Name: Automatizado de Análisis de la morfología neuronal Sholl digitalizados en múltiples escalas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-14T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Aprende a analizar la morfología neuronal con el programa semiautomatizado Bonfire en MATLAB. Este método computacional permite realizar análisis de Sholl digitalizado para observar cambios locales en dendritas y axones con mayor eficiencia y precisión que los métodos manuales tradicionales.

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Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención Busch Biomédica, NSF subvención IBN-0548543, NSF IBN-0919747 conceder, March of Dimes Foundation Grant 1-AF04-107, March of Dimes Foundation Grant 1-AF08-464 (a BLF). MKK y CGL fueron apoyados por NIH Biotecnología Capacitación subvención T32 GM008339-20, y CGL también fue apoyada por una Comisión de Nueva Jersey en la columna vertebral de becas predoctorales de investigación sobre médula 08-2941-SCR-E-0.

1. Antes de empezar: 1) E18 disección de la rata: Los métodos estándar de la disección de las neuronas del hipocampo E18 han sido descritos previamente 13. Con el fin de utilizar el programa hoguera para analizar las características morfológicas de las neuritas, de 8 bits. TIF de las neuronas individuales deben ser obtenidos. Esto se puede lograr de varias maneras, según el protocolo experimental que se está siguiendo. Las neuronas pueden ser chapada a una densidad suficientemente baja para que las neuronas individuales aparecen en el campo del microscopio. Por otra parte, a las neuronas individuales de la imagen que se cultivan en un cultivo denso, las neuronas pueden ser transfectadas utilizando una variedad de métodos de transfección con un plásmido que codifica una proteína fluorescente. 2) Requisitos de software y la instalación: <ol class="ualpha"><li> El plug-in para el software NeuronJ ImageJ de NIH y NeuronStudio deben estar instalados para poder ejecutar el programa de la hoguera. Los paquetes de software se puede encontrar en las siguientes páginas web: ImageJ - <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> NeuronJ - <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</a> NeuronStudio - <a href="http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html">http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html</a> </li><li> El programa de la hoguera se puede encontrar en http://lifesci.rutgers.edu/ ~ Firestein. El manual del usuario hoguera también está disponible en este sitio web. Además, la descripción inicial de la hoguera se pueden encontrar en Langhammer et al, Citometría de 2010. Todos los datos han sido analizados mediante un sistema operativo Windows. </li></ol> 3) Ajuste de imagen Resolución: Usted tendrá que ajustar el programa de la hoguera sobre la base de la resolución de imagen de las imágenes que se desea analizar. En la parte bonfire_parameters del programa de Bonfire, sustituya el valor actual de la pix_conv variable con el valor de la resolución de la imagen (m / pixel) de las imágenes. 2. Estructura del archivo: Con el fin de la hoguera para analizar los datos, los archivos deben estar organizados de esta estructura específica (Figura 2). Usted tendrá que: <ul><li> Una carpeta principal </li><li> Sub-carpetas (que contienen cada uno de sus diferentes condiciones) </li><li> Archivos de celda de la imagen (archivos filename.tif) contenidos en las carpetas de diferentes condiciones </li><li> Una carpeta que contiene la hoguera hoguera Matlab mfiles (también se encuentra en la carpeta principal) </li></ul> 3. Las neuronas de búsqueda en NeuronJ: <ol><li> Preparar la imagen para el rastreo <ol class="lalpha"><li> Abra