Name: Medición de la corriente bioeléctrica con una sonda vibrante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Aprende a fabricar y calibrar sondas vibrantes no invasivas para medir corrientes bioeléctricas en sistemas biológicos con alta sensibilidad. Esta técnica avanza la investigación médica sobre cicatrización de heridas.

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Estamos muy agradecidos con el profesor Richard Borgens, Centro de Investigación de la Parálisis, la Universidad de Purdue, en busca de ayuda en el montaje del sistema de sonda vibrante. Este estudio fue apoyado por NEI subvención del NIH 1R01EY019101 a MZ y BR, y en parte por subvenciones del Instituto de California de Medicina Regenerativa de RB1-01417, NSF MCB-0951199, y por una subvención sin restricciones de Investigación para Prevención de la Ceguera, UC Davis Oftalmología.

<ol><li>Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+measurement+of+bioelectric+currents+with+a+vibrating+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe.</a> Nat. Protoc. 2, 661-9282 (2007).</li>
<li>Reid, B., Song, B., McCaig, C. D., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+in+rat+cornea%3A+the+role+of+electric+currents%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Wound healing in rat cornea: the role of electric currents.</a> FASEB J. 19, 379-386 (2005).</li>
<li>Lois, N., Reid, B., Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+currents+and+lens+regeneration+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Electric currents and lens regeneration in the rat.</a> Exp. Eye Res. 90, 316-323 (2010).</li>
<li>Wang, E., Reid, B., Lois, N., Forrester, J. V., McCaig, C. D., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+inhibition+of+lens+epithelial+cell+proliferation%3A+an+additional+factor+in+secondary+cataract%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Electrical inhibition of lens epithelial cell proliferation: an additional factor in secondary cataract.</a> FASEB J. 19, 842-844 (2005).</li>
<li>Guo, A., Song, B., Reid, B., Gu, Y., Forrester, J. V., Jahoda, C., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+physiological+electric+fields+on+migration+of+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Derm%22%5BJournal%5D)">Effects of physiological electric fields on migration of human dermal fibroblasts.</a> J. Invest. Derm. , (2010).</li>
<li>Reid, B., Song, B., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+currents+in+Xenopus+tadpole+tail+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electric currents in Xenopus tadpole tail regeneration.</a> Dev. Biol. 335, 198-207 (2009).</li>
<li>Zhao, M., Song, B., Pu, J., Wada, T., Reid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+signals+control+wound+healing+through+phosphatidylinositol-3-OH+kinase-%CE%B3%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-γ.</a> 442, 457-460 (2006).</li>
<li>Reid, B., EO, G. raue-H. ernandez, Mannis, M. J., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+endogenous+electric+currents+in+human+corneal+wounds+-+a+novel+approach+of+bioelectric+stimulation+without+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Modulating endogenous electric currents in human corneal wounds - a novel approach of bioelectric stimulation without electrodes.</a> Cornea. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultrasensitive+vibrating+probe+for+measuring+steady+extracellular+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents.</a> J. Cell Biol. 63, 614-628 (1974).</li>
<li>Hotary, K. B., Nuccitelli, R., Robinson, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computerized+2-dimensional+vibrating+probe+for+mapping+extracellular+current+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">A computerized 2-dimensional vibrating probe for mapping extracellular current patterns.</a> J. Neurosci. Meth. 43, 55-67 (1992).</li>
<li>Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+ion+currents+and+DC+electric+fields+in+multicellular+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectromagnetics+Supplement%22%5BJournal%5D)">Endogenous ion currents and DC electric fields in multicellular animal tissues.</a> Bioelectromagnetics Supplement. 1, 147-157 (1992).</li>
<li>Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioelectric+mechanisms+in+regeneration%3A+Unique+aspects+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bioelectric mechanisms in regeneration: Unique aspects and future perspectives.</a> Seminars in Cell Dev. Biol. 20, 543-556 (2009).</li>
<li>Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+fields+in+wound+healing+-+An+overriding+signal+that+directs+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electric fields in wound healing - An overriding signal that directs cell migration.</a> Seminars in Cell Dev. Biol. 20, 674-682 (2009).</li>
</ol>

