Name: Recapitulación de una curva de canal iónico IV Uso de componentes de frecuencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-08T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Aprende a caracterizar la respuesta de frecuencia de canales iónicos mediante componentes de frecuencia de 1-15 kHz en electrofisiología. Este método permite medir múltiples tipos de canales simultáneamente sin agentes farmacológicos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de la subvención número R21-HL094828-01 otorgado al Dr. Poelzing.

1. Prepare la función del ruido y la señal de entrada <ol><li> Crear una función de ruido que contiene los componentes de la frecuencia deseada. Esto se puede hacer mediante la descripción de los componentes de frecuencia deseada en el dominio de la frecuencia y el cálculo de la inversa de la transformada rápida de Fourier. En este estudio, 1 - 15 kHz se utiliza. Todas las transformadas de Fourier y la transformada de Fourier inversa se describe en este estudio se calcularon utilizando FFT de Matlab y funciones IFFT. </li><li> Escala de la amplitud de la función de ruido adecuado. En este estudio la función de ruido se redujo de tal manera que el cero a la máxima amplitud de la función de ruido es de 50 o 100 mV. </li><li> Crear un archivo de estímulo con los métodos apropiados para la adquisición de software que se utiliza. Para Clampex 8, primero debe crear un archivo de texto con el encabezado correspondiente. Debajo de la cabecera, inserte los incrementos de tiempo de un solo barrido en la primera columna. Los incrementos de tiempo debe tener el mismo espacio temporal como el intervalo de muestreo utilizados en las mediciones. Para cada barrido en el protocolo de paso de tensión insertar las tensiones exacta deseada en cada paso de tiempo. Esto debe incluir la función de ruido. </li></ol> 2. Realizar mediciones de tensión Clamp <ol><li> Crear un protocolo de medición en el software de adquisición que sea compatible con el archivo de estímulo generado previamente. En Clampex, hay un menú que permite al usuario asociar un archivo de estímulo con el protocolo actual. </li><li> Adjuntar un modelo (o biológicas) de células de los equipos de medición. </li><li> Realizar el experimento en la fecha prevista. A efectos de control, asegúrese de incluir mediciones periódicas que no incluyen ningún tipo de funciones de ruido. </li></ol> 3. El análisis post-Experimento <ol><li> Se calcula la curva IV para un registro individual. Si la grabación está en estado estacionario cuando la función de ruido se aplica, la curva IV pueden ser creados usando una parte el estado de equilibrio de la grabación temporalmente fuera del rango de la función de ruido. Si la grabación no se encontraba en estado estacionario, la función de ruido puede interferir con el cálculo de la curva IV, por lo que una segunda grabación se debe hacer sin la función de ruido presente. </li><li> Para cada escalón de tensión en una grabación de calcular la transformada rápida de Fourier de la parte de la grabación donde se introdujo la función de ruido. Combine la transformada de Fourier para cada escalón de tensión en amxn matriz, donde m es el número de frecuencias en la FFT, y n es el número de pasos de voltaje. En esta configuración, cada fila de la matriz representa la amplitud de una sola frecuencia en todas las etapas de tensión en el experimento. </li><li> Para cada frecuencia (es decir, cada fila de la matriz anterior) se correlacionan con la fila de la curva IV generada en 3.1 y registrar el coeficiente de correlación. </li><li> Parcela el coeficiente de correlación de frecuencia vs visualizar las frecuencias que se correlacionan altamente con la curva IV. Dado que el componente de CC está contenida dentro de la primera frecuencia de la FFT, el coeficiente de correlación para esta frecuencia siempre debe ser&gt; 0,99. