Western Blot: Preparación de muestras para la detección
14 de octubre de 2010
Western Blot es una técnica analítica para detectar proteínas específicas en una determinada muestra de tejido homogeneizado o extracto.
El objetivo general de este procedimiento es demostrar la facilidad de realizar un Western blot cuando se utilizan productos adecuados. Después de la preparación de la muestra, las proteínas se separan en función del tamaño y luego se transfieren a una fase sólida. A continuación, las proteínas se prueban con anticuerpos y se detectan, el uso de protocolos adecuados y reactivos rentables de alta calidad producen resultados mejorados de Western blot.
Hola, soy Jesse Luhan, científico de investigación y desarrollo en EMD Chemicals en San Diego, California. EMD es una filial de Merck, KGAA en Dharmstat, Alemania. Hoy te vamos a mostrar un procedimiento de Western Blotting.
Así que comencemos. El primer paso en el Western blot es la preparación de la muestra. Comience la preparación de la muestra granulando las células mediante centrifugación a baja velocidad, como cinco minutos a 2.500 veces la gravedad.
Después de la centrifugación, drene los gránulos de celda. Bueno, vuelva a suspender las células en el reactivo de extracción de proteínas cyto buster usando 150 microlitros por 10 a las seis celdas. Incubar la muestra a temperatura ambiente durante cinco minutos.
A continuación, haga girar la muestra durante cinco minutos a 16.000 veces la gravedad a cuatro grados centígrados después de la centrifugación. Transfiera el SNA aclarado a un tubo nuevo y proceda con el análisis. Después de evaluar la concentración de proteína de la muestra, prepare la muestra para cargar el gel para desnaturalizar la proteína.
Utilice un tampón de muestra que contenga un detergente desnaturalizante ónico, como el sulfato de sodio o el SDS. Hervir la mezcla a 95 a 100 grados centígrados durante cinco minutos. Utilizando un gel prefabricado disponible en el mercado, las proteínas se pueden separar rápidamente en función del peso molecular.
Llene la unidad de electroforesis con tampón de funcionamiento, que se puede fabricar a partir de reactivos ofrecidos a través de la línea química Omni PU. Cargue el primer carril del pozo con el marcador de proteínas de mezcla de frutos secos. Este marcador tiene tres bandas de referencia que permiten el seguimiento durante la electroforesis.
Una vez que se tiñe el gel, se ven 10 bandas, que van desde los 10 hasta los 225 kilos de Daltons. Cargue la muestra desnaturalizada en los pocillos restantes. Haga funcionar el gel a 220 voltios durante una hora.
Una vez que las proteínas se hayan separado, tiña el gel con azul kumasi para asegurarte de que las proteínas hayan migrado de manera uniforme y uniforme utilizando tinción rápida y tinción ultrasensible, que está lista para usar sin DS. La tinción es necesaria al igual que las proteínas con una carga eléctrica pueden ser inducidas a viajar a través de un gel en un campo eléctrico, por lo que las proteínas pueden ser transferidas en un campo eléctrico desde el gel a una membrana como la NITROCELULOSA o el PVDF. Cuando utilice membranas de PVDF, remoje la membrana en metanol durante unos minutos, seguido de un equilibrio en un tampón de transferencia helado durante cinco minutos. Además, remoje el gel durante unos minutos en un tampón de transferencia helado E el equilibrio evita la contracción del gel durante la transferencia.
Para una transferencia húmeda, ensamble un sándwich del gel y la membrana entre la esponja y el papel. A continuación, sujete firmemente el conjunto después de asegurarse de que no se hayan formado burbujas de aire entre el gel y la membrana. Sumerja el sándwich en un tampón de transferencia y aplique un campo eléctrico.
Las proteínas cargadas negativamente viajarán hacia el electrodo cargado positivamente. Luego, la membrana los detiene, los une y evita que continúen. Una vez completada la transferencia, visualice las proteínas para garantizar una transferencia uniforme sin bolsas de aire.
Esto se puede hacer fácilmente con la tinción de Western blot de alerta roja. Este tinte está listo para usar y el desmanchado se puede hacer fácilmente con agua. Este es el gel una vez que se ha teñido lavándolo con agua antes de que se pueda probar la membrana con anticuerpos, la membrana se bloquea.
Para evitar la unión inespecífica, bloquee la membrana con reactivos bloqueantes de alta calidad. Para evitar un aumento del fondo incubándola en una solución de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente bajo una agitación suave, luego lave la membrana tres veces en TBST o PBST después de la incubación. Estos tampones se pueden fabricar de forma fácil y cómoda utilizando las tabletas TBS para preadolescentes y las tabletas para preadolescentes PBS, respectivamente.
Una vez que la membrana ha sido bloqueada y lavada, puede ser incubada con el anticuerpo primario. Aplique el anticuerpo primario usando una solución, una de refuerzo de señal, que permite que la señal mejore significativamente. Prepare el anticuerpo primario en la solución uno e incube la membrana durante una hora.
No es necesario añadir más agentes bloqueantes después de la incubación. Lave la membrana con TBST. A continuación, incube la membrana con el anticuerpo secundario diluido en la solución dos de impulso de señal durante una hora.
Por último, vuelva a lavar la membrana varias veces con TBST para HRP conjugado. En este caso, se utiliza tradicionalmente la detección de anticuerpos secundarios mediante quimioluminiscencia mejorada o ECL. Se utiliza el paso rápido del reactivo ECL, ya que no requiere mezcla de luminol o potenciador.