la imagen, seleccionando el botón "Abrir" en la barra de herramientas y NeuronJ seleccionar la imagen que le gustaría dejar rastro. </li><li> Cambiar el tamaño de la imagen mediante la selección de la 'maximizar' botón. </li><li> Ajustar el brillo y el contraste de la imagen para que pueda visualizar todas las neuritas mediante la selección de 'Imagen' en la barra de herramientas NeuronJ luego seleccionar "Ajuste de brillo / contraste. </li></ol></li><li> Rastrear el cuerpo de la célula en NeuronJ e identificar la huella como "Tipo 06" <ol class="lalpha"><li> Seleccione el botón "Añadir Rastros" en la barra de herramientas NeuronJ. </li><li> Trace una línea alrededor del perímetro del cuerpo celular. </li><li> Seleccione el botón 'Trazos de etiquetas "en la barra de herramientas NeuronJ. </li><li> Seleccione 'N1' de la 'Tracing ID "del menú desplegable. </li><li> "Tipo 06", seleccione en el NeuronJ: Atributos de la ventana y seleccione "Aceptar". </li></ol></li><li> Traza las neuritas en NeuronJ <ol class="lalpha"><li> Seleccione el botón "Añadir Rastros" en la barra de herramientas NeuronJ. </li><li> Añadir un recorrido a lo largo de cada rama de las neuritas. Sólo puede seleccionar las dendritas o axones, en función de su experimento. </li><li> Le sugerimos que los segmentos de dibujar parar en cada punto de ramificación, con cada punto de ramificación hija a partir de ese momento como una nueva traza. </li><li> Seleccione el botón "Guardar trazados" en la barra de herramientas NeuronJ. </li><li> Guardar el trazado que acaba de crear en la misma carpeta que el archivo de imagen original. </li></ol></li><li> Exportar los archivos de rastreo y el archivo de seguimiento identificador de NeuronJ Dos tipos de archivos deben ser exportados de NeuronJ y se guardan en las carpetas de las condiciones adecuadas, junto con el. Tif y archivos. NDF. <ol class="lalpha"><li> Seleccione el botón "Seguimiento de exportación" en la barra de herramientas NeuronJ. </li><li> Seleccione la pestaña "-deliminated archivos de texto: archivo separado para" opción en el 'cada trazado NeuronJ: Exportar' cuadro de diálogo y seleccione "Aceptar". </li><li> Permitir NeuronJ para elegir los nombres de los archivos y la ubicación de almacenamiento. </li><li> Seleccione el botón 'Trazos medida' en la barra de herramientas NeuronJ. </li><li> Selecciona la opción "Mostrar las mediciones de seguimiento 'en el' NeuronJ: Medidas 'ventana y seleccione" Ejecutar ". </li><li> 'Archivo' seleccione el 'NeuronJ: Trazos "de la ventana. </li><li> Seleccione "Guardar como" y guarde el archivo como Filename_info. 'Archivo' debe coincidir exactamente con el nombre del archivo de imagen original (incluyendo la capitalización), seguido por _info y no debe contener una carta de 3 de extensiones de archivos. Por ejemplo, para Cell20.tif nombre original de la imagen, este archivo se llamaría 'Cell20_info. Verifique que su equipo no agrega automáticamente una extensión de archivo. Xls. Si lo hace, la extensión de archivo se deben eliminar manualmente. </li></ol></li></ol> 4. Use la hoguera para construir archivos SWC preliminares de los datos NeuronJ.: <ol><li> Reorganizar las carpetas con "bonfire_load ' <ol class="lalpha"><li> Abra Matlab haciendo doble clic sobre el icono. </li><li> Haga clic en el botón 'en la parte superior derecha de la ventana de comandos. </li><li> Seleccione la 'hoguera' carpeta en la carpeta principal en el "Buscar carpeta" ventana. </li><li> Tipo 'bonfire_load' en la ventana de comandos del Matlab y pulse enter. </li><li> Seleccione la carpeta condición de que usted desea analizar en el "Buscar carpeta" ventana y seleccione "Aceptar". </li><li> Esto se reorganizará la estructura de carpetas mediante