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Representante de medidas con la pinza de voltaje se muestran en una celda sin modelo (Figura 1) y con (fig. 1B) una función de ruido se inserta en el protocolo de paso de tensión. La curva IV también se calculó para el modelo de células (fig. 1C). Para cada uno de barrido, en las grabaciones de la Figura 1, la FFT se calcula sobre el marco de tiempo donde se introdujo la función de ruido (véase el recuadro rojo en las figuras 1A, 1B). Las figuras 2A y 2B muestran la FFT calculada para las grabaciones se muestra en la Figura 1A y 1B, respectivamente. Tras la inspección visual, el componente de CC (en rojo) parece imitar la forma de la curva IV. Sin la función de ruido, todas las frecuencias por encima de DC parecen tener amplitudes cercanas a cero (Figura 2). Cuando la función de ruido se inserta, las frecuencias entre 1 y 15 kHz tienen amplitudes visualmente apreciable (Figura 2B). La Figura 3 muestra el resultado de la correlación de amplitudes de frecuencia individuales en el rango de medidas de tensión en la curva IV. Figura 3A-C muestra los coeficientes de correlación cuando el experimento se llevó a cabo bajo condiciones de control (sin función de ruido) y con una amplitud de ruido de 50 y 100 mV, respectivamente. Aviso en todos los casos, el componente de CC parece correlacionarse casi a la perfección con la curva IV. De hecho, para todas las grabaciones, el coeficiente de correlación para esta frecuencia fue mayor que 0,99 (R = 0,9996 ± 1E-5, media ± desviación estándar). Cuando nos fijamos en la Figura 3A (las condiciones de control), no hay frecuencias, además de la componente de CC, cuya amplitud se correlaciona significativamente con la curva IV. En concreto, ninguna de estas frecuencias tienen coeficientes de correlación superior a 0,5. Tras la inserción de la función de la amplitud de ruido más bajo (50 mV), estas mismas frecuencias todavía tenían coeficientes de correlación inferior a 0,5. Los coeficientes de correlación para lafrecuencias se también no llegó a ser superior a 0,5 cuando la amplitud del ruido se incrementó a 100 mV. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> . Figura 1 grabaciones modelo de celular: Las grabaciones de pinza de voltaje se muestran en una celda sin modelo (1A) y (1B) una función de ruido incluido en el protocolo de paso de tensión. Para el primero y el último 20 ms de cada pasada, el potencial se mantuvo en el potencial de mantenimiento (0 mV). Cada escalón de tensión fue de 80 ms de largo, y la función de ruido se insertó 40 ms después del comienzo de la etapa. La función de ruido tuvo una duración de 30 ms y contenía frecuencias entre 1 y 15 kHz. Tensión se intensificó lado a otro, -150 a 50 mV en incrementos de 5 mV. Una curva IV para el modelo de células también se muestra (1C). Para realizar las grabaciones más fácil de leer, sólo uno de cada barrido quinto fue incluido en 1A y 1B, pero todos los barridos se incluyeron en 1C. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 FFT de las grabaciones:. La FFT se calcula para la parte de 30 ms de cada pasada, donde la función de ruido se va a insertar (el área delimitada por el cuadro rojo en las figuras 1A, 1B). Las figuras 2A y 2B muestran la FFT calculada con y sin la función de ruido, respectivamente. Una vez más, para mayor claridad, sólo la FFT de cada barrido quinto se incluye en la figura, pero todos los barridos se utilizaron en los cálculos futuros. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> . Figura 3 Correlación de frecuencias IV: Los resultados de las correlaciones entre la curva IV de la grabación y la amplitud de las frecuencias individuales en el rango de medidas de tensión se muestra. Figuras 1A - 1C muestran el coeficiente de correlación de frecuencias entre 0 y 20 kHz en condiciones de control, y en presencia de 50 o 100 funciones de ruido mV, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4 Re-Creación de la curva IV:. La curva IV para el modelo de células (como en la figura 1C) y la magnitud de las dos frecuencias se superponen. La primera frecuencia fue el componente DC (R = 0,995), y la segunda fue una frecuencia elegida al azar, con baja correlación (r = 0.3212). Las amplitudes de frecuencia fueron reducidas a aproximadamente la misma amplitud que la curva IV.

