Name: Western Blot: Preparación de muestras para la detección (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-14T17:27:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Aprende la técnica de Western blot para detectar proteínas específicas en muestras tisulares mediante electroforesis y transferencia a membrana. Este método optimiza resultados con reactivos de alta calidad.

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1. Preparación de la muestra El primer paso en el Western Blot es la preparación de muestras. Para preparar las muestras para el funcionamiento de un gel de células y tejidos deben ser zadas para liberar las proteínas de interés. <ul><li> Un práctico, listo para el uso de reactivos que es versátil y fácil de usar para la extracción de proteína soluble es CytoBuster o PhosphoSafe. Estos topes de extracción contienen detergentes optimizó para la extracción eficaz de las proteínas solubles de las células de mamíferos e insectos. La suave y no iónicos composición del Reactivo CytoBuster extracción de la proteína permite el aislamiento de la endógena funcionalmente activas o proteínas que se expresan sin necesidad de tratamiento secundario, tales como ultrasonidos o de congelación / descongelación. PhoshoSafe tiene el beneficio añadido de que contiene cuatro inhibidores de la fosfatasa. <ol><li> Precipitar las células por centrifugación a baja velocidad (por ejemplo, 5 minutos a 2500 xg), drenar el sedimento celular también. </li><li> Resuspender las células en el reactivo CytoBuster extracción de proteínas utilizando 150 l por cada 10 6 células (cantidad óptima de reactivo CytoBuster extracción de la proteína puede variar según el tamaño de la celda). </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Transferir a un tubo adecuado y vuelta durante 5 minutos a 16.000 xga 4 ° C. </li><li> Transferencia despejado sobrenadante (extracto de células) a un tubo nuevo y proceder a su análisis. </li></ol></li><li> Para la extracción de proteínas especializadas, se recomienda utilizar nuestros productos de alta calidad Kits ProteoExtract. EMD tiene más de una docena de kits para el aislamiento de las mitocondrias, la extracción de proteoma subcelular, la extracción de la proteína transmembrana, y muchos otros. Por favor, visite nuestra página de Western blot de aterrizaje para más detalles. </li><li> EMD también vende una amplia variedad de juegos de la proteasa y fosfatasa inhibidor de cóctel. Tan pronto como se produce la lisis, la proteolisis, desfosforilación y la desnaturalización de comenzar. Estos eventos se puede ralentizar enormemente si las muestras se mantienen en hielo oa 4 ° C en todo momento y los inhibidores adecuados se agregan a la nueva solución amortiguadora de lisis. Por favor, visite nuestra página de Western blot de aterrizaje para más detalles. </li></ul> 2. SDS-PAGE El segundo paso en el Western Blot es la separación de proteínas. Las proteínas se separan en función del peso molecular. <ul><li> Usted puede hacer su gel propia página, sin embargo, va a utilizar un comercial prefabricado gel. <ol><li> Después de preparar la muestra, usted está listo para determinar la concentración de proteínas. EMD tiene dos juegos para esta medición de la concentración, uno es el kit de proteínas sin interferencia de ensayo y el otro es el BCA Protein Kit de ensayo. </li><li> Una vez que la concentración de proteína se determina que estamos listos para preparar la muestra para la carga del gel. Los anticuerpos suelen reconocer una pequeña porción de la proteína de interés (en adelante, el epítopo) y este dominio pueden residir dentro de la conformación 3D de la proteína. Para habilitar el acceso de los anticuerpos a esta parte es necesario para desplegar la proteína. </li><li> Para desnaturalizar, use un tampón de carga con los aniónicos sulfato de sodio dodecil detergente desnaturalizante (SDS), y hervir la mezcla a 95-100 º C durante 5 minutos. Un tampón de carga fácil y cómodo de usar es la muestra de amortiguación 4X. </li></ol></li><li> Cargue el primer carril del pozo con marcador de proteína Trail Mix. Este marcador tiene tres bandas de referencia que le permiten controlar la electroforesis. Cuando el gel se tiñe, 10 bandas son visibles que van desde 10 hasta 225 kDa. </li><li> Llene la unidad de electroforesis con el correr de amortiguación. Por PAGE, esto es por lo general 1X Tris-glicina. Para recetas de amortiguación más detallada, visite la página de Western Blot. EMD ofrece una alta calidad de los reactivos tampones con nuestra línea de productos químicos OmniPur. Correr el gel a 220V durante 1 hora. </li><li> Una vez que las proteínas se han separado, tinción del gel con azul de Coomassie para asegurar que las proteínas han emigrado de manera uniforme