Se describe un bajo costo, básico, pero muy sensible sistema de vibración de la sonda para medir de forma no invasiva la corriente eléctrica en una variedad de sistemas biológicos. Posibles Modificaciones <ol><li> Si platino / iridio electrodos (Instrumentos del Mundo de precisión, cat # PTM23B20) se utilizan en lugar de acero inoxidable, entonces la etapa de recubrimiento de oro puede ser eliminado. </li></ol> Aplicaciones Hemos utilizado l...

<table><tbody><tr><td>Electrodo de acero inoxidable Eligoy</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SSM33A70</td><td>76 mm, 7 M&amp;#937;, punta de 1-2&amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>Conector dorado R30</td><td>www.vectorelect.com</td><td>R30</td><td>Reutilizable</td></tr><tr><td>Epoxi cargado con plata</td><td>3M</td><td>SL65</td><td>Mezclar 1 parte de resina con 1 parte de endurecedor</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZ40</td><td>Aumento de x6 a x40</td></tr><tr><td>Dicianoaurato de potasio (KAu(CN)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379867</td><td>PRECAUCIÓN: Tóxico</td></tr><tr><td>Cloroplatinato de hidrógeno hidratado (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PtCl&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt; x 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520896</td><td>PRECAUCIÓN: Tóxico</td></tr><tr><td>Acetato de plomo(II) trihidratado (Pb(CH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; x 3H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>185191</td><td>PRECAUCIÓN: Tóxico</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación de nanoamperios</td><td>Hecho en casa</td><td>-</td><td>Alimentado por seis pilas de 1,5 V (AAA)</td></tr><tr><td>Microposicionador tridimensional</td><td>Line Tool Co.</td><td>Modelo H</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de bloqueo</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR530</td><td></td></tr><tr><td>Interfaz digital de entrada/salida</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6220</td><td></td></tr><tr><td>Bloque de conexión blindado con conexiones BNC</td><td>National Instruments</td><td>BNC-2110</td><td></td></tr><tr><td>Software de Electrofisiología Strathclyde</td><td>Instituto de Farmacia y Ciencias Biomédicas de la Universidad de Strathclyde, Reino Unido</td><td>WinWCP V4.1.5</td><td>Descarga gratuita desde: &lt;a href=&quot;http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm">http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Cámara de calibración</td><td>Hecho en casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calibrador de corriente constante</td><td>Vibrating Probe Company</td><td></td><td>Alimentado por una batería de 9 V (PP3)</td></tr></tbody></table>

medición de la corriente bioeléctrica con una sonda vibrante

Measurement of Bioelectric Current with a Vibrating Probe

Los campos eléctricos generados por el transporte activo de iones, están presentes en muchos sistemas biológicos y, a menudo tienen funciones importantes en los tejidos y órganos. Por ejemplo, desempeñan un papel importante en la dirección de la migración celular durante la cicatrización de heridas. A continuación se describe la fabricación y el uso de sondas ultrasensibles para medir la vibración extracelular corrientes eléctricas. La sonda es un cable aislado, afilado de metal con una pequeña punta de platino, negro (30-35 micras), que puede detectar las corrientes iónicas en el mA / cm 2 rango en solución salina fisiológica. La sonda se hace vibrar a cerca de 200 Hz por un doblador piezoeléctricos. En presencia de una corriente iónica, la sonda detecta una diferencia de voltaje entre los extremos de su movimiento. Un bloqueo de los filtros amplificador de los ruidos extraños por el bloqueo en la frecuencia de la sonda de vibración. Los datos se registran en el ordenador. La sonda está calibrada al inicio y al final de los experimentos en solución salina adecuada, utilizando una cámara que se aplica una corriente de 1,5 mA exactamente / cm 2. Se describe cómo hacer que las sondas, configurar el sistema y calibrar. También demuestran la técnica de medición de la córnea, y se muestran algunos resultados representativos de diferentes muestras (córnea, piel, cerebro).