<ol><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Ukomadu, C., Zhou, J., Sigworth, F. J., Agnew, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mu%5Dl+Na%2B+channels+expressed+transiently+in+human+embryonic+kidney+cells%3A+Biochemical+and+biophysical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">mu]l Na+ channels expressed transiently in human embryonic kidney cells: Biochemical and biophysical properties.</a> Neuron. 8, 663-676 (1992).</li>
<li>Abriel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Arrhythmogenic+Mechanism+Revealed+by+a+Long-QT+Syndrome+Mutation+in+the+Cardiac+Na%2B+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Novel Arrhythmogenic Mechanism Revealed by a Long-QT Syndrome Mutation in the Cardiac Na+ Channel.</a> Circ Res. 88, 740-745 (2001).</li>
<li>Giles, W. R., Imaizumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+potassium+currents+in+rabbit+atrial+and+ventricular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of potassium currents in rabbit atrial and ventricular cells.</a> J Physiol. 405, 123-145 (1988).</li>
<li>Lee, K. S., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+calcium+channel+blockade+by+verapamil%2C+D600%2C+diltiazem+and+nitrendipine+in+single+dialysed+heart+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of calcium channel blockade by verapamil, D600, diltiazem and nitrendipine in single dialysed heart cells.</a> Nature. 302, 790-794 (1983).</li>
<li>Ozdemir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Inhibition+of+Na%2FCa+Exchange+Results+in+Increased+Cellular+Ca2%2B+Load+Attributable+to+the+Predominance+of+Forward+Mode+Block%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Inhibition of Na/Ca Exchange Results in Increased Cellular Ca2+ Load Attributable to the Predominance of Forward Mode Block.</a> Circ Res. 102, 1398-1405 (2008).</li>
<li>Zhang, S., Zhou, Z., Gong, Q., Makielski, J. C., January, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Block+and+Identification+of+the+Verapamil+Binding+Domain+to+HERG+Potassium+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Block and Identification of the Verapamil Binding Domain to HERG Potassium Channels.</a> Circ Res. 84, 989-998 (1999).</li>
<li>Veeraraghavan, R., Poelzing, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+increased+right+ventricular+conduction+sensitivity+to+flecainide+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying increased right ventricular conduction sensitivity to flecainide challenge.</a> Cardiovasc. Res. 77, 749-756 (2008).</li>
<li>Goodman, M., Art, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+feedback+by+a+potassium-selective+inward+rectifier+enhances+tuning+in+vertebrate+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Positive feedback by a potassium-selective inward rectifier enhances tuning in vertebrate hair cells.</a> Biophysical Journal. 71, 430-442 (1996).</li>
<li>Han, A., Frazier, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channel+characterization+using+single+cell+impedance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Ion channel characterization using single cell impedance spectroscopy.</a> Lab Chip. 6, 1412-1414 (2006).</li>
<li>Hayashi, H., Fishman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifier+K%2B-channel+kinetics+from+analysis+of+the+complex+conductance+of+Aplysia+neuronal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Inward rectifier K+-channel kinetics from analysis of the complex conductance of Aplysia neuronal membrane.</a> Biophysical Journal. 53, 747-757 (1988).</li>
<li>Millonas, M. M., Hanck, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonequilibrium+response+spectroscopy+of+voltage-sensitive+ion+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Nonequilibrium response spectroscopy of voltage-sensitive ion channel gating.</a> Biophys. J. 74, 210-229 (1998).</li>
<li>Misakian, M., Kasianowicz, J., Robertson, B., Petersons, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+response+of+alternating+currents+through+the+Staphylococcus+aureus+alpha-hemolysin+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectromagnetics%22%5BJournal%5D)">Frequency response of alternating currents through the Staphylococcus aureus alpha-hemolysin ion channel.</a> Bioelectromagnetics. 22, 487-493 (2001).</li>