la creación de células sub-carpetas que contienen todos los datos de cada celda individual. </li></ol></li><li> Crear archivos filename_prelim.swc con 'bonfire_ndf2swc' <ol class="lalpha"><li> "Bonfire_ndf2swc" escribir en la ventana de comandos y pulse Intro. </li><li> Seleccione la carpeta mismas condiciones que le acaba de reorganizar con 'bonfire_load "en el" Buscar carpeta "ventana y seleccione" Aceptar ". </li><li> Esto creará un archivo. Swc en cada carpeta de células de la condición de elegido. Cada carpeta celular ahora tendrá 5 ficheros,. Tif la imagen original, el archivo de NDF, el archivo de identificador de traza _info, un archivo txt y un archivo SWC.... </li></ol></li></ol> 5. Use NeuronStudio para Finalizar archivos SWC.: <ol><li> Abrir y calibrar las imágenes de neuronas en NeuronStudio <ol class="lalpha"><li> Abra el programa NeuronStudio. </li><li> Seleccione Archivo → Abrir en la barra de herramientas NeuronStudio. </li><li> Encontrar la imagen. Tif de la neurona que desea modificar y abrirlo. </li><li> Seleccione Ejecutar → Configuración e introduzca '1 'en cada uno de los 3 (X, Y, Z) cajas en la "ventana de tamaño de vóxel. </li><li> Seleccione Archivo → Importar SWC. Seleccione el archivo correspondiente. SWC. El archivo de imagen ahora se superpone con una imagen de rastreo. El soma celular debe ser cubierta con un círculo rojo. </li></ol></li><li> Use NeuronStudio de neuritas enlace <ol class="lalpha"><li> Utilice las herramientas en NeuronStudio para identificar correctamente los puntos de ramificación y el punto final (le recomendamos que se familiaricen con las características NeuronStudio y accesos directos antes de analizar los datos). </li><li> En concreto, el uso de la "herramienta de neuritas para unirse a los nodos de modo que: <ul><li> Cada punto de ramificación (nodos amarillos) sólo se pueden crear dos ramas </li><li> Todos los rastros se continua con el soma (sólo un nodo rojo) </li></ul></li></ol></li><li> Exportar datos de NeuronStudio <ol class="lalpha"><li> Seleccione Archivo → Guardar neuritas (salvo que el nombre por defecto). </li></ol></li><li> Compruebe si hay errores en el. Swc archivos utilizando "bonfire_trace_check ' <ol class="lalpha"><li> "Bonfire_trace_check" escribir en la ventana de comandos MathLab y pulse enter. </li><li> Seleccione la carpeta que contiene el estado de los datos que acaba de procesar en el "Buscar carpeta" ventana y seleccione "Aceptar". </li><li> Si hay algún error en alguna de las imágenes de la carpeta el programa mostrará las imágenes que muestran que el error se encuentra. </li><li> Corrección de errores en NeuronStudio <ol class="lroman"><li> Abra el archivo de imagen que guardó en el paso de la exportación. </li><li> Localizar y solucionar el problema (s). </li><li> Haga clic en Archivo → Guardar neuritas. </li><li> Repita para otras imágenes que necesitan ser corregidos. </li><li> Vuelva a ejecutar 'bonfire_trace_check' (5,4). </li></ol></li></ol></li></ol> 6. Use 'hoguera' para extraer datos morfológicos de los archivos SWC.: <ol class="lalpha"><li> 'Hoguera' escribe en la ventana de comandos y pulse Intro. </li><li> Seleccione la carpeta que contiene el estado de los datos que desea analizar en el "Buscar carpeta" ventana y seleccione "Aceptar". </li><li> El análisis de la hoguera se generará una ventana para cada una de las neuronas que se analiza, en la que los gráficos de la morfología neuronal junto con los anillos Sholl utilizados en el análisis. Además, el comando 'hoguera' va a generar el archivo. Estera que contiene toda la información morfológica que se ha tomado del análisis. </li></ol> 7. Use 'bonfire_results' para ver los datos: <ol class="lalpha"><li> Tipo 'bonfire_results' en