Basta con rociar la membrana unas cuantas veces, incubar durante dos minutos y revelarla con una película de rayos X. Rapid Step ofrece una baja sensibilidad a los picogramos, así como una misión más ligera hasta dos horas después de la adición del sustrato. Los marcadores de proteínas de mezcla de frutos secos permiten el seguimiento de proteínas durante la electroforesis en comparación con los protocolos estándar de Western blot.
Signal Boost permite un mayor rango dinámico y sensibilidad. Por último, se puede obtener una sensibilidad superior mediante el uso de reactivos de paso rápido en lugar de los reactivos ECL tradicionales. Acabamos de mostrarle cómo realizar el cegamiento occidental de manera eficiente y rentable con una amplia gama de productos.
Recuerde que la calidad de sus resultados depende de la calidad de sus reactivos. Eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.
Resumen
Este artículo demuestra la técnica de inmunotransferencia, un método esencial para detectar proteínas específicas en muestras de tejido. El procedimiento destaca la importancia de utilizar reactivos de alta calidad y protocolos adecuados para obtener resultados óptimos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Bioquímica
- Análisis de proteínas
- Técnicas analíticas
Antecedentes
- La transferencia Western es una técnica analítica ampliamente utilizada.
- Permite la detección y cuantificación de proteínas específicas.
- La técnica comprende varios pasos, incluyendo la preparación de muestras, electroforesis en gel y transferencia a una membrana.
- Los reactivos y protocolos adecuados son cruciales para obtener resultados exitosos.
Objetivo del estudio
- Demostrar el procedimiento de inmunotransferencia (Western blotting).
- Enfatizar la importancia de la calidad de los reactivos para obtener resultados confiables.
- Proporcionar una guía paso a paso para investigadores.
Métodos Utilizados
- Preparación de muestras mediante centrifugación y reactivos de extracción de proteínas.
- Desnaturalización de proteínas con SDS y carga en un gel.
- Electroforesis para separar proteínas según su peso molecular.
- Transferencia de proteínas a una membrana seguida de detección con anticuerpos.
Resultados principales
- Se logró una separación y transferencia exitosas de proteínas.
- Se demostraron eficazmente los pasos de bloqueo y sondado.
- Se observó una sensibilidad de detección mejorada mediante el uso de reactivos específicos.
- Se obtuvo una visualización clara de las proteínas utilizando métodos de detección por ECL.
Conclusiones
- La transferencia Western puede realizarse de manera eficiente con los protocolos adecuados.
- La calidad de los reactivos afecta significativamente los resultados.
- Esta técnica sigue siendo una herramienta fundamental en el análisis de proteínas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La transferencia Western es un método fundamental de detección de proteínas que sustenta la validación de dianas y los estudios mecanicistas en la investigación y desarrollo biofarmacéutico&Sus resultados cuantitativos y la especificidad basada en anticuerpos permiten una evaluación confiable de la expresión proteica, la modulación de vías y la presencia de biomarcadores en flujos de trabajo de descubrimiento y preclínicos. Un inmunotransferencia fiable respalda la toma de decisiones predictiva y el avance de carteras ajustado al riesgo.
Aplicaciones Estratégicas en Biofármacos R&D
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de dianas proteicas y componentes de vías en muestras biológicas.
- Apoya la validación funcional de dianas candidatas mediante la detección cuantitativa de proteínas.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas al confirmar la modulación de los puntos finales moleculares previstos.
- Proporciona evidencia reproducible de la interacción con la diana y la especificidad de la vía.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Proporciona sistemas validados de detección de proteínas para cribado posterior y evaluación de compuestos.
- Permite la estandarización y reproducibilidad de ensayos mediante protocolos y controles definidos.
- Apoya la medición cuantitativa de la abundancia proteica para análisis comparativos.
- Prepara plataformas robustas para cribado escalable e integración de datos entre estudios.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea la detección de proteínas con biomarcadores relevantes para la enfermedad, garantizando continuidad traslacional.
- Conecta los hallazgos del descubrimiento con la validación preclínica al confirmar la modulación proteica en modelos pertinentes.
- Apoya el avance ajustado al riesgo al proporcionar datos cuantitativos y reproducibles sobre proteínas.
- Permite obtener información mecanicista sobre los efectos de los compuestos y las vías biológicas.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El inmunoblot o western blot integra desde el descubrimiento inicial hasta la identificación de fármacos candidatos y la validación preclínica, proporcionando una capacidad analítica reutilizable a lo largo del R&D continuo.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al cuantificar dianas proteicas y efectores descendentes.
- Selección: Proporciona detección de proteínas lista para ensayos y reproducible para la evaluación de compuestos y la confirmación de resultados positivos.
- Análisis: Ofrece lecturas cuantitativas y confirmación del peso molecular para análisis comparativos entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Alinea la detección de proteínas con modelos de enfermedades y estrategias de biomarcadores cuando el flujo de trabajo lo permite.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma estandarizada y escalable para el análisis de proteínas en múltiples programas y equipos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Permite flujos de trabajo estandarizados, reproducibles y escalables para la detección de proteínas.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al proporcionar datos robustos sobre proteínas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de activos en descubrimiento y preclínicos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la extracción de proteínas, electroforesis y detección basada en anticuerpos.
- Necesita acceso a equipos de electroforesis, transferencia e imagen quimioluminiscente.
- Exige la estandarización entre equipos de protocolos, reactivos y controles para garantizar la reproducibilidad.
- Puede requerir la adaptación de protocolos para diferentes tipos de muestras o sistemas modelo.
- Depende de la especificidad de los anticuerpos y de la calidad de los reactivos para obtener resultados óptimos.