<li>Sale, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+Properties+of+hERG+1a%2F1b+Heteromeric+Currents+and+a+hERG+1b-Specific+Mutation+Associated+With+Long-QT+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Physiological Properties of hERG 1a/1b Heteromeric Currents and a hERG 1b-Specific Mutation Associated With Long-QT Syndrome.</a> Circ Res. 103, 81-95 (2008).</li>
<li>Blatz, A. L., Magleby, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+description+of+three+modes+of+activity+of+fast+chloride+channels+from+rat+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative description of three modes of activity of fast chloride channels from rat skeletal muscle.</a> J Physiol. 378, 141-174 (1986).</li>
<li>Kuo, J. J., Lee, R. H., Zhang, L., Heckman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+the+persistent+sodium+current+in+spike+initiation+during+slowly+rising+inputs+in+mouse+spinal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Essential role of the persistent sodium current in spike initiation during slowly rising inputs in mouse spinal neurones.</a> The Journal of Physiology. 574, 819-834 (2006).</li>
<li>Thompson, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+potassium-channel+selectivity+revealed+by+Na%28%2B%29+and+Li%28%2B%29+binding+sites+within+the+KcsA+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of potassium-channel selectivity revealed by Na(+) and Li(+) binding sites within the KcsA pore.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 1317-1324 (2009).</li>
</ol>

Hay obstáculos técnicos que actualmente impiden a los investigadores de la medición de múltiples tipos de canales iónicos de forma simultánea con la intención de posteriormente determinar la cantidad de corriente se debe atribuir a cada tipo de canal. Debido a esta limitación, los canales iónicos se estudian individualmente usando técnicas tales como tensión, corriente, y la acción pinza potencial. 1 Para el estudio de los distintos tipos de canales, sistemas de expresión heteróloga se utilizan con frecuencia. 2 Cuando se trabaja con células aisladas de tejido, como los cardiomiocitos , otros medios deben ser usados ​​para bloquear varios canales de iones. Por ejemplo, los canales de sodio puede ser inactivado por una rampa de tensión lenta despolarización, 3 hacia adentro rectificar los canales de potasio puede ser bloqueado con BaCl2 extracelular, 4 canales de calcio y pueden ser bloqueados con verapamilo 5. Una de las prácticas que en parte supera esta limitación es para medir el flujo de corriente a través de dos tipos de canales de forma simultánea, y luego repetir la medición después de bloquear selectivamente un tipo de canal con un agente apropiado. La resta de las dos mediciones se pueden utilizar para estimar la cantidad de corriente atribuible al tipo de canal que fue bloqueado. 6 Sin embargo, hay dos grandes limitaciones de esta técnica. En primer lugar, los agentes químicos no han sido identificados que pueden bloquear de forma selectiva cada uno de los canales iónicos, y algunas drogas utilizadas son interacciones no específicas con los tipos de canal. 5,7 segundo lugar, no puede determinarse a partir de esta técnica si un canal está modulada por otra canal. Por ejemplo, la expresión heterogénea de NAV 1.5 y Kir 2.1 ha demostrado en Guinea ventrículos cerdo, y se ha sugerido que existe una relación sinérgica entre los dos canales, de tal manera que Kir 2,1 mayor expresión en el ventrículo derecho deprime la velocidad de conducción. Actualmente 8 , esto no puede ser verificada. En este estudio, sugieren que la espectroscopía de impedancia puede ser una herramienta útil para el estudio de múltiples tipos de canales de iones medidos de forma simultánea. Aunque el método presentado no ha sido utilizado para discernir las corrientes a partir de dos tipos de canales miden simultáneamente, espectroscopía de impedancia se ha utilizado para estudiar una serie de otros aspectos de la función del canal iónico. Goodman y el arte con la tortuga mostró células ciliadas auditivas que los protocolos de corriente con la pinza se puede modificar para ajustar una celda a diferentes frecuencias, y las oscilaciones en el potencial de membrana se debe a una interacción entre un adentro rectificar canal de K + y un canal de Ca 2 +. 9 Han y Frazier demostrado que la impedancia se puede medir en una sola célula en un amplio rango de frecuencias (100 Hz a 5 MHz), y el aumento de la impedancia observada en K + o Ca 2 + canales estaban bloqueados podría ser un simple medio para detectar un bloqueo en el canal de pantallas de alta rendimiento de drogas. 