La fabricación, la calibración y el uso de sondas no invasivas para medir la corriente vibratoria bioeléctrica en diversos sistemas biológicos se describe.

Medición de la corriente bioeléctrica con una sonda vibrante

Los campos eléctricos, generados por el transporte activo de iones, están presentes en muchos sistemas biológicos y a menudo cumplen funciones importantes en los tejidos y órganos. ...

Este video demuestra un procedimiento para crear y utilizar sondas vibratorias empleadas para medir corrientes bioeléctricas en muestras biológicas. Primero, se fabrican sondas tomando sondas de acero inoxidable sin tratar y electrodepositando sus puntas con oro. Luego, se determinan parámetros de la sonda de platino, como la frecuencia y el ángulo de fase, y se calibra la sonda.Luego se pueden tomar mediciones a partir de la muestra de interés, obteniendo datos que revelan el carácter de las corrientes bioeléctricas generadas por la muestra biológica y que fluyen a su alrededor. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que es no invasiva, altamente sensible y tiene una alta relación señal-ruido. Este método puede responder preguntas clave en el campo médico, como cómo los campos eléctricos en las heridas estimulan a las células para promover la cicatrización.Para comenzar el proceso de fabricación de sondas vibrantes para medir corrientes bioeléctricas, se adquieren sondas en blanco de World Precision Instruments. Primero, corte la sonda a 25-30 milímetros detrás de la punta y utilice un escalpelo número 11 para raspar aproximadamente cinco milímetros del aislamiento de paralina en el extremo cortado, a fin de garantizar una buena conexión. A continuación, utilizando un epoxi cargado con plata conductor eléctricamente, monte la sonda en un conector de oro R 30.Guarde la sonda durante la noche a temperatura ambiente para permitir que el epoxi se endurezca al día siguiente. Plaque la punta de la sonda con oro y luego con platino. Para ello, en primer lugar, enjuague la punta de la sonda en acetona y conéctela a la salida negativa de una fuente de alimentación de nanoamperios.Ahora coloque la sonda bajo un microscopio estereoscópico y colóquela en una solución de plateado de oro. Un cable de referencia conectado a la salida positiva y colocado en la solución completa el circuito. Aplique una corriente de cinco nanoamperios durante cinco minutos, luego aumente la corriente a 20 nanoamperios hasta que la punta tenga aproximadamente la mitad del tamaño final deseado.Ahora, enjuague la punta de la sonda con agua destilada y luego colóquela en la solución de pulido. Aplique una corriente de 250 nanoamperios durante cinco minutos, luego aumente la corriente a 500 nanoamperios hasta que la punta alcance aproximadamente el 80 % del tamaño final deseado. Aumente la corriente a un microamperio y aplique la corriente en impulsos de un segundo hasta obtener un diámetro final de la punta de entre 30 y 35 micrómetros.Finalmente, enjuague la punta y los sondas de agua destilada pueden almacenarse a temperatura ambiente indefinidamente. Ahora veamos el sistema de sonda una vez fabricado, conecte la sonda a un doblador eléctrico de piso. Montado en una sonda posicionadora micro tridimensional.La vibración está controlada por la fuente de alimentación del sensor vibratorio, que también permite ajustar la vibración, la amplitud y la frecuencia. La fuente de alimentación envía una señal de referencia al amplificador de detección síncrona, el cual también muestra la frecuencia de vibración y el ángulo de fase. El amplificador está conectado a una computadora mediante una interfaz analógica digital.Los datos se registran utilizando la configuración del programa de célula completa del software de electropatología Strat Clyde para el amplificador de bloqueo; la información sobre el software de electropatología puede encontrarse en la parte escrita de este protocolo. Ahora veamos cómo configurar la nueva sonda. Las nuevas sondas deben ser probadas y se debe determinar su frecuencia y ángulo de fase únicos para hacerlo.Coloque la nueva sonda y los cables de referencia y tierra en la cámara de calibración que contiene solución salina fisiológica. Encienda la fuente de alimentación y aumente la frecuencia hasta observar