio y los laboratorios de nuestros colaboradores han identificado una variedad de genes que participan en este proceso. Asimismo, existen cepas de mosquitos seleccionadas genéticamente que no transmiten la malaria porque destruyen todos los parásitos en el intestino medio mediante mecanismos de defensa inmunitaria innata.

Parece que el mosquito dispone de una variedad de componentes y mecanismos diferentes para atacar al parásito, y el mayor desafío actual consiste en comprender cómo funcionan estos mecanismos y cómo podemos manipularlos para desarrollar mosquitos resistentes. El mosquito GTI utiliza mecanismos diferentes para controlar la infección por el virus del dengue en comparación con los que utiliza *Anopheles gambiae* para controlar la infección por *Plasmodium*. El mosquito *Aedes aegypti*, como todos los eucariotas, posee un mecanismo de defensa dependiente de ARN denominado interferencia de ARN.

Es básicamente un mecanismo de defensa capaz de dirigirse al ARN del virus degradado y, de esta manera, protegerse contra la infección viral. Estamos tratando de comprender este mecanismo de defensa y cómo podemos manipularlo para generar mosquitos resistentes al virus. En los últimos 10 años, la biología molecular ha experimentado avances realmente dramáticos, principalmente avances metodológicos que han acelerado enormemente nuestra investigación.

Uno de los principales avances son las tecnologías de secuenciación que han permitido la secuenciación de alto rendimiento de genomas completos. Gracias a estas tecnologías, ahora contamos con los genomas de *Gambia* y de *A*, este mosquito gip completamente secuenciados. Esto nos permite identificar genes implicados en el control de infecciones de forma mucho más sencilla que antes.

Otros avances muy importantes en el campo de la genómica funcional son el análisis de expresión génica de alto rendimiento mediante el uso de microarreglos. Los microarreglos son pequeñas láminas de vidrio en las que se han inmovilizado miles de fragmentos de ADN, y podemos utilizar estos llamados chips de ADN para monitorear la expresión génica de un número muy grande de genes. Otro avance muy importante en el campo es la metodología de silenciamiento génico por interferencia de ARN, que nos permite dirigirnos a genes específicos e inactivarlos en el mosquito, y así emplear un enfoque denominado genética inversa para estudiar la función génica y determinar cómo nuestros genes de interés son importantes en la eliminación del parásito.

Los mosquitos sobre los que nosotros y nuestros colaboradores hemos realizado la mayoría de estos estudios proceden de colonias de mosquitos que se han mantenido en condiciones de laboratorio durante hasta 30 años. Estos mosquitos obviamente han diferenciado bastante de los mosquitos que encontramos en la naturaleza. Los mosquitos en la naturaleza están sometidos a una presión selectiva continua por parte de los diferentes microbios y otros parámetros que varían mucho en el campo, en comparación con las condiciones bastante estables que tenemos en el laboratorio.

Por lo tanto, se podría argumentar que nuestros estudios probablemente serían mucho más informativos si se realizaran directamente con mosquitos de campo. Sin embargo, desafortunadamente, esto no es tan fácil de hacer. Como se mencionó, no contamos con la infraestructura necesaria en el campo, y además es muy complicado recolectar mosquitos de campo y desarrollar colonias a partir de esos mosquitos.

Por lo tanto, los mejores modelos biológicos que tenemos hoy son los modelos de laboratorio, pero por supuesto que en algún momento tendremos que ir al campo para verificar y confirmar los principales hallazgos que surgen de nuestros descubrimientos con nuestros mosquitos de laboratorio. Sabemos que los sistemas de defensa de los mosquitos participan en la eliminación de los patógenos humanos que estos insectos transmiten. Ahora bien, si podemos comprender cómo ocurre esta eliminación, qué genes están involucrados y qué mecanismos intervienen, podríamos potencialmente manipularlos y utilizar dicha manipulación para desarrollar mosquitos genéticamente modificados que sean incapaces de transmitir el patógeno.

Una vez que hayamos desarrollado estos mosquitos modificados genéticamente, podemos comenzar a considerar cómo podríamos introducirlos realmente en el campo y convertirlos en una especie dominante frente a los mosquitos susceptibles. Una estrategia que se ha discutido ampliamente para lograrlo consiste esencialmente en propagar genes de resistencia en poblaciones naturales, genes que harían que los mosquitos fueran resistentes a los patógenos, y esto debe lograrse mediante mecanismos de impulso genético, conocidos como genetic drive. Actualmente, gran parte de la investigación se centra en el desarrollo de tales mecanismos de impulso genético.

Por supuesto, existen muchas consideraciones éticas que se deben tener en cuenta al liberar cualquier tipo de organismo modificado genéticamente en la naturaleza. Es importante recordar que la modificación genética ocurre naturalmente todo el tiempo en el campo. En cuanto a las tres mutaciones, hay muy pocas razones para creer que terminaríamos con un mosquito que sea mejor transmisor de un patógeno o que tenga alguna otra característica no deseable.

Lo peor que podría suceder es que el patógeno desarrolle resistencia a este mosquito transgénico en algún momento, y por supuesto tendríamos que realizar muchas pruebas de campo y muchas pruebas de laboratorio antes de considerar siquiera liberar un mosquito modificado genéticamente en el medio ambiente. También tendríamos que educar a las personas sobre estas estrategias controladas y asegurarnos de que todos se sientan cómodos y estén a favor de este tipo de estrategia. Aún existen muchos obstáculos que debemos superar para lograr una estrategia de control de enfermedades basada en bloquear el patógeno en el vector mosquito.

Algunos de estos obstáculos están relacionados con problemas técnicos y experimentales que debemos resolver. Uno de los obstáculos es, por ejemplo, el desarrollo de mecanismos de conducción genética, mecanismos que permitirían eficazmente que estos genes resistentes se propaguen en las poblaciones. El campo científico de la biología de los vectores de enfermedades ha experimentado un progreso trascendental en los últimos 10 a 15 años, principalmente debido al reconocimiento de que la comprensión de la biología de la interacción entre insectos y patógenos podría ayudarnos realmente a desarrollar estrategias de control.

Y este reconocimiento condujo a un aumento de la financiación destinada a la investigación en este campo. Es sumamente importante que esta financiación se mantenga y que el compromiso continúe, para poder preservar el impulso alcanzado y cumplir nuestra misión mediante la comprensión de la biología de la interacción entre vectores y patógenos, y de cómo podemos utilizar esta biología para desarrollar estrategias de control de enfermedades.