la ventana de comandos del Matlab. </li><li> Seleccione la carpeta de condiciones para la condición que le gustaría ver en el "Buscar carpeta" ventana y seleccione "Aceptar". </li><li> El "Buscar carpeta" ventana se cerrará temporalmente y volver a abrir, lo que le permite seleccionar las condiciones adicionales que le gustaría ver. </li><li> Cuando haya terminado de seleccionar las carpetas condición, seleccione "Cancelar" para salir del proceso de selección. </li><li> "Bonfire_results 'volverá tablas resumen que incluya ªlos datos de las carpetas de correo condición de que haya seleccionado. </li></ol> 8. Use 'bonfire_export "para exportar datos a Excel: <ol class="lalpha"><li> Tipo 'bonfire_export' en la ventana de comandos. </li><li> Seleccione la carpeta que contiene el estado de los datos que desea exportar en el "Buscar carpeta" ventana y seleccione "Aceptar". Bonfire_export creará archivos de Excel de los datos morfológicos y los colocará en la carpeta condición de que fue seleccionado. </li></ol> 9. Los resultados representativos: Un ejemplo de los datos generados por el programa de la hoguera en un conjunto de datos que contiene dos condiciones se muestra en la Figura 3. En este ejemplo, un Estado de las neuronas contienen más neuritas distal al cuerpo celular. Este fenómeno se puede observar en las imágenes de ejemplo (Figura 3 B), así como en la curva de Sholl de la dendríticas total de árbol (Figura 3) y en la gráfica de la cantidad de puntos terminales (Figura 3C). Además, debido a que el programa de la hoguera también realiza análisis de Sholl en las subregiones de las imágenes, que son capaces de identificar más específicamente la identidad de las neuritas que se han incrementado. Tanto el número total de intersecciones de orden 3 º o más neuritas (Figura 3F) y el número total de los intermediarios y neuritas terminal (Figura 3G) aumentan distal al cuerpo celular. Estas tendencias también se pueden observar en las figuras 3D y 3E. <img src="/files/ftp_upload/2354/2354fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1:. Diagrama de flujo del programa de Bonfire Las neuronas son trazados con ImageJ. Los datos se exportan y se convirtió en el programa hoguera en archivos SWC preliminar.. NeuronStudio se utiliza para definir la conectividad de las neuritas. Cheques hoguera de los errores y luego calcula las curvas de Sholl, el número de neuritas primaria, para secundaria y superior, y el número de puntos de ramificación y consejos de las neuritas. Finalmente, los datos son exportados a Excel para su análisis estadístico. <img src="/files/ftp_upload/2354/2354fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: Estructura de los archivos necesarios para el análisis Hoguera La estructura del archivo debe coincidir con este o el programa no funcionará correctamente.. Los nombres de las carpetas y los archivos y la cantidad de las carpetas y los archivos se puede cambiar. <img src="/files/ftp_upload/2354/2354fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: Ejemplo de datos de salida del programa de una fogata curvas) Total Sholl.. B) Ejemplo invertida imágenes de ambas condiciones. C) Número promedio de puntos de ramificación y en los extremos / celular. D) Número medio de procesos / celular de primaria, secundaria y terciaria o superior neuritas. E) Promedio de procesos / celular de la raíz, intermedio y neuritas terminal. F) Segmento de la identidad específica de las curvas de análisis Sholl. Los segmentos se agrupan en primaria, secundaria o terciaria o superior. G) Segmento de la identidad específica de las curvas de análisis Sholl. Los segmentos se agrupan en los segmentos de raíz, los segmentos intermedios, o segmentos de la terminal.

