Automatizado de Análisis de la morfología neuronal Sholl digitalizados en múltiples escalas

Este video muestra un procedimiento para analizar la morfología de dendritas y axones, conocidos colectivamente como neuritas, utilizando un programa semiautomatizado para observar cambios locales. El software First Neuron J se utiliza para trazar imágenes TIFF de ocho bits de las neuronas para identificar la posición de los segmentos de neuritas. A continuación, se utiliza el software Neuron studio para definir la información estructural sobre la conectividad entre las neuritas.

Por último, se ejecuta el programa bonfire MATLAB para extraer datos morfológicos de las células, incluido el análisis de cardúmenes, así como el número de puntos de ramificación de neuritas y puntas de neuritas. Los resultados muestran cambios locales en la morfología de las neuritas con base en la realización de análisis de cardúmenes en subregiones del árbol neurótico. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el análisis manual de cardúmenes, es que el programa es semiautomatizado, lo que aumenta en gran medida la eficiencia del análisis y permite auditar los datos para poder verificar la precisión del análisis.

Para demostrar el procedimiento estará el estudiante de pregrado de Hirsch AWA que trabajará en el laboratorio Firestein durante el verano. Con el fin de utilizar el programa de la hoguera para analizar las características morfológicas de las neuritas de ocho bits, se deben obtener imágenes de las neuronas individuales después de descargar el programa de la hoguera. La configuración del programa debe ajustarse en función de la resolución de la imagen de las imágenes que desea analizar en la parte de parámetros de la hoguera del programa de hoguera, reemplace el valor actual para la conversión de selecciones de variables con el valor de la resolución de imagen de sus imágenes.

Para que bonfire analice los datos, los archivos deben organizarse en una estructura específica, que incluya una carpeta maestra, una carpeta de bonfire que contenga los archivos MATLAB M de bonfire, subcarpetas que contengan cada una de las diferentes condiciones y los archivos de imagen de celda dentro de las diferentes carpetas de condiciones comiencen preparando la imagen para el seguimiento. Para este experimento, solo se rastrearán las dendritas con el fin de analizar los cambios en la morfología dendrítica. Comience preparando la imagen para el trazado.

Abra la imagen seleccionando el botón Abrir en la barra de herramientas de la neurona J y seleccione la imagen que desea trazar. Ahora, cambie el tamaño de la imagen seleccionando el botón maximizar para ajustar el brillo y el contraste de la imagen, de modo que pueda visualizar todas las imágenes seleccionadas de Neurites en la barra de herramientas de la neurona J y, a continuación, seleccione ajustar contraste de brillo. Para comenzar a trazar, seleccione el botón agregar rastros en la barra de herramientas de la neurona J Trazar alrededor del perímetro del cuerpo de la célula.

A continuación, seleccione el botón etiquetar trazados en la barra de herramientas de la neurona J y seleccione N uno en el menú desplegable ID de seguimiento, seleccione el tipo cero seis en la ventana de atributos de la neurona J y seleccione Aceptar. Para comenzar a trazar las neuritas, seleccione el botón agregar trazas en la barra de herramientas de la neurona J y agregue una traza a lo largo de cada rama de neurita de interés. Lo mejor es que los segmentos que dibuje se detengan en cada punto de bifurcación con cada punto de bifurcación secundario, comenzando en ese punto como una nueva traza.

Seleccione el botón Guardar trazados en la barra de herramientas de la neurona J y guarde el calco que acaba de crear en la misma carpeta que el archivo de imagen original. A continuación, exporte los archivos de rastreo y los archivos de identificador de rastreo de la neurona J.Seleccione el botón exportar rastreo en la barra de herramientas de la neurona J. Ahora seleccione la pestaña archivos de texto delimitados, archivo separado para cada opción de trazados en el cuadro de diálogo de exportación de la neurona J y seleccione aceptar permitir que la neurona J elija los nombres de los archivos y la ubicación de guardado.

Seleccione el botón medir trazados en la barra de herramientas de la neurona J y, a continuación, seleccione la opción Mostrar mediciones de trazados en la ventana de mediciones de la neurona J y seleccione ejecutar Seleccionar archivo en la ventana de trazados de la neurona J y, a continuación, seleccione guardar como y guarde el archivo. El nombre del archivo debe coincidir exactamente con el nombre del archivo de imagen original, seguido de información de subrayado y no debe contener una extensión de archivo de tres letras. Compruebe que su ordenador no añade automáticamente una extensión de archivo XLS.

Si es así, la extensión del archivo debe eliminarse manualmente. Primero, reorganice las carpetas usando bonfire load abriendo matlab y haciendo clic en el botón de triple punto en la parte superior derecha de la ventana de comandos. Seleccione la carpeta de hogueras en su carpeta maestra en la ventana de búsqueda de carpetas, escriba hoguera, cargue en la ventana de comandos y presione enter.

Seleccione la carpeta de condiciones que desea analizar en la ventana buscar carpeta y seleccione. Bien. Esto reorganizará la estructura de carpetas mediante la creación de subcarpetas de celdas que contengan todos los datos de cada celda individual. Ahora, para crear el nombre del archivo, subraye los archivos swc premium, escriba bonfire, subraye NDF dos s WC en la ventana de comandos y presione enter.