la máxima vibración. Esta es la frecuencia resonante de la sonda.El uso de la sonda a esta frecuencia resonante puede provocar inestabilidad y ruido en la grabación. Por lo tanto, la sonda se desafina restando 10 hercios para obtener la frecuencia de trabajo de la sonda. Ajuste la amplitud de la vibración de modo que la distancia de vibración de la sonda sea igual al diámetro de la punta.De este modo, cuando se vibra la sonda, se observa una imagen doble de la punta de la sonda. Para determinar el ángulo de fase, coloque la sonda en solución salina dentro de la cámara de calibración y aplique una corriente de 1,5 microamperios por centímetro cuadrado. Ajuste repetidamente el ángulo de fase en el amplificador de bloqueo hasta que no haya respuesta.Añadir o restar 90 grados proporciona la respuesta máxima, y este ángulo es el ángulo de fase de trabajo de la sonda. Durante un experimento, es importante que no se modifiquen estos ajustes de frecuencia, fase, ángulo y amplitud, ya que esto afectará la respuesta de la sonda. Cómodamente, la corriente que fluye de sur a norte producirá una desviación hacia arriba.Mientras que la corriente que fluye de norte a sur debería mostrar una deflexión hacia abajo. La respuesta de la sonda frente a una corriente estandarizada de exactamente 1,5 microamperios por centímetro cuadrado aplicada a la sonda en una cámara de calibración se utiliza para calcular la corriente en la muestra antes de la medición de la muestra, calibrar la sonda en una solución adecuada y luego calibrar la sonda al final del experimento en la solución utilizada para compensar el cambio de osmolaridad debido a la evaporación. Al analizar los datos, las mediciones de la primera mitad del experimento pueden calcularse utilizando los valores iniciales de calibración y las mediciones de la segunda mitad, calculadas utilizando la calibración final.Al medir muestras, se utiliza una cámara diseñada para sostener y movilizar la muestra. Por ejemplo, se utilizan placas de Petri con lazos de alambre para sostener ojos en mediciones de la córnea. Para medir una muestra, coloque la placa que contiene solución salina fisiológica bajo el microscopio estereoscópico y posicione el área de interés de la muestra dentro del campo de visión.Luego coloque la sonda en la solución orientada paralelamente a la superficie de la muestra y enfocada, de modo que quede al mismo nivel que el punto de la muestra que se va a medir. Mueva la sonda aproximadamente un centímetro lejos de la muestra y active la vibración mientras graba con el software del ordenador para establecer una línea base estable. A continuación, mueva la sonda a la posición de medición, a unos 50 micrómetros de la superficie.Cuando el nuevo valor máximo sea estable, mueva la sonda de regreso a la posición de referencia y el trazo volverá a la línea base. Esto puede repetirse en intervalos de tiempo regulares para generar datos lapse de tiempo o se puede mover ligeramente la muestra y realizar mediciones en diferentes posiciones. A continuación se mostrarán algunos resultados representativos de los datos de mapeo espacial de corriente por TE.Este perfil actual de una herida corneal muestra flujos de corriente máximos en el borde de la herida. Los datos de lapsos de tiempo muestran el curso temporal del cambio de corriente en la herida cutánea. El punto rojo muestra la corriente antes de la lesión y después de la lesión.Existe una corriente entrante transitoria que luego se invierte para convertirse en una corriente saliente; mediciones del cerebro de rata muestran corrientes salientes en el bulbo olfatorio y corrientes entrantes en el ventrículo lateral. Aquí se muestra la cartografía espacial de la corriente en una herida corneal tras seguir este procedimiento. Otros métodos, como microelectrodos selectivos, pueden utilizarse para responder preguntas adicionales, como qué ES son responsables de transportar la corriente eléctrica tras su desarrollo.Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación médica estudiaran la cicatrización de heridas, el desarrollo embrionario y la lesión de la médula espinal.

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Research

Investigación

JoVE Journal

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