<ol><li>Elston, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+cells+of+the+frontal+lobe%3A+all+the+more+spinous+to+think+with%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pyramidal cells of the frontal lobe: all the more spinous to think with.</a> J Neurosci. 20, (2000).</li>
<li>Koch, C., Segev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+single+neurons+in+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of single neurons in information processing.</a> Nat Neurosci. , Suppl 3. 1171-1177 (2000).</li>
<li>Poirazi, P., Mel, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+active+dendrites+and+structural+plasticity+on+the+memory+capacity+of+neural+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Impact of active dendrites and structural plasticity on the memory capacity of neural tissue.</a> Neuron. 29, 779-796 (2001).</li>
<li>Schaefer, A. T., Larkum, M. E., Sakmann, B., Roth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coincidence+detection+in+pyramidal+neurons+is+tuned+by+their+dendritic+branching+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Coincidence detection in pyramidal neurons is tuned by their dendritic branching pattern.</a> J Neurophysiol. 89, 3143-3154 (2003).</li>
<li>Vetter, P., Roth, A., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+action+potentials+in+dendrites+depends+on+dendritic+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Propagation of action potentials in dendrites depends on dendritic morphology.</a> J Neurophysiol. 85, 926-937 (2001).</li>
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<li>Brette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulation+of+networks+of+spiking+neurons%3A+a+review+of+tools+and+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comput+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Simulation of networks of spiking neurons: a review of tools and strategies.</a> J Comput Neurosci. 23, 349-398 (2007).</li>
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<li>Harrison, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropathology+of+schizophrenia.+A+critical+review+of+the+data+and+their+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The neuropathology of schizophrenia. A critical review of the data and their interpretation.</a> Brain. 122, 593-624 (1999).</li>
<li>Lewis, D. A., Glantz, L. A., Pierri, J. N., Sweet, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cortical+glutamate+neurotransmission+in+schizophrenia%3A+evidence+from+morphological+studies+of+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Altered cortical glutamate neurotransmission in schizophrenia: evidence from morphological studies of pyramidal neurons.</a> Ann N Y Acad Sci. 1003, 102-112 (2003).</li>
<li>Kaufmann, W. E., Moser, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+anomalies+in+disorders+associated+with+mental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation.</a> Cereb Cortex. 10, 981-991 (2000).</li>
<li>Georges, P. C., Hadzimichalis, N. M., Sweet, E. S., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin-yang+of+dendrite+morphology%3A+unity+of+actin+and+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The yin-yang of dendrite morphology: unity of actin and microtubules.</a> Mol Neurobiol. 38, 270-284 (2008).</li>
<li>Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cypin%3A+a+cytosolic+regulator+of+PSD-95+postsynaptic+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cypin: a cytosolic regulator of PSD-95 postsynaptic targeting.</a> Neuron. 24, 659-672 (1999).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses. Las agencias de financiación no tiene función científica en el desarrollo de la hoguera.

El programa de la hoguera es un programa semi-automático para el análisis de la dendrita y axón morfología. Se aumenta la eficiencia y la exactitud del análisis de Sholl sobre la realización del análisis de forma manual. Además, el programa guarda los datos de la hoguera en cada paso del proceso, por lo que es posible auditar los datos y verificar la exactitud de los análisis. Por lo tanto, la tarea de análisis de datos se pueden distribuir a numerosas personas sin comprometer la precisión. Por último, mediante la reali...

<table><tbody><tr><td>Complemento NeuronJ</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Programa Bonfire</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://lifesci.rutgers.edu/%7Efirestein">http://lifesci.rutgers.edu/~firestein&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>NeuronStudio</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html">http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Programa MatLab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

automatizado de análisis de la morfología neuronal sholl digitalizados en múltiples escalas