10 Hayashi y Fishman ha utilizado la conductancia complejas para estudiar las propiedades cinéticas de una rectificación de K + hacia el interior del canal 11. Otros grupos han insertado una sola frecuencia en el protocolo de fijación de voltaje de los tipos de canales diferentes y demostró que la respuesta en frecuencia observada de acuerdo con la respuesta esperada para algunas frecuencias, pero otras no. 12,13 Millonas y Hanck sugiere la razón algunas frecuencias no se produce la respuesta esperada es la presencia de constantes de tipo de interés múltiple en el modelo de Markov. 12 Estudios como estos, así como otros, han demostrado que hay casos en que las corrientes iónicas medidas de los canales iónicos durante el uso de espectroscopía de impedancia no está de acuerdo con la respuesta de frecuencia teórica. Esto no es una preocupación en este estudio debido a que el objetivo del método en este estudio es identificar las frecuencias que se corresponden con la amplitud de la corriente independiente de los supuestos del circuito eléctrico de membrana. Furtheremore, la amplitud de la corriente se calcula a partir de porciones de las grabaciones que no tienen funciones de ruido inserta en ellos. Un número de otros estudios también los modelos actuales de los canales iónicos exhiben numerosos numerosos estados la realización de la conducción y no a todos con sus constantes de velocidad propia. 14,15,16 Thompson et al demostraron que el filtro de selectividad del canal KcsA tiene diferentes sitios de unión de Na +, Li + y K +, y los costes energéticos de moverse de un sitio de unión a los otros como se mueve un ion a través del filtro de selectividad es lo que hace el canal de preferencia realizar iones K + a través de sus poros. 17 En el presente trabajo se inserta una amplia de frecuencias (función de ruido) en un protocolo de paso de tensión y buscó las frecuencias, cuya amplitud altamente correlaciona con la amplitud de la corriente general. Desde una fuerte evidencia ha sido presentada sugiere varias constantes tasa de desempeñar un papel en la conducción de iones a través de difet los canales, la introducción de las frecuencias asociadas a estas constantes de velocidad pueden causar ciertas frecuencias de resonancia o altamente correlaciona con la amplitud de la corriente, que no habría otra manera. La técnica demostrada en este estudio se realiza sobre un modelo de células, que es un circuito paralelo RC que normalmente se utiliza para probar el circuito de fijación de voltaje y el equipo de adquisición. No se espera que las frecuencias, además de CC se correlaciona con la magnitud actual, y esto se muestra en nuestros datos. También muestran que la adición de la función de ruido no causa ningún frecuencias para correlacionar altamente con la amplitud de la corriente. Estos dos hallazgos son muy importantes porque demuestran que el equipo de medición y la función del ruido de por sí no causa ningún frecuencias que se correlaciona con la amplitud de la corriente. Cuando los estudios futuros efectúe las mediciones con las membranas que contienen los canales de iones, se espera que, en función del canal utilizado, las frecuencias que corresponden a las constantes de velocidad en el filtro de selectividad o, posiblemente, de los poros de la influirán en la respuesta de frecuencia del canal y afectan a las frecuencias que tienen un alto o una baja correlación con la amplitud de la corriente. Dado que este método es una nueva técnica para el estudio de los canales iónicos, hay una serie de direcciones futuros estudios podrían seguir. En primer lugar, la técnica debe ser utilizado para caracterizar la respuesta de frecuencia de determinados canales aislados. El trabajo adicional también hay que hacer para calibrar la amplitud de la frecuencia de las amplitudes de corriente. Una vez que los canales múltiples se caracterizan individualmente, varios tipos de canal se debe medir de forma simultánea. La técnica también podría ser adaptado para su uso en la abrazadera del potencial de acción, pinzas de corriente, y los estudios de campo de estimulación. Si bien esta es una nueva técnica, que muestra lo que puede ser una poderosa manera de hacer las mediciones electrofisiológicas que anteriormente no eran posibles y proporcionar valiosos nuevos conocimientos sobre el papel fisiológico de los canales iónicos.

