Inducidas por factores ambientales cambios heredables en lino

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un método para cultivar una variedad de lino inducible en condiciones que produzcan variación genómica heredable. Además, se monitorean los cambios genómicos y se observa el crecimiento de las plantas inducidas en generaciones posteriores bajo diversos ambientes. Para lograrlo, se cultiva lino bajo una variedad de condiciones inductoras.

El tejido foliar y del tallo de Maris se recopila en varios momentos durante el crecimiento de las plantas bajo diferentes ambientes. A continuación, se aíslan el ADN y el ARN a partir de las muestras de tejido. El paso final del procedimiento consiste en realizar PCR utilizando las muestras de ADN y Q-R-T-P-C-R con el ARN aislado para identificar cambios genómicos y cambios en la expresión génica resultantes del crecimiento bajo condiciones ambientales distintas.

En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren la respuesta genómica a las condiciones de crecimiento con la aparición del elemento de inserción LIS uno en un punto específico del genoma y las diferencias de expresión asociadas con la presencia de ese elemento, visualizadas mediante PCR y R-T-P-C-R realizadas con ácido nucleico aislado de los tejidos de plantas tratadas. Hola, soy Chris Cull del Departamento de Biología de la Universidad Case Western Reserve. Soy Cory Johnson del Laboratorio Cull.

Y soy Tiffany Moss, también del laboratorio Cull. Y soy Marshall Lucas, un estudiante de pregrado en el programa de verano para investigación de pregrado en el laboratorio Cull.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los cambios en el genoma y en la expresión génica resultantes de variaciones en el entorno de crecimiento. Así que comencemos. Para cultivar lino bajo condiciones inductoras, empiece llenando macetas de cinco pulgadas con suelo y compactándolo.

Plante a continuación, tres semillas de lino por maceta, a una profundidad de un cuarto de pulgada. Luego cubra las semillas con suelo para las condiciones de control no inductoras. Riegue las plantas con 100 mililitros de una solución de Miracle Grow al un décimo de su concentración.

Trate las plantas bajo condiciones de alta nutrición con 100 mililitros de solución completa de Miracle Grow. Finalmente, aplique.

Utilice solo agua del grifo para las plantas de bajos nutrientes. Cultive las plantas a la luz natural durante el verano, ya que es cuando crecen. Riegue todas las plantas mediante un sistema de rociado automático dos veces al día durante cinco minutos.

Aplique las condiciones de crecimiento a las plantas una vez por semana. Recolecte las hojas en tallos mari a intervalos semanales. Se recolectan seis hojas para la extracción de ADN, y se necesitan tres tallos me para la extracción de ARN. Después de la recolección, coloque el material vegetal en un vial criogénico, congélelo rápidamente en nitrógeno líquido y almacene las muestras a menos 80 grados Celsius hasta su extracción.

Los tres genotipos crecen a tasas relativas diferentes dependiendo de las condiciones. Bajo condiciones de control, la variedad endogámica de lino storm o la línea PL crece mejor. Varias líneas se derivaron de este progenitor, siendo la variedad grande o L más vigorosa que la variedad pequeña o S.

Sin embargo, bajo condiciones de bajos nutrientes, S crece mejor que L o pl. Y bajo condiciones de alta concentración de nutrientes, L crece mejor que pl, que a su vez crece ligeramente mejor que S. Una comparación entre cada una de las líneas cultivadas bajo los tres tratamientos diferentes revela que PL crece mejor en condiciones de control. L crece mejor bajo condiciones de alta concentración de nutrientes, y S crece de manera similar tanto bajo condiciones de alta concentración de nutrientes como en condiciones de control.

Estos datos muestran que las tres líneas pueden diferenciarse según su crecimiento en los tres ambientes. Mientras que PL y L crecen mejor en ambientes específicos, S crece aproximadamente igual en las tres condiciones. S no es capaz de aprovechar las condiciones mejoradas de nutrientes, pero tiene una mayor capacidad para crecer bajo condiciones de nutrientes muy bajas.

