Automatizado de Análisis de la morfología neuronal Sholl digitalizados en múltiples escalas

Este video demuestra un procedimiento para analizar la morfología de dendritas y axones, conocidos colectivamente como neuritas, mediante un programa semiautomatizado con el fin de observar cambios locales. En primer lugar, el software NeuronJ se utiliza para trazar imágenes TIFF de ocho bits de neuronas y así identificar la posición de los segmentos de neuritas. Luego, el software NeuronStudio se emplea para definir información estructural sobre la conectividad entre las neuritas.

Finalmente, se ejecuta el programa MATLAB bonfire para extraer datos morfológicos de las células, incluyendo el análisis shoal, así como el número de puntos de bifurcación de los neuritos y los extremos de los neuritos. Los resultados muestran cambios locales en la morfología de los neuritos basados en el rendimiento del análisis shoal en subregiones del arbor neurítico. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el análisis shoal realizado manualmente, es que el programa es semiautomatizado, lo que aumenta considerablemente la eficiencia del análisis y permite auditar los datos para verificar la precisión del análisis.

El procedimiento será demostrado por un estudiante universitario de Hirsch AWA que trabaja en el laboratorio de Firestein durante el verano. Para utilizar el programa bonfire y analizar las características morfológicas de los neuritos, deben obtenerse imágenes TIFF de ocho bits de neuronas individuales tras descargar el programa bonfire. Los ajustes del programa deben modificarse según la resolución de las imágenes que desea analizar; en la sección de parámetros de bonfire del programa, reemplace el valor actual de la variable picks conversion con el valor de la resolución de sus imágenes.

Para que bonfire pueda analizar los datos, los archivos deben organizarse en una estructura específica, que incluye una carpeta principal, una carpeta bonfire que contiene los archivos MATLAB M de bonfire, subcarpetas que contengan cada una de las condiciones diferentes y los archivos de imágenes celulares dentro de las carpetas de condiciones diferentes; comience por preparar la imagen para el trazado. Para este experimento, solo se trazarán las dendritas con el fin de analizar los cambios en la morfología dendrítica. Comience por preparar la imagen para el trazado.

Abra la imagen seleccionando el botón de apertura en la barra de herramientas de NeuronJ y seleccione la imagen que desea trazar. Ahora, cambie el tamaño de la imagen seleccionando el botón de maximizar para ajustar el brillo y el contraste de la imagen de manera que pueda visualizar todos los neuritos; seleccione la imagen en la barra de herramientas de NeuronJ y luego seleccione ajustar brillo contraste. Para comenzar el trazado, seleccione el botón agregar trazos en la barra de herramientas de NeuronJ y trace alrededor del perímetro del cuerpo celular.

Luego, seleccione el botón de trazos de etiqueta en la barra de herramientas de NeuronJ y elija N uno en el menú desplegable de ID de trazo. Seleccione el tipo cero seis en la ventana de atributos de NeuronJ y haga clic en Aceptar. Para comenzar a trazar las neuritas, seleccione el botón de agregar trazos en la barra de herramientas de NeuronJ y agregue un trazo a lo largo de cada rama de neurita de interés. Es recomendable que los segmentos que dibuje terminen en cada punto de bifurcación, con cada rama hija comenzando en ese punto como un trazo nuevo.

Seleccione el botón guardar trazados en la barra de herramientas de Neuron J y guarde el trazado que acaba de crear en la misma carpeta que el archivo de imagen original. A continuación, exporte los archivos de trazado y los archivos de identificador de trazado desde Neuron J. Seleccione el botón exportar trazado en la barra de herramientas de Neuron J. Ahora, seleccione la opción archivos de texto separados por tabulaciones, archivo separado para cada trazado en el cuadro de diálogo de exportación de Neuron J y haga clic en aceptar para permitir que Neuron J elija los nombres de los archivos y la ubicación de guardado.

Seleccione el botón de trazos de medida en la barra de herramientas de Neuron J, luego seleccione la opción de mostrar mediciones de trazos en la ventana de mediciones de Neuron J y seleccione Ejecutar Archivo en la ventana de trazos de Neuron J. A continuación, seleccione Guardar como y guarde el archivo. El nombre del archivo debe coincidir exactamente con el nombre del archivo de imagen original, seguido por guion bajo y la palabra info, y no debe contener una extensión de archivo de tres letras. Verifique que su computadora no agregue automáticamente una extensión de archivo XLS.

Si es así, la extensión del archivo debe eliminarse manualmente. Primero, reorganice las carpetas utilizando bonfire load abriendo matlab y haciendo clic en el botón de los tres puntos en la esquina superior derecha de la ventana de comandos. Seleccione la carpeta bonfire en su carpeta principal en la ventana de búsqueda de carpetas, escriba bonfire load en la ventana de comandos y presione enter.

Seleccione la carpeta de condición que desea analizar en la ventana de búsqueda de carpetas y seleccione Aceptar. Esto reorganizará la estructura de carpetas creando subcarpetas de células que contienen todos los datos para cada célula individual. Ahora, para crear archivos con nombre de archivo_guion_bajo_premium_swc, escriba bonfire_guion_bajo_NDF2sWC en la ventana de comandos y presione enter.