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Morfología neuronal desempeña un papel importante en la determinación de cómo las neuronas funcionar y comunicarse 1-3. En concreto, afecta a la capacidad de las neuronas para recibir aportes de otras células 2 y contribuye a la propagación de potenciales de acción 4,5. La morfología de las neuritas también afecta a la información es procesada. La diversidad de morfologías dendríticas facilitar la señalización de rango local y de larga y permitir que las neuronas individuales o grupos de neuronas para llevar a cabo funciones especializadas dentro de la red neuronal 6,7. Alteraciones en la morfología dendrítica, incluyendo la fragmentación de las dendritas y los cambios en los patrones de ramificación, se han observado en varios estados de la enfermedad, incluyendo la enfermedad de Alzheimer 8, 9,10 esquizofrenia y retraso mental 11. La capacidad tanto de entender los factores que determinan morfologías dendríticas e identificar los cambios en la morfología de las dendritas es esencial en la comprensión de la función del sistema nervioso y la disfunción. Morfología de las neuritas se analiza a menudo por el análisis de Sholl y contando el número de neuritas y el número de puntas de las ramas. Este análisis se aplica generalmente a las dendritas, pero también se puede aplicar a los axones. Realizar este análisis con la mano es a la vez mucho tiempo e inevitablemente introduce la variabilidad debida a la predisposición del experimentador y la incoherencia. El programa de la hoguera es un método semi-automatizado para el análisis de la dendrita y axón morfología que se basa en código abierto disponibles herramientas de análisis morfológico. Nuestro programa permite la detección de cambios locales en la dendrita y axón ramificaciones comportamientos mediante la realización de análisis de Sholl en las subregiones de la glorieta neuríticas. Por ejemplo, el análisis de Sholl se realiza en tanto la neurona en su conjunto, así como en cada subconjunto de procesos (primaria, secundaria, terminal, raíces, etc) y los patrones Dendrite axón está influenciada por una serie de factores intracelulares y extracelulares, muchos actuar localmente. Por lo tanto, la morfología cenador resultante es el resultado de procesos específicos que actúan sobre las neuritas específicos, por lo que es necesario realizar el análisis morfológico en una escala menor a fin de observar estas variaciones locales 12. El programa de Bonfire requiere el uso de dos herramientas de análisis de código abierto, el plug-in para ImageJ NeuronJ y NeuronStudio. Las neuronas son trazadas en ImageJ y NeuronStudio se utiliza para definir la conectividad entre las neuritas. Hoguera contiene una serie de scripts escritos en MATLAB (The Mathworks) que se utilizan para convertir los datos en el formato adecuado para su posterior análisis, comprobación de errores de usuario, y en última instancia, el análisis Sholl. Finalmente, los datos son exportados a Excel para su análisis estadístico. Un diagrama de flujo del programa de la hoguera se muestra en la Figura 1.

Hemos desarrollado un programa de computadora para analizar la morfología neuronal. En combinación con dos herramientas existentes de código abierto de análisis, nuestro programa realiza análisis de Sholl y determina el número de neuritas, los puntos de ramificación, y consejos de las neuritas. Los análisis se realizan para que los cambios locales en la morfología de las neuritas se puede observar.

Automatizado de Análisis de la morfología neuronal Sholl digitalizados en múltiples escalas

La morfología neuronal desempeña un papel significativo en la determinación de cómo funcionan y se comunican las neuronas1-3. Específicamente, afecta la capacidad de las neuronas para...

Este video demuestra un procedimiento para analizar la morfología de dendritas y axones, conocidos colectivamente como neuritas, mediante un programa semiautomatizado con el fin de observar cambios locales. Primero, el software NeuronJ se utiliza para trazar imágenes TIFF de ocho bits de neuronas y así identificar la posición de los segmentos de neuritas. Luego, el software NeuronStudio se emplea para definir información estructural sobre la conectividad entre las neuritas.Finalmente, se ejecuta el programa bonfire en MATLAB para extraer datos morfológicos de las células, incluyendo el análisis shoal, así como el número de puntos de bifurcación de los neuritos y los extremos de los neuritos. Los resultados muestran cambios locales en la morfología de los neuritos basados en el rendimiento del análisis shoal en subregiones del arbor neurítico. La ventaja principal de esta técnica frente a los métodos existentes, como el análisis shoal realizado manualmente, es que el programa es semiautomatizado, lo que aumenta considerablemente la eficiencia del análisis y permite auditar los datos para verificar la precisión del análisis.El procedimiento será demostrado por Hirsch AWA, estudiante universitario que