Para la extracción de ADN, agregue tampón AP1 del kit de preparación de ADN para plantas DNEZ de Qiagen a seis hojas con arena estéril en un tubo microfuga; muela el tejido con un pistilo micro hasta que no sean visibles grumos. Continúe la extracción siguiendo las instrucciones del kit. Para iniciar la extracción de ARN, transfiera tres tallos de maris más algunas hojas circundantes desde un vial criogénico de almacenamiento a un tubo microfuga. Agregue arena estéril al tubo y muela el tejido usando un pistilo micro hasta que quede finamente molido.

Vortexee la muestra durante 15 segundos para facilitar la lisis, luego centrifúguela durante un minuto a 13.000 RPM para recoger la arena y cualquier residuo. Añada el SNAT a la columna de centrifugación y continúe con la preparación del ARN según las instrucciones del fabricante. Una vez que el ARN se haya extraído del tejido, transfiera 10 XDNA buffer a un volumen equivalente a una décima parte del volumen de la muestra de ARN a la reacción.

Y con 30 unidades de D Ns, incubar la reacción a 37 grados Celsius durante 30 minutos, seguido de 70 grados Celsius durante cinco minutos. Realizar la transcripción inversa utilizando el kit de Applied Biosystems de ARN a ADN. Según las instrucciones del fabricante y de S, incubar la reacción a 37 grados Celsius durante una hora y luego a 95 grados Celsius durante cinco minutos.

Finalmente, corra cinco microlitros del ADNc en un gel de AROS al 1,5 % para determinar el rendimiento. Una vez que el ADNc de lino haya sido preparado, se utiliza para la PCR cuantitativa. Realice la PCR cuantitativa utilizando un sistema A BI Step one.

Realice todos los ensayos por triplicado en cada corrida, y utilice el gen de referencia Acton como control de número de copias para preparar las reacciones de QPCR. Añada un microlitro del par de cebadores apropiado a cada tubo. Diluya el ADNc a la concentración adecuada y añada nueve microlitros a cada tubo.

Finalmente, agregue 10 microlitros de la mezcla maestra de PCR con colorante cyberg green 2x a cada tubo. A continuación, configure el programa de amplificación tras la amplificación. Calcule los niveles relativos de expresión a partir del número de ciclos para el umbral, que se determina mediante los parámetros predeterminados del software Step One y se confirma mediante la inspección de las curvas de amplificación.

La amplificación por PCR a partir del ADN, aislado de hojas en diversas posiciones a lo largo del tallo, demuestra la aparición de un fragmento de ADN de 5,7 kilobases de copia única, denominado secuencia de inserción de línea o LIS uno, cuando las plantas se cultivan bajo condiciones inductoras. LIS uno aparece cuando PL se cultiva bajo condiciones inductoras de bajos nutrientes y eventualmente se vuelve homocigótico. Aquí, muestras de hojas de la uno a la seis se aislaron a intervalos semanales, siendo la muestra uno la más temprana tras la siembra. Luego, el ADN se extrajo de las muestras.

La amplificación por PCR revela la presencia de ambos extremos de LAS uno en todas las muestras, excepto en la primera. Esto corresponde con la desaparición del sitio insertado sin terminales y ninguna evidencia de este en la QPCR de la quinta hoja. Los resultados muestran que la presencia de LAS uno u otros cambios genómicos asociados con la inducción afectan la expresión de genes en la inmediata vecindad de un S uno.

Los seis genes mostrados aquí están todos diferencialmente expresados en PL y S; cuatro de los genes tienen una expresión mayor en PL, que no posee LIS uno. Por el contrario, dos tienen una expresión mayor en S, que sí posee LIS uno. Acabamos de mostrarle cómo cultivar líneas de lino inducibles. De este modo, el genoma cambia en respuesta al entorno de crecimiento y a las características de crecimiento de las generaciones posteriores.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar que las condiciones de crecimiento deben replicarse para lograr una inducción reproducible de los cambios. Eso es todo. Sé que muchos de ustedes son escépticos respecto a este fenómeno, pero ahora pueden reproducir las observaciones por sí mismos.

Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos.