Inducidas por factores ambientales cambios heredables en lino

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un método para cultivar una variedad de lino inducible en condiciones que resulten en una variación genómica heredable. Además, se monitorean los cambios genómicos y se observa el crecimiento de las plantas inducidas en las generaciones posteriores en los diversos ambientes. Para lograr esto, el lino se cultiva en una variedad de condiciones inductoras.

El tejido del tallo de la hoja y Maris se recolecta en varios momentos durante el crecimiento de las plantas en los diversos ambientes. A continuación, se aísla el ADN y el ARN de las muestras de tejido. El paso final del procedimiento es realizar la PCR utilizando las muestras de ADN y Q-R-T-P-C-R utilizando el ARN aislado para identificar los cambios genómicos y los cambios en la expresión génica resultantes del crecimiento en diferentes condiciones ambientales.

En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren la respuesta genómica a las condiciones de crecimiento con la aparición del elemento de inserción LIS en un punto específico del genoma y las diferencias de expresión asociadas con la presencia de ese elemento según lo visualizado por PCR y R-T-P-C-R realizado con ácido nucleico aislado de los tejidos de las plantas tratadas. Hola, soy Chris Cull del Departamento de Biología de la Universidad Case Western Reserve. Soy Cory Johnson del Cull Lab.

Y yo soy Tiffany Moss, también del laboratorio de sacrificio. Y yo soy Marshall Lucas. Un estudiante de pregrado en el programa de verano para investigación de pregrado en el laboratorio Cull.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los cambios en el genoma y la expresión génica resultantes de las variaciones en el entorno de crecimiento. Así que comencemos. Para cultivar lino en condiciones inductoras, comience llenando macetas de cinco pulgadas con tierra y reafirmando.

A continuación, plante, tres semillas de lino por maceta, de un cuarto de pulgada de profundidad. Luego del suelo sobre las semillas para las condiciones de control no inductoras. Riegue las plantas con 100 mililitros de una solución de crecimiento milagroso de 10ª potencia.

Trate las plantas en condiciones de alto contenido de nutrientes con 100 mililitros de concentración completa. Crecimiento milagroso. Finalmente aplicar.

Solo agua del grifo para las plantas bajas en nutrientes. Cultive las plantas bajo luz natural durante el verano a medida que las plantas crecen. Riegue todas las plantas mediante un sistema de pulverización automático dos veces al día durante cinco minutos.

Aplique las condiciones de crecimiento a las plantas una vez a la semana. Recoja las hojas en tallos mari a intervalos semanales. Se recolectan seis hojas para la extracción de ADN, y se necesitan tres tallos para la extracción de ARN después de la recolección, coloque el material vegetal en un frasco criogénico, congélelo rápidamente en nitrógeno líquido y almacene las muestras a menos 80 grados Celsius hasta que se extraigan.

Los tres genotipos crecen a diferentes tasas relativas dependiendo de las condiciones. En condiciones de control, la variedad de lino endogámico tormenta o la línea PL crece mejor. Varias líneas se derivaron de este padre, siendo una variedad grande o L más vigorosa que la variedad pequeña o S.

Sin embargo, con bajos nutrientes, el S crece mejor que el L o el pl. Y en condiciones de alta concentración de nutrientes, la L crece mejor que la pl, que solo crece ligeramente mejor que la S.Una comparación entre cada una de las líneas cultivadas bajo los tres tratamientos diferentes revela que la PL crece mejor en condiciones controladas. La L crece mejor en condiciones de alta concentración de nutrientes, y la S crece de manera similar tanto en condiciones de alta concentración de nutrientes como de control.

Estos datos muestran que las tres líneas se pueden diferenciar en función de su crecimiento en los tres entornos. Mientras que PL y L crecen mejor en entornos específicos, S crece aproximadamente igual en las tres condiciones. S no es capaz de aprovechar las condiciones mejoradas de nutrientes, pero es más capaz de crecer en condiciones de muy bajos nutrientes.

