En la inyección intraventricular Utero y electroporación de embriones de rata E16

Hola, mi nombre es William Ti. Soy del laboratorio Arnold Creek Stein. Hoy, yo y otros vamos a mostrarles la inyección intrauterina de embriones de rata E 16. Hola, mi nombre es Laura Elias.

Hoy les mostraré cómo preparar las pipetas de microinyección y cargarlas para las inyecciones intraventriculares y la electroporación que realizaremos hoy. También les mostraré cómo realizar las inyecciones intraventriculares y la electroporación en embriones de rata E16. Las inyecciones y la electroporación in utero son particularmente útiles en la rata, ya que es un sistema en el que no se pueden realizar fácilmente manipulaciones genéticas.

Vale, existen varias herramientas quirúrgicas que utilizamos para este procedimiento. Utilizamos un separador, un par de fórceps de Adson, uno con estrías y otro par con un pequeño diente en la punta. También utilizamos un par de hemostatos.

Este es un par de tijeras, y luego utilizamos estas dos grapadoras. Esta es la más grande, que usamos para ratas. Esta es la más pequeña, que usamos para ratones, utiliza una grapa tamaño siete, y esta otra utiliza una grapa tamaño nueve, y ambas están simplemente accionadas por resorte.

Algunas de las cosas que utilizamos aquí para ayudar con las cirugías incluyen una fuente de luz de fibra óptica sencilla con una cabeza doble. Utilizamos una almohadilla calefactora que simplemente circula agua tibia calentada para mantenerla caliente. Como superficie de trabajo, empleamos este sistema de electroporación selectiva fabricado por BTX.

Tenemos varios tamaños de palas que utilizamos según el tamaño de los embriones. El lado azul es el lado positivo. Muy bien, ahora vamos a biselar nuestras pipetas de inyección.

Y esto es muy importante para que su pipeta tenga una abertura lo suficientemente grande como para cargar su ADN, pero también para que sea muy, muy afilada y no dañe al embrión durante la inyección. Y si daña al embrión al inyectar, tendrá una tasa de mortalidad mucho más alta. Y eso no es bueno.

Este proceso es en realidad muy importante en esta cirugía. Primero, vamos a colocar un poco de agua sobre esta piedra de afilar que está girando aquí. Luego, tomaremos, veamos aquí, solo un, un, un palo.

Y vamos a colocar nuestra pipeta, que acabamos de preparar, sobre este soporte utilizando cinta adhesiva. Vamos a usar uno de estos micromanipuladores para sostener la pipeta por el bisel y permitir que se bisele aquí. Así que simplemente colocaremos esto y usaremos un microscopio para visualizar la punta de la pipeta.

Y simplemente lo colocaremos justo dentro del agua, encima del bisel previo, de modo que haya una ligera presión. Y puede observar cómo la punta presiona contra la piedra aquí. Permítale biselar durante cierto tiempo, al menos, digamos, 15 minutos.

Me gusta dejarlos incluso, ya sabe, durante una hora. A veces, simplemente se vuelven muy, muy afilados, pero definitivamente depende de la persona el tiempo que biselan sus pipetas. Muy bien, aquí tenemos, pueden ver en la parte superior una pipeta que ha sido estirada pero que aún no ha sido biselada.

Entonces, aunque es afilado, no tiene ninguna abertura a través de la cual podrías cargar tu ADN. Ahora, la punta inferior de la pipeta ha sido biselada, y puedes ver esta agradable abertura en ángulo. Esto te permitirá cargar tu ADN, pero aún tiene una punta afilada para que puedas inyectar sin causar daño. Muy bien, ahora vamos a llenar nuestras pipetas de inyección con ADN.

Por lo tanto, es importante que prepare su ADN de manera libre de endotoxinas para no inyectar ninguno de los lipopolisacáridos al administrar su ADN. Así que vamos a tomar nuestro ADN y, en este caso, preparar nuestro paraformo. Usted simplemente hará su paraformo aquí y querrá recolectar su ADN y colocarlo como un pequeño punto sobre este paraformo.

Luego vamos a tomar, yo normalmente tomo por cada 10 microlitros de mi ADN, que suelo usar a una concentración de aproximadamente 1,5 a 1,7 microgramos por microlitro. Utilizaré aproximadamente un microlitro de este colorante rápido. Esto simplemente nos ayuda a localizar nuestra inyección y asegurarnos de que hemos inyectado correctamente en el ventrículo.

Luego mezclaré este colorante verde rápido con mi ADN. A continuación, tome su electrodo de inyección y llenaremos la pipeta jalando hacia atrás el émbolo. Y aquí puede ver que, si la pipeta es correcta y tiene una abertura suficientemente grande, el ADN debería cargarse bastante fácilmente.

A veces es necesario mover el émbolo hacia adelante y hacia atrás para ayudar a que se cargue correctamente. Luego, puede cargar la pipeta de este modo. De este modo, tenemos el ADN completamente cargado en esta pipeta y está listo para la inyección.

Vale, voy a anestesiar al animal. Utilizamos estos conos de decapación. Simplemente doy vuelta el borde hacia atrás para facilitar su manejo.

Así que comencemos. Normalmente lo coloco simplemente en el borde de la jaula para formar un pequeño túnel por donde él pueda entrar así. Bien, este animal parece estar inactivo.

Vamos a realizar un pellizco en el dedo del pie para confirmarlo; solo necesitamos tomar el dedo y pellizcarlo con firmeza. No demasiado fuerte. No se desea lesionar al animal, pero sí asegurarse de que está inconsciente.