trabaja en el laboratorio de Firestein durante el verano. Para utilizar el programa bonfire y analizar las características morfológicas de las neuritas, deben obtenerse imágenes TIFF de ocho bits de neuronas individuales tras descargar el programa bonfire. Los ajustes del programa deben modificarse según la resolución de las imágenes que se deseen analizar; en la sección de parámetros de bonfire del programa, reemplace el valor actual de la variable picks conversion por el valor de la resolución de sus imágenes.Para que bonfire pueda analizar los datos, los archivos deben organizarse en una estructura específica, que incluye una carpeta principal, una carpeta bonfire que contenga los archivos MATLAB M de bonfire, subcarpetas que contengan cada una de las condiciones diferentes y los archivos de imágenes celulares dentro de las carpetas de condiciones diferentes; comience por preparar la imagen para el trazado. Para este experimento, solo se trazarán las dendritas con el fin de analizar los cambios en la morfología dendrítica. Comience por preparar la imagen para el trazado.Abra la imagen seleccionando el botón de apertura en la barra de herramientas de NeuronJ y seleccione la imagen que desea trazar. Ahora, cambie el tamaño de la imagen seleccionando el botón de maximizar para ajustar el brillo y el contraste de la imagen de modo que pueda visualizar todos los neuritas; seleccione la imagen en la barra de herramientas de NeuronJ y luego seleccione ajustar brillo contraste. Para comenzar el trazado, seleccione el botón agregar trazos en la barra de herramientas de NeuronJ y trace alrededor del perímetro del cuerpo celular.Luego, seleccione el botón de trazado de etiqueta en la barra de herramientas de NeuronJ y seleccione N uno en el menú desplegable de ID de trazado; en la ventana de atributos de NeuronJ, seleccione tipo cero seis y haga clic en Aceptar. Para comenzar a trazar las neuritas, seleccione el botón de agregar trazos en la barra de herramientas de NeuronJ y agregue un trazo a lo largo de cada rama de neurita de interés. Es recomendable que los segmentos que dibuje terminen en cada punto de bifurcación, con cada rama hija comenzando en ese punto como un trazo nuevo.Seleccione el botón guardar trazados en la barra de herramientas de NeuronJ y guarde el trazado que acaba de crear en la misma carpeta que el archivo de imagen original. A continuación, exporte los archivos de trazado y los archivos de identificador de trazado desde NeuronJ. Seleccione el botón exportar trazado en la barra de herramientas de NeuronJ. Ahora, seleccione la opción archivos de texto delimitados por tabulaciones, archivo separado para cada trazado en el cuadro de diálogo de exportación de NeuronJ y haga clic en aceptar para permitir que NeuronJ elija los nombres de los archivos y la ubicación de guardado.Seleccione el botón de trazos de medida en la barra de herramientas de NeuronJ y luego seleccione la opción de mostrar mediciones de trazos en la ventana de mediciones de NeuronJ. Seleccione Ejecutar archivo en la ventana de trazos de NeuronJ, luego seleccione Guardar como y guarde el archivo. El nombre del archivo debe coincidir exactamente con el nombre del archivo de imagen original, seguido de guion bajo y la palabra info, y no debe contener una extensión de archivo de tres letras. Verifique que su computadora no agregue automáticamente una extensión de archivo XLS.Si es así, la extensión del archivo debe eliminarse manualmente. Primero, reorganice las carpetas utilizando bonfire load abriendo matlab y haciendo clic en el botón de los tres puntos en la esquina superior derecha de la ventana de comandos. Seleccione la carpeta bonfire en su carpeta principal en la ventana de búsqueda de carpetas, escriba bonfire load en la ventana de comandos y presione enter.Seleccione la carpeta de condición que desea analizar en la ventana de búsqueda de carpetas y seleccione Aceptar. Esto reorganizará la estructura de carpetas creando subcarpetas de células que contienen todos los datos para cada célula individual. Ahora, para crear archivos con nombre de archivo_guion_bajo_premium_swc, escriba bonfire_guion_bajo_NDF2sWC en la ventana de comandos y presione enter.Seleccione la misma carpeta de condición que acaba de reorganizarse con la carga de bonfire en la ventana de búsqueda de carpetas y seleccione Aceptar. Esto creará un archivo WC en cada carpeta de célula para la condición elegida. Cada carpeta de célula contendrá cinco archivos.La imagen TIF original, el archivo NDF, la información con guion bajo, el archivo identificador de trazas, un archivo TXT y un archivo swc. Antes de utilizar Neuron Studio, recomendamos que se familiarice con las funciones y atajos del programa. Disponen de un excelente manual de usuario en línea, y conocer los atajos de teclado le ahorrará una gran cantidad de tiempo.Para comenzar, abra el programa Neuron Studio y seleccione Archivo Abrir