<table><tbody><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>n/a</td><td>Natick, MA</td></tr><tr><td>Clampex 8</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampex 8</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>Amplificador de registro por parche integrado</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>Etapa frontal</td><td>Molecular Devices</td><td>CV202</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>Sistema de adquisición de datos de 16 bits</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1322A</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>Célula modelo</td><td>Molecular Devices</td><td>Patch 1 Model Cell</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr></tbody></table>

recapitulación de una curva de canal iónico iv uso de componentes de frecuencia

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

INTRODUCCIÓN: En la actualidad, no existen métodos establecidos para medir varios tipos de canales iónicos y se descomponen al mismo tiempo la corriente medida en porciones atribuibles a cada tipo de canal. Este estudio demuestra cómo espectroscopía de impedancia puede ser utilizado para identificar frecuencias específicas que se correlaciona altamente con la amplitud de la corriente de estado estacionario medida durante los experimentos de fijación de voltaje. El método consiste en insertar una función de ruido contiene frecuencias específicas en el protocolo de paso de tensión. En el trabajo presentado, una célula modelo se utiliza para demostrar que no hay una alta correlación son introducidos por los circuitos de fijación de voltaje, y también que la función de ruido en sí no presenta ninguna correlación alta cuando no hay canales de iones están presentes. Esta validación es necesaria antes de que la técnica puede aplicarse a los preparados que contienen los canales de iones. El objetivo del protocolo que se presenta es para demostrar la forma de caracterizar la respuesta en frecuencia de un tipo de canales iónicos individuales a una función de ruido. Una vez que las frecuencias se han identificado en un tipo de canal individual, que puede ser usado para reproducir el estado de equilibrio actual de tensión (IV) la curva. Las frecuencias que se correlacionan con gran tipo de canal y una mínima correlación con los tipos de otro canal se puede utilizar para estimar la contribución actual de los tipos de canales múltiples medidas simultáneamente. MÉTODOS: Las mediciones de voltaje clamp se realizaron en un modelo de células utilizando un protocolo estándar de tensión de paso (-150 a +50 mV, 5mV pasos). Funciones de ruido que contienen magnitudes iguales de 15.1 kHz frecuencia (de cero a amplitudes de pico: 50 o 100 mV) se inserta en cada escalón de tensión. El componente real de la Transformada Rápida de Fourier (FFT) de la señal de salida se ha calculado con y sin ruido para cada posible paso. La magnitud de cada frecuencia en función de la tensión de paso se correlaciona con la amplitud de la corriente en los voltajes correspondientes. Resultados y conclusiones: En la ausencia de ruido (control), las magnitudes de todas las frecuencias excepto el componente DC débil correlación (| R | &lt;0,5) con la curva IV, mientras que el componente de CC tuvo un coeficiente de correlación superior a 0,999 en todas las mediciones. La calidad de la correlación entre las frecuencias individuales y la curva IV no cambió cuando una función de ruido fue introducido en el protocolo de paso de tensión. Del mismo modo, el aumento de la amplitud de la función de ruido tampoco aumentar la correlación. Medidas de control demuestra que el circuito de fijación de voltaje por sí misma no causa ningún frecuencias por encima de 0 Hz a correlacionan altamente con la curva en estado estacionario IV. Del mismo modo, las mediciones de la presencia de la función de ruido demostrar que la función de ruido no causa ningún frecuencias por encima de 0 Hz a correlacionarse con la curva en estado estacionario IV cuando no hay canales de iones están presentes. En base a esta verificación, el método puede aplicarse ahora a los preparados que contienen un tipo de iones de un solo canal con la intención de identificar las frecuencias cuyas amplitudes se correlaciona específicamente con ese tipo de canal.

Hay obstáculos técnicos para la medición de flujo de corriente a través de los canales iónicos de forma simultánea, y luego discernir qué parte de la corriente transmembrana se debe a que cada tipo de canal. Para satisfacer esta necesidad, este método presenta una forma de generar la curva IV de los tipos de canal individual utilizando componentes de frecuencias específicas.