y uniformemente. RAPIDstain es una mancha de ultra-sensible, que está listo para usar. No es necesario decolorar. </li></ul> 3. La proteína de transferencia Al igual que las proteínas con una carga eléctrica puede ser inducida a viajar a través de un gel en un campo eléctrico, por lo que las proteínas pueden ser transferidos de un campo eléctrico a partir del gel a una membrana, ya sean PVDF o nitrocelulosa. <ul><li> Hoy vamos a hacer una transferencia de humedad. En la transferencia de humedad, el gel y la membrana se intercala entre la esponja y papel (esponja / papel / gel / membrana / papel / esponja) y todos están apretados juntos después de que garantiza que no se han formado burbujas de aire entre el gel y la membrana. El sándwich se sumerge en tampón de transferencia al que se aplica un campo eléctrico. Las proteínas con carga negativa de viaje hacia el electrodo con carga positiva, pero la membrana se lo impide, se une a ellos, y les impide continuar. </li><li> Dos tipos de membranas disponibles: nitrocelulosa y PVDF. Ambos trabajan bien. Hoy vamos a estar utilizando PVDF. Membranas de PVDF requieren remojo en methanol durante unos minutos, seguida de transferencia de buffer fría durante 5 minutos. El gel también tiene que equilibrar durante unos minutos en tampón de transferencia helada. No hacerlo puede reducir el tamaño del gel durante la transferencia. </li><li> El buffer para la transferencia de humedad es 1X Tris-glicina con un 20% de metanol. Preparación detallada de búfer están disponibles en nuestro sitio web. </li><li> Una vez que se complete la transferencia, es una buena idea para visualizar las proteínas para asegurar una transferencia sin bolsas de aire. Esto se puede hacer fácilmente con RedAlert Western Blot manchas. Esta mancha está listo para su uso y la decoloración se puede hacer fácilmente con agua. </li></ul> 4. Anticuerpos y reactivos de accesorios <ul><li> El primer paso para hacer de sondeo y de anticuerpos contra el antígeno es bloquear la membrana. El bloqueo de la membrana impide la unión no específica de fondo. </li><li> Ya sea de leche sin grasa o BSA se puede utilizar como una solución de bloqueo. Sin embargo, cuando se utiliza fosfato anticuerpos específicos, no se recomienda el uso de la leche, ya que será causa de fondo de alta. </li><li> EMD ofrece varios reactivos de alta calidad de bloqueo, incluyendo SeaBlock, que es un agente de animales no mamíferos bloqueo y QuickBlocker BLOT, que es preparado, listo para usar agente de bloqueo. También contamos con alta calidad de BSA (fracción V) disponibles. <ol><li> Incubar la membrana de 1 hora a temperatura ambiente bajo agitación suave. </li><li> Lavar tres veces en PBST TBST o después de la incubación. Una manera fácil y conveniente de hacer TBST o PBST es utilizar nuestro tabletas (comprimidos PBS Tween / tabletas ENTRE TBS) </li></ol></li><li> Una vez que la membrana ha sido bloqueado, usted está listo para la incubación con el anticuerpo primario. EMD ha estado ofreciendo una amplia cartera de anticuerpos excepcional con la mejor garantía de anticuerpos en la industria por más de 30 años. Recuerde que con todos los anticuerpos EMD, ofrecemos un 100% sin riesgo de garantía. Compra de un anticuerpo y lo utilizan para cualquier especificidad de especie o de la aplicación que desee. Si el anticuerpo no funciona a su satisfacción, le daremos un crédito completo para ser utilizado en cualquier otro producto. Para más detalles, por favor visite nuestra página de Western blot web. <ol><li> Hoy vamos a estar incubando el anticuerpo primario utilizando nuestra solución al 1 de SignalBoost. SignalBoost es un gran producto que permite la señal para ser mejorada de manera significativa. Simplemente incubar su anticuerpo primario en la Solución 1 y se incuba durante 1 hora o como lo haría normalmente. No hay necesidad de agregar más agentes de bloqueo. Alternativamente, puede utilizar BSA o leche descremada en polvo como un agente de bloqueo. </li><li> Lavar con TBST. Hacemos TBST utilizando la lista a disolver la tableta TBST. </li><li> Incubar el anticuerpo secundario utilizando la solución de dos de SignalBoost. Incubar con el anticuerpo secundario en tampón de bloqueo durante 1 hora. Lavar la membrana de nuevo varias veces con TBST. </li></ol></li></ul> 5. Detección HRP para conjugar anticuerpos secundarios, ECL se utiliza tradicionalmente. Un reactivo ECL excelente que ofrecemos es RapidStep. Las ventajas de RapidStep es que no hay mezcla de luminal o potenciador es necesario. Simplemente rocíe la membrana de un par de veces y desarrollar el uso de las placas radiográficas. RapidStep ofrece una sensibilidad pictograma baja, así como emisores de luz de hasta 2 horas después de la adición del substrato.