Para la extracción de ADN, agregue tampón, AP uno de Qiagen, planta de DNEZ, kit de preparación de ADN a seis hojas con arena estéril en un tubo de micro fuga, muela el tejido con un micro mortero hasta que no se vean grumos. Continúe la extracción siguiendo las instrucciones del kit como se indica para comenzar la transferencia de extracción de ARN, tres tallos de maris más algunas hojas circundantes de un vial criogénico de almacenamiento a un tubo de micro fuga. Agregue arena estéril al tubo y muela el tejido con un micromortero hasta que esté finamente molido.

Agite la muestra durante 15 segundos para ayudar a la lisis, luego gire durante un minuto a 13.000 RPM para recoger la arena y los residuos. Agregue el SNAT a la columna de centrifugado y continúe con la preparación del ARN según las instrucciones del fabricante. Una vez que el ARN se extrae del tejido, transfiera 10 tampones XDNA a una décima parte del volumen de la muestra de ARN a la reacción.

Y a 30 unidades de D Ns, incubar la reacción a 37 grados Celsius durante 30 minutos, seguida de 70 grados Celsius durante cinco minutos. Realice la transcripción inversa utilizando el kit de ARN a CD NA de biosystems aplicado. Según las instrucciones del fabricante y S, incube la reacción a 37 grados centígrados durante una hora y luego a 95 grados centígrados durante cinco minutos.

Por último, ejecute cinco microlitros del CDNA en un gel AROS al 1,5% para determinar el rendimiento. Una vez que se ha preparado el CD NA de lino, se utiliza para QPCR. Llevar a cabo QPCR utilizando un sistema A BI Step one.

Realice todos los ensayos por triplicado para cada corrida y utilice el Gene Acton de limpieza como control de número de copias para preparar las reacciones para QPCR. Agregue un microlitro del par de cebadores apropiado a cada tubo. Diluir el CD NA hasta la concentración adecuada y añadir nueve microlitros a cada tubo.

Por último, añade 10 microlitros de la mezcla maestra de PCR x cyberg green a cada tubo. A continuación, configure el programa de amplificación después de la amplificación. Calcule los niveles de expresión relativos a partir del número de ciclo para el umbral, que se determina mediante los parámetros predeterminados en el software del paso uno y se confirma mediante la inspección de las curvas de amplificación.

amplificación por PCR del ADN, aislado de las hojas en varias posiciones a lo largo del tallo, demuestra la aparición de una sola copia de 5,7 kilobases, fragmento de ADN denominado secuencia de inserción de línea, o LIS uno cuando las plantas se cultivan en condiciones inductoras. LIS uno aparece cuando PL se cultiva en condiciones de baja inducción de nutrientes y finalmente se vuelve homocigótico. Aquí. Las muestras de hojas del uno al seis se aislaron a intervalos semanales, siendo la muestra uno la más temprana después de la coser, se extrajo el ADN de las muestras.

La amplificación por PCR revela la presencia de ambos extremos de LAS en todas las muestras excepto en la primera. Esto se corresponde con la desaparición del sitio insertado y sin evidencia de ello por parte de la quinta hoja QPCR. Los resultados muestran que la presencia de uno u otros cambios genómicos asociados a la inducción afecta a la expresión de genes en las inmediaciones de un S.

Los seis genes que se muestran aquí se expresan diferencialmente en PL y S, cuatro de los genes tienen mayor expresión en pl, que no tiene uno de LIS. Por el contrario, dos tienen mayor expresión en S, que sí tiene LIS uno, Acabamos de mostrarle cómo cultivar líneas de lino inducibles. Por lo tanto, el genoma cambia en respuesta al entorno de crecimiento y a las características de crecimiento de las generaciones posteriores.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar que las condiciones de crecimiento deben replicarse para que la inducción de cambios sea reproducible. Así que eso es todo. Sé que muchos de ustedes son escépticos de este fenómeno, pero ahora pueden reproducir las observaciones por ustedes mismos.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.