Seleccione la misma carpeta de condición que acaba de reorganizarse con la carga de bonfire en la ventana de búsqueda de carpetas y seleccione Aceptar. Esto creará un archivo WC en cada carpeta de célula para la condición elegida. Cada carpeta de célula contendrá cinco archivos.

La imagen TIF original, el archivo NDF, la información con guion bajo, el archivo identificador de trazas, un archivo TXT y un archivo swc. Antes de utilizar Neuron Studio, recomendamos que se familiarice con las funciones y atajos del programa. Disponen de un excelente manual de usuario en línea, y conocer los atajos de teclado le ahorrará una gran cantidad de tiempo.

Para comenzar, abra el programa Neuron Studio y seleccione Archivo Abrir en la barra de herramientas de Neuron Studio; busque la imagen TIF de la neurona que desea editar y ábrala. Seleccione Configuración de ejecución e ingrese uno en cada uno de los tres cuadros.

En la ventana de tamaño de vóxel, seleccione la importación de archivos s wc. Seleccione el archivo s WC adecuado que coincida con el archivo con el que desea trabajar. Ahora la imagen se superpondrá con la imagen de trazado.

El soma celular debe quedar cubierto por un círculo rojo para vincular los neuritas. Utilice la herramienta de neuritas para unir los nodos de manera que cada punto de bifurcación, representado por nodos amarillos, solo pueda generar dos ramas. Todos los trazos deben ser continuos con el soma.

Ahora, para exportar datos desde Neuron Studio, seleccione archivo, guarde las neuritas y guárdelas con el nombre predeterminado para verificar errores en los archivos swc; escriba bonfire trace. Acceda a la ventana de comandos y presione enter. Seleccione la carpeta de la condición que contiene los datos que acaban de procesarse en la ventana de búsqueda de carpetas y haga clic en aceptar si hay errores en alguna de las imágenes de la carpeta.

El programa generará imágenes que muestran dónde se encuentra el error para extraer datos morfológicos de los archivos dot S WC. Escriba bonfire en la ventana de comandos y presione enter. Seleccione la carpeta de la condición que desea analizar en la ventana de búsqueda de carpetas y seleccione aceptar para cada una de las neuronas de interés.

El análisis de bonfire generará un gráfico de la morfología neuronal junto con los anillos laterales utilizados en el análisis. Además, el comando bonfire generará el archivo MAT que contiene toda la información morfológica obtenida del análisis. Para ver los gráficos preliminares de los resultados de bonfire, escriba el tipo de datos en la ventana de comandos de MATLAB, seleccione la carpeta de condición para la condición que desea ver en la ventana de exploración de carpetas y seleccione Aceptar.

La ventana de búsqueda de carpetas se cerrará temporalmente y se volverá a abrir para permitir la selección de condiciones adicionales. Una vez que se hayan seleccionado las condiciones, seleccione cancelar para salir del proceso de selección. El resultado de Bonfire devolverá gráficos resumen que incluyen los datos de las carpetas de condiciones que seleccionó para exportar los datos morfológicos al tipo Excel de exportación de Bonfire en la ventana de comandos de MATLAB.

Seleccione la carpeta de condición que contiene los datos que desea exportar en la ventana de búsqueda de carpetas y haga clic en Aceptar. Bonfire Export creará archivos de Excel con los datos morfológicos y los colocará en la carpeta de condición seleccionada. Ahora le mostraremos un ejemplo de los datos generados por el programa Bonfire en un conjunto de datos que contiene dos condiciones.

Estas son imágenes invertidas de ejemplo de ambas condiciones. Puede observarse en estas imágenes que la condición uno contiene más dendritas que la condición dos. Este fenómeno también puede observarse en una variedad de gráficos que son generados por el programa bonfire.

Dado que el programa bonfire realiza su análisis en subregiones de las dendritas, las dendritas incrementadas en la condición uno pueden identificarse fácilmente; al trazar la curva de la arborización dendrítica total se observa que hay más dendritas distales respecto al cuerpo celular en las neuronas de la condición uno. Al graficar el número promedio de puntos de bifurcación y puntos terminales por célula, se muestra que la condición uno contiene tanto más puntos de bifurcación como más puntos terminales que la condición dos. Se muestra el número promedio de procesos por célula para dendritas primarias, secundarias, terciarias o de orden superior. Existen más dendritas terciarias y de orden superior en la condición uno. Al trazar el número promedio de procesos por célula para dendritas radicales, intermedias y terminales, se observa que la condición uno tiene más procesos intermedios o terminales que la condición dos.

Se muestran aquí las curvas de análisis de agrupamiento específicas por identidad de segmento, en las que los segmentos se agrupan como primarios, secundarios o terciarios o superiores. El aumento en las dendritas terciarias ocurre distal al cuerpo celular en las neuronas de la condición uno. Se presentan las curvas de análisis de agrupamiento específicas por identidad de segmento en las que los segmentos se agrupan como segmentos radicales, segmentos intermedios o segmentos terminales.

El aumento tanto en las dendritas intermedias como terminales en la condición uno ocurre de forma distal al cuerpo celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un análisis de agrupamiento utilizando el programa bonfire para observar cambios locales en la neuro morfología.