<ol><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R., R, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera%3A+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. 'W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((blotting%27%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Ambroz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+quantification+accuracy+for+Western+blots+Image+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Improving quantification accuracy for Western blots Image Analysis.</a> , (2006).</li>
<li>Quan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species-mediated+endoplasmic+reticulum+stress+and+mitochondrial+dysfunction+contribute+to+cirsimartitin-induced+apoptosis+in+human+gallbladder+carcinoma+GBC-SD+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett+Article%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to cirsimartitin-induced apoptosis in human gallbladder carcinoma GBC-SD cells.</a> Cancer Lett Article. , Forthcoming (2010).</li>
<li>O'Malley, D. ervia <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+colonic+corticotrophin-releasing+factor+receptors+in+the+maternally+separated+rat+model+of+irritable+bowel+syndrome%3A+Differential+effects+of+acute+psychological+and+physical+stressors%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Alterations in colonic corticotrophin-releasing factor receptors in the maternally separated rat model of irritable bowel syndrome: Differential effects of acute psychological and physical stressors.</a> Peptides. 31 (4), 662-670 (2010).</li>
</ol>

Los autores Anna Eslami y Luján Jesse son empleados por EMD Chemicals Inc, que produce los reactivos y los instrumentos utilizados en el presente artículo.

En este vídeo de presentación, hemos destacado los pasos más importantes en Western Blot, que son la preparación de muestras, SDS-PAGE, la membrana de bloqueo / sondeo con anticuerpos, y la detección. Para cada paso del proceso, los protocolos adecuados y reactivos adecuados se deben utilizar para lograr resultados de alta calidad.

<table><tbody><tr><td>CytoBuster&amp;#8482; Reactivo para la extracción de proteínas</td><td>EMD Millipore</td><td>71009</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PhosphoSafe&amp;#8482; Reactivo de extracción</td><td>EMD Millipore</td><td>71296</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Ensayo de proteínas no interferente&amp;#8482; Kit</td><td>EMD Millipore</td><td>488250</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas BCA </td><td>EMD Millipore</td><td>71285</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/BCA&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/BCA&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/BCA&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/BCA&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Tampón de muestra SDS 4X </td><td>EMD Millipore</td><td>70607</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Mezcla de frutos secos y frutas desecadas&amp;#8482; Marcadores proteicos</td><td>EMD Millipore</td><td>70980</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Proteína&amp;#8211;xtract&amp;#8482; Kits de extracción de proteínas</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;xtract&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;xtract&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;xtract&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;xtract&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>OmniPur&amp;#174; Productos</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/omnipur&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/omnipur&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RAPIDstain&amp;#8482; Reactivo</td><td>EMD Millipore</td><td>553215</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RedAlert&amp;#8482; Tinción para Western Blot 10X</td><td>EMD Millipore</td><td>71078</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/redalert&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/redalert&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/redalert&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/redalert&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SeaBlock&amp;#8482; Reactivo, plasma de salmón</td><td>EMD Millipore</td><td>558300</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/seablock&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/seablock&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/seablock&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/seablock&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Reactivo BLOT-QuickBlocker</td><td>EMD Millipore</td><td>WB57</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Albúmina, Suero Bovino, Fracción V</td><td>EMD Millipore</td><td>12660</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PBS-TWEEN&amp;#174; Tabletas</td><td>EMD Millipore</td><td>524653</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/PBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/PBST&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/PBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/PBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>TBS-TWEEN&amp;#174; Tabletas</td><td>EMD Millipore</td><td>524753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/TBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/TBST&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/TBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/TBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SignalBoost&amp;#8482; Kit Potenciador de Inmunoreacción</td><td>EMD Millipore</td><td>407207</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RapidStep&amp;#8482; Reactivo ECL</td><td>EMD Millipore</td><td>345818</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