Seleccione la misma carpeta de condiciones que se acaba de reorganizar con la carga de hoguera en la ventana Buscar carpeta y seleccione. Bien. Esto creará un archivo WC en cada carpeta de celdas para la condición elegida. Cada carpeta de celda contendrá cinco archivos.

La imagen TIF original, el archivo NDF, la información de carácter bajo, el archivo de identificador de seguimiento, un archivo TXT y un archivo swc. Antes de utilizar Neuron Studio, le recomendamos que se familiarice con las funciones y accesos directos del programa. Tienen un excelente manual de usuario en línea y conocer los atajos de teclado le ahorrará una gran cantidad de tiempo.

Para comenzar, abra el programa Neuron Studio y seleccione Abrir archivo en la barra de herramientas de Neuron Studio, busque la imagen TIF de la neurona. Desea editarlo y abrirlo. Seleccione la configuración de ejecución e introduzca una en cada una de las tres casillas.

En la ventana de tamaño de vóxel, seleccione archivo import s wc. Seleccione el archivo s WC apropiado que coincida con el archivo con el que desea trabajar. El archivo de imagen ahora se superpondrá con la imagen de seguimiento.

El soma de la célula debe estar cubierto con un círculo rojo para unir las neuritas. Utilice la herramienta neurita para unir nodos de modo que cada punto de bifurcación representado por nodos amarillos solo pueda crear dos ramas. Todos los rastros deben ser continuos con el soma.

Ahora, para exportar datos de Neuron Studio, seleccione archivo, guarde neuritas y guarde como nombre predeterminado para verificar si hay errores en los archivos swc tipo bonfire trace. Regístrese en la ventana de comandos y presione Enter. Seleccione la carpeta de condiciones que contiene los datos que se acaban de procesar en la ventana Buscar carpeta y seleccione Aceptar si hay algún error en alguna de las imágenes de la carpeta.

El programa generará imágenes que muestran dónde se encuentra el error para extraer datos morfológicos de los archivos WC del punto S. Escriba hoguera en la ventana de comandos y presione enter. Seleccione la carpeta de condiciones que desea analizar en la ventana de búsqueda de carpetas y seleccione Aceptar para cada una de las neuronas de interés.

El análisis de la hoguera generará un gráfico de la morfología neuronal junto con los anillos de hombro utilizados en el análisis. Además, el comando bonfire generará el archivo MAT que contiene toda la información morfológica que se ha extraído del análisis. Para ver los gráficos preliminares de los resultados de bonfire de tipo de datos en la ventana de comandos de MATLAB, seleccione la carpeta de condiciones que desea ver en la ventana buscar carpetas y seleccione. Bien.

La ventana de búsqueda de carpetas se cerrará temporalmente y se volverá a abrir, lo que permitirá seleccionar condiciones adicionales. Una vez seleccionadas las condiciones, seleccione Cancelar para salir del proceso de selección. El resultado de Bonfire devolverá gráficos de resumen, incluidos los datos de las carpetas de condiciones seleccionadas para exportar los datos morfológicos a Excel, tipo bonfire Export en la ventana de comandos de MATLAB.

Seleccione la carpeta de condiciones que contiene los datos que desea exportar en la ventana de búsqueda de carpetas y seleccione. Bien, la exportación de hogueras creará archivos de Excel de los datos morfológicos y los colocará en la carpeta de condiciones que se seleccionó. Ahora te mostraremos un ejemplo de los datos generados por el programa de hogueras en un conjunto de datos que contiene dos condiciones.

Estos son ejemplos de imágenes invertidas de ambas condiciones. Se puede ver en estas imágenes que la condición uno contiene más dendritas que la condición dos. Este fenómeno también se puede observar en una variedad de gráficos que son generados por el programa de la hoguera.

Debido a que el programa de hogueras realiza su análisis en subregiones de las dendritas, el aumento de dendritas en la condición uno se puede identificar fácilmente, el trazado de la curva de cardúmenes del árbol dendrítico total muestra que hay más dendritas distales al cuerpo celular para las neuronas de la condición uno, el trazado del número promedio de puntos de ramificación y puntos terminales por célula muestra que la condición uno contiene más puntos de rama y más puntos terminales que la condición dos. Se muestra el número promedio de procesos por celda para dendritas primarias, secundarias, terciarias o de orden superior. Hay más dendritas terciarias y de orden superior para la condición uno, el trazado del número promedio de procesos por celda para las dendritas raíz, intermedias y terminales muestra que la condición uno tiene más procesos intermedios o terminales que la condición dos.

Aquí se muestran las curvas de análisis de bancos específicos de identidad de segmentos en las que los segmentos se agrupan como primarios, secundarios o terciarios o mayores. El aumento de las dendritas terciarias se produce distal al cuerpo celular para las neuronas de la condición uno. Se muestran las curvas de análisis de bajío específicas de identidad de segmento en las que los segmentos se agrupan como segmentos raíz, segmentos intermedios o segmentos terminales.

El aumento de las dendritas intermedias y terminales en la condición uno ocurre distal al cuerpo celular. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar el análisis de bancos utilizando el programa de hogueras para observar los cambios locales en la morfología neurológica.