en la barra de herramientas de Neuron Studio; busque la imagen TIF del neutrón que desea editar y ábrala. Seleccione Configuración de ejecución e ingrese uno en cada uno de los tres cuadros.En la ventana de tamaño de vóxel, seleccione la importación de archivos s wc. Seleccione el archivo s WC adecuado que coincida con el archivo con el que desea trabajar. Ahora la imagen se superpondrá con la imagen de trazado.El soma celular debe superponerse con un círculo rojo para vincular los neuritos. Utilice la herramienta de neuritas para unir los nodos de manera que cada punto de bifurcación, representado por nodos amarillos, solo pueda crear dos ramas. Todos los trazos deben ser continuos con el soma.Ahora, para exportar datos desde Neuron Studio, seleccione archivo, guarde las neuritas y guárdelas con el nombre predeterminado. Para verificar errores en los archivos swc, escriba en la línea de comandos bonfire trace. Revise la ventana de comandos y presione enter. Seleccione la carpeta de condición que contiene los datos que acaban de procesarse en la ventana Examinar para buscar carpeta y haga clic en Aceptar si hay algún error en cualquiera de las imágenes de la carpeta.El programa generará imágenes que muestran dónde se encuentra el error para extraer datos morfológicos de los archivos dot S WC. Escriba bonfire en la ventana de comandos y presione enter. Seleccione la carpeta de la condición que desea analizar en la ventana de búsqueda de carpetas y seleccione aceptar para cada una de las neuronas de interés.El análisis de bonfire generará un gráfico de la morfología neuronal junto con los anillos periféricos utilizados en el análisis. Además, el comando bonfire generará el archivo MAT que contiene toda la información morfológica obtenida del análisis. Para ver los gráficos preliminares de los datos, escriba bonfire results en la ventana de comandos de MATLAB, seleccione la carpeta de condición para la condición que desea visualizar en la ventana de búsqueda de carpetas y haga clic en Aceptar.La ventana de búsqueda de carpetas se cerrará temporalmente y se volverá a abrir para permitir la selección de condiciones adicionales. Una vez que se hayan seleccionado las condiciones, seleccione cancelar para salir del proceso de selección. El resultado de Bonfire devolverá gráficos resumen que incluyen los datos de las carpetas de condiciones que seleccionó para exportar los datos morfológicos al tipo de archivo Excel de exportación de Bonfire en la ventana de comandos de MATLAB.Seleccione la carpeta de condición que contiene los datos que desea exportar en la ventana de búsqueda de carpetas y seleccione. De acuerdo, la exportación de bonfire creará archivos de Excel con los datos morfológicos y los colocará en la carpeta de condición que fue seleccionada. Ahora le mostraremos un ejemplo de los datos generados por el programa bonfire en un conjunto de datos que contiene dos condiciones.Estas son imágenes invertidas de ejemplo de ambas condiciones. Puede observarse en estas imágenes que la condición uno contiene más dendritas que la condición dos. Este fenómeno también puede observarse en una variedad de gráficos que son generados por el programa bonfire.Dado que el programa bonfire realiza su análisis en subregiones de las dendritas, las dendritas incrementadas en la condición uno pueden identificarse fácilmente; graficar la curva de la totalidad del arbore dendrítico muestra que hay más dendritas distales al cuerpo celular en las neuronas de la condición uno. Graficar el número promedio de puntos de bifurcación y puntos terminales por célula muestra que la condición uno contiene tanto más puntos de bifurcación como más puntos terminales que la condición dos. Se muestra el número promedio de procesos por célula para dendritas primarias, secundarias, terciarias o de orden superior. Hay más dendritas terciarias y de orden superior en la condición uno. Graficar el número promedio de procesos por célula para dendritas radicales, intermedias y terminales muestra que la condición uno tiene más procesos intermedios o terminales que la condición dos.Se muestran aquí las curvas de análisis de agrupamiento específicas por identidad de segmento, en las que los segmentos se agrupan como primarios, secundarios o terciarios o superiores. El aumento en las dendritas terciarias ocurre distal al cuerpo celular en las neuronas de la condición uno. Se presentan las curvas de análisis de agrupamiento específicas por identidad de segmento, en las que los segmentos se agrupan como segmentos radicales, segmentos intermedios o segmentos terminales.El aumento tanto de dendritas intermedias como terminales en la condición uno ocurre de forma distal al cuerpo celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un análisis de agrupamiento utilizando el programa bonfire para observar cambios locales en la neuro morfología.

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