western blot: preparación de muestras para la detección

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western Blot es una técnica analítica para detectar proteínas específicas en una determinada muestra de tejido homogeneizado o extracto. Se utiliza la electroforesis en gel para separar las proteínas nativas o desnaturalizadas por la longitud del polipéptido (condiciones desnaturalizantes) o por la estructura 3-D de la proteína (nativo / condiciones no desnaturalizantes). Las proteínas se transfieren a una membrana (por lo general de nitrocelulosa o PVDF), donde se sondean (detectado), utilizando anticuerpos específicos para la proteína diana.

Western Blot es una técnica analítica para detectar proteínas específicas en una determinada muestra de tejido homogeneizado o extracto.

Western Blot: Preparación de muestras para la detección

El Western blot es una técnica analítica utilizada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada de extracto o homogenado de tejido. Utiliza un gel...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la facilidad de realizar un Western blot utilizando productos adecuados. Tras la preparación de las muestras, las proteínas se separan según su tamaño y luego se transfieren a una fase sólida. Las proteínas se detectan entonces mediante el uso de anticuerpos, y la aplicación de protocolos adecuados y reactivos de alta calidad y costo-efectivos produce resultados mejorados en el Western blot.Hola, soy Jesse Luhan, científico de I+D en EMD Chemicals en San Diego, California. EMD es una filial de Merck KGaA en Darmstadt, Alemania. Hoy les mostraremos un procedimiento de inmunotransferencia (western blotting).Entonces comencemos. El primer paso en el inmunotransferencia es la preparación de la muestra. Inicie la preparación de la muestra centrifugando las células a baja velocidad, por ejemplo, cinco minutos a 2,500 ×g.Tras la centrifugación, retire los pellet celulares. Resuspenda bien las células en el reactivo de extracción de proteínas Cyto Buster utilizando 150 microlitros por cada 10⁶ células. Incube la muestra a temperatura ambiente durante cinco minutos.A continuación, centrifugue la muestra durante cinco minutos a 16.000 ×g y cuatro grados Celsius tras la centrifugación. Transfiera el SNA clarificado a un tubo nuevo y continúe con el análisis. Una vez determinada la concentración de proteína de la muestra, prepare la muestra para cargarla en el gel y desnaturalizar la proteína.Utilice un tampón de muestra que contenga un detergente desnaturalizante iónico, como el dodecil sulfato de sodio o SDS. Hierva la mezcla a 95-100 grados Celsius durante cinco minutos. Mediante un gel precolado disponible comercialmente, las proteínas pueden separarse rápidamente según su peso molecular.Llene la unidad de electroforesis con tampón de corrida, que puede prepararse a partir de reactivos ofrecidos a través de la línea química Omni PU. Cargue la primera banda del pozo con el marcador de proteínas de trail mix. Este marcador tiene tres bandas de referencia que permiten el monitoreo durante la electroforesis.Una vez que el gel está teñido, son visibles 10 bandas, que van desde 10 hasta 225 kilo Daltons. Cargue la muestra desnaturalizada en los pozos restantes. Corra el gel a 220 voltios durante una hora.Una vez que las proteínas se han separado, tiña el gel con azul de kumasi para asegurar que las proteínas hayan migrado de manera uniforme y homogénea utilizando una tinción rápida y una tinción ultrasensible, que está lista para usar; no se requiere DS.Tinción. Así como las proteínas con carga eléctrica pueden ser inducidas a moverse a través de un gel en un campo eléctrico, las proteínas pueden transferirse en un campo eléctrico desde el gel hacia una membrana como NITROCELLULOSE o PVDF. Al usar membranas de PVDF, sumerja la membrana en metanol durante unos minutos, seguido de una equilibración en tampón de transferencia frío por cinco minutos. También sumerja el gel durante unos minutos en tampón de transferencia frío; la equilibración evita la contracción del gel durante la transferencia.Para una transferencia húmeda, arme un sándwich del gel y la membrana entre esponja y papel. Luego sujete firmemente el conjunto después de asegurarse de que no se hayan formado burbujas de aire entre el gel y la membrana. Sumerja el sándwich en tampón de transferencia y aplique un campo eléctrico.Las proteínas con carga negativa migrarán hacia el electrodo con carga positiva. Luego, la membrana las detiene, se une a ellas y evita que continúen avanzando. Una vez completada la transferencia, visualice las proteínas para asegurar una transferencia uniforme y ausencia de bolsas de aire.Esto puede hacerse fácilmente con el tinte rojo para inmunotransferencia. Este tinte está listo para usar y la descoloración puede realizarse fácilmente con agua. Este es el gel una vez que ha sido descolorido mediante lavados con agua; antes de que la membrana pueda ser probada con anticuerpo, la membrana se bloquea.Para evitar la unión inespecífica, bloquee la membrana con reactivos de bloqueo de alta calidad. Para evitar un aumento del fondo, incube la membrana en solución de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente con agitación suave, luego lave la membrana tres veces en TBST o PBST tras la incubación. Estos tampones pueden prepararse fácilmente y de forma conveniente utilizando tabletas de TBS tween y tabletas de PBS tween, respectivamente.Una vez que la membrana haya sido bloqueada y lavada, puede incubarse con el anticuerpo primario. Aplique el anticuerpo primario utilizando la solución uno de señal potenciada, que permite mejorar significativamente la señal. Prepare el anticuerpo primario en la solución uno e incube la membrana durante una hora.No es necesario añadir agentes bloqueantes adicionales tras la incubación. Lave la membrana con TBST. A continuación, incube la membrana con el anticuerpo secundario diluido en la solución dos del potenciador de señal durante una hora.Finalmente, lave nuevamente la membrana varias veces con TBST para la detección de anticuerpos secundarios conjugados con HRP. Aquí se utiliza tradicionalmente la detección mediante quimioluminiscencia mejorada o ECL. Se emplea el reactivo ECL de paso rápido, ya que no requiere mezclar luminol ni potenciador.Simplemente rocíe la membrana varias veces, incube durante dos minutos y revele utilizando una película de rayos X. Rapid Step ofrece una sensibilidad de bajo picogramo, así como una emisión más ligera durante hasta dos horas después de la adición del sustrato. Los marcadores proteicos Trail mix permiten el seguimiento de las proteínas durante la electroforesis en comparación con los protocolos estándar de inmunotransferencia. Signal Boost permite un mayor rango dinámico y sensibilidad. Finalmente, se puede obtener una sensibilidad superior utilizando el paso Rápido en lugar de los reveladores ECL tradicionales. Acabamos de mostrarle cómo realizar el ensayo Western blot de manera eficiente y rentable con una amplia gama de productos.Recuerde que la calidad de sus resultados depende de la calidad de sus reactivos. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Biología