Y este animal está definitivamente inconsciente. Así que procederé a afeitarle el vientre. Solo quiero evitar el tétano para que no corten los extremos de los pelos.

Creo que podría ser muy doloroso para el animal. Por lo tanto, se afeita al animal. Ahora lo voy a llevar a la cabina.

Vamos a limpiarla e iniciar el procedimiento. Bien, hemos confirmado nuevamente que este animal está inconsciente y estamos listos para limpiarla primero. Lo que quiero hacer es aplicar un poco de pomada ocular, simplemente para evitar que se sequen sus ojos, en cada ojo.

Luego, lo que vamos a hacer es alternar lavados con toallitas de alcohol y toallitas de yodo. Realizamos este procedimiento tres veces, tres pasadas alternas. Debemos ser muy cuidadosos para no dañar los embriones mientras lo realizamos.

Así que desea deslizar simplemente hacia abajo, espere luego directamente hacia atrás. Este es el número uno. Primero debo mojarla bien para poder hacer las limpiezas. Bien.

Eso es dos y eso es tres. Bien, hemos colocado esta cubierta para ayudar con la esterilización y ahora voy a proceder a abrir al animal. Así que comencemos a cortar.

Muy bien, lo primero que debo hacer es colocarme el estéril. Nos colocamos guantes estériles y estamos listos para abrir aquí. Siempre queremos confirmar que el animal aún esté inconsciente.

Así que realizaré otro pellizco en el dedo del pie y realizaremos estos pellizcos durante todo el procedimiento. Normalmente, lo que hago es adelantarme y pellizcar un poco del tejido. Hago una incisión rápida, lo agarro por la parte superior y corto hacia abajo, tomo el otro par de pinzas, y mantengo el tejido separado.

Luego agarre el músculo que desee, corte justo por la línea media para no dañar ningún vaso ni nervio. Tenga cuidado de no agarrar demasiado. Así que parece que tenemos un buen rendimiento aquí.

Quiero asegurarme de mantenerlo bien lubricado para que no se deshidrate. Y haré otra comprobación rápida solo para asegurarme de que todo está bien y parece que está correcto. Siempre coloco estos para Laura, y lo que suelo hacer, o más bien lo que siempre hago, es colocar la cabeza en una posición tal que la cabeza del embrión quede del lado derecho de la rata madre, simplemente por uniformidad.

Y así comenzaré ahora. Aquí podemos ver el embrión. Podemos observar la cola y la lente posterior aquí, y la cabeza más arriba en esta zona.

Aquí estamos observando la cabeza de este embrión. Pueden ver la línea media en esta línea oscura. Pueden ver el hemisferio izquierdo y el hemisferio derecho, así como también el cerebro posterior.

Ahora voy a dirigirme al hemisferio izquierdo durante la inyección. Pipetear e inyectar, retirar un poco e inyectar el colorante. Ahora pueden ver que se está extendiendo hacia el ventrículo lateral izquierdo.

Y eso parece una inyección exitosa. Muy bien, ahora vemos que los ventrículos se han llenado adecuadamente. El colorante ha pasado en realidad del ventrículo izquierdo al derecho.

Entonces, tenemos D y ADN en ambos ventrículos. En este punto, voy a tomar mis electrodos de electroporación y colocarlos a través del cerebro, con un electrodo positivo en el lado izquierdo. De este modo, el ADN entrará en los progenitores y en la pared cortical del hemisferio izquierdo.

Ahora estoy pasando la corriente. Y cuando comenzamos a pasar la corriente eléctrica, se observa espuma en el extremo negativo del electrodo. Esto es tranquilizador y le indica que ha realizado los contactos correctos.

Vale, ahora que hemos electrocutado estos embriones, voy a proceder a colocarlos nuevamente y suturar la herida. Ahora le administraré 10 ml de antibiótico mediante sutura quirúrgica. Me gusta utilizar puntos bloqueados.

Después de eso, vamos a sujetar la piel con el grapador dérmico. ¿De acuerdo? Bien. Le he administrado una dosis de buprenorfina para asegurarme de que no sienta dolor al despertar. Ahora la colocaré en la incubadora para mantenerla caliente mientras despierta, con el fin de garantizar que no experimente hipotermia.

Vale, acabamos de mostrarle cómo realizar inyecciones intraventriculares y electroporación in utero. En la rata, se puede inyectar una serie de sustancias diferentes. Se puede inyectar simplemente un virus, incluyendo lentivirus o retrovirus, directamente en el ventrículo.

Y en este caso, no será necesario realizar la electroforesis porque el virus se integrará en las células. Si se inyectan plásmidos de ADN, como hicimos hoy, será necesario realizar la electroforesis para introducir los plásmidos en las células que recubren el ventrículo. Por lo tanto, se pueden utilizar estos vectores para diversas posibilidades.

Puede utilizarlos simplemente para seguir las células y expresar GFP, y luego puede observar cómo estos progenitores se dividen y migran. También puede usar estos vectores para manipular las células. Así, puede expresar horquillas de ARNih-S-H-R-N-A y, por lo tanto, silenciar genes específicos.

También puede sobreexpresar genes específicos, y de esta manera, puede manipular las células que ha electroporado o infectado con el virus. Esto puede ser una técnica muy poderosa para estudiar el papel de proteínas específicas en el proceso que le interesa. Y esto es especialmente importante para estudios en la rata, porque no es posible realizar manipulaciones genéticas en la rata tan fácilmente como en el ratón.