Este artículo técnico describe un estándar occidental-blot procedimiento que utiliza la electroforesis disponibles en el mercado NuPAGE Mini-Gel sistema de Invitrogen.

Western Blot utilizando el Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Inmunotransferencia (Western Blot) es un ensayo rápido y sensible para la detección y caracterización de proteínas que funciona mediante la explotación de la especificidad inherente en el reconocimiento antígeno-anticuerpo. Este video ofrece protocolos de separación de proteínas, las proteínas en las membranas de secante, immunoprobing y visualización utilizando sustratos cromogénicos o quimioluminiscencia.

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Dot Blot cuantitativo para estimar las proteínas diana en un lisado de tejidos

El video muestra una técnica de western blot basada en la normalización total de proteínas para cuantificar la expresión de la proteína objetivo en una muestra. Mediante la utilización de la tinción total de proteínas de la muestra, se realiza un análisis radiométrico para determinar el nivel de expresión relativa de la proteína objetivo.

Western Blotting cuantitativo para estimar los niveles de expresión de proteínas

Este video describe la transferencia occidental basada en quimioluminiscencia de lisados inmunoprecipitados. La técnica ayuda a determinar el procesamiento y la activación de proteínas. La señal quimioluminiscente detectada es proporcional al nivel de procesamiento de proteínas durante su activación.

Ensayo de Western Blot quimioluminiscente para el procesamiento de proteínas

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El más rápido de Occidente en la ciudad: un toque contemporáneo en el análisis clásico de Western Blot

El avance de la transferencia occidental mediante fluorescencia ha permitido la detección de cambios sutiles en la expresión de proteínas, lo que permite realizar análisis cuantitativos. Aquí describimos una metodología robusta para la detección de una variedad de proteínas en una variedad de especies y tipos de tejidos. También se proporciona una estrategia para superar problemas técnicos comunes.

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