Recapitulación de una curva de canal iónico IV Uso de componentes de frecuencia

INTRODUCCIÓN: En la actualidad, no existen métodos establecidos para medir simultáneamente múltiples tipos de canales iónicos y descomponer la corriente medida en...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar una técnica para caracterizar la respuesta en frecuencia de los canales iónicos con el fin de medir el flujo de corriente a través de múltiples tipos de canales simultáneamente. Esto se logra primero creando la función de ruido que se incluirá en el protocolo de escalón de voltaje e incorporándola en un archivo de estímulo, lo cual es necesario para utilizar formas de onda personalizadas con el software clamp X. El segundo paso del procedimiento consiste en aplicar el protocolo de escalón de voltaje recién creado a una célula modelo utilizando técnicas estándar de bloqueo de voltaje en célula completa y registrar la corriente resultante. El tercer paso del procedimiento es calcular la curva IV de la célula y la transformada rápida de Fourier (FFT) de la porción de cada barrido que contiene la función de ruido.El paso final del procedimiento consiste en correlacionar individualmente la amplitud de cada frecuencia en todos los pasos de voltaje con la curva IV de esa célula. Los resultados muestran que ninguna frecuencia se correlaciona fuertemente con la curva IV de la célula modelo. La ventaja principal de esta técnica frente a métodos existentes como el bloqueo de voltaje estándar en células completas es que podría proporcionar un medio para medir más de un tipo de canal iónico simultáneamente, sin necesidad de utilizar agentes bloqueadores farmacológicos ni protocolos de inactivación por voltaje.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la fisiología de los canales iónicos, como qué efecto tiene el nivel de expresión de un tipo de canal iónico sobre la actividad de otros tipos de canales iónicos en el mismo tejido. El primer paso del protocolo consiste en crear una función de ruido que contenga los componentes de frecuencia deseados. Para ello, primero describa los componentes de frecuencia deseados en el dominio de la frecuencia.En este estudio, se utilizan componentes de frecuencia entre uno y 15 kilohercios. Luego, calcule la transformada inversa rápida de Fourier mediante la función IFFT de MATLAB para transformar las frecuencias seleccionadas al dominio del tiempo. A continuación, ajuste adecuadamente la amplitud de la función de ruido.En este estudio, la función de ruido se escala dos veces: una vez de modo que la amplitud de cero a pico de la función de ruido sea de 50 milivoltios, y la segunda vez, de modo que la amplitud de cero a pico sea de 100 milivoltios. El siguiente paso consiste en crear un archivo de estímulo utilizando un programa como matlab. Un archivo de estímulo es simplemente un archivo de texto con un encabezado que indica al software de adquisición clamp X eight exactamente qué voltaje utilizar en cada punto del tiempo.Para crear primero el archivo de estímulo, cree un archivo de texto con el encabezado apropiado; debajo del encabezado, inserte los incrementos de tiempo para un solo barrido en la primera columna. Los incrementos de tiempo deben tener el mismo espaciado temporal que el intervalo de muestreo utilizado en las mediciones. Este protocolo utiliza una frecuencia de muestreo de 200 kilohercios. Para cada barrido, inserte los voltajes exactos deseados en cada paso de tiempo.Cada columna se considera un barrido independiente, por lo que para un protocolo que aumenta de menos 150 milivoltios a más 50 milivoltios en incrementos de cinco milivoltios, se deben agregar 41 columnas después de la columna de tiempo. Los voltajes especificados deben incluir la función de ruido en clamp X. Se debe crear un protocolo para cada experimento, por lo que el siguiente paso consiste en elaborar un protocolo de medición compatible con un archivo de estímulo generado previamente. En clamp X, seleccione la opción del menú editar protocolo de onda cero del adquisidor, que permite asociar un archivo de estímulo con el protocolo actual.El siguiente paso consiste en aplicar el estímulo definido a la célula. Este protocolo utiliza una célula modelo que tiene un circuito RC en paralelo. Conecte la célula modelo al equipo de medición, haga clic en el botón de grabación y realice el bloqueo de X.El experimento está programado con fines de control. Asegúrese de incluir mediciones periódicas que no contengan ninguna función de ruido; después de haber recopilado los datos, el siguiente paso es generar las curvas IV y realizar las transformadas rápidas de Fourier. Para calcular la curva IV de una grabación individual, utilice una porción en estado estacionario de la grabación fuera del rango temporal de la función de ruido para medir la amplitud de la corriente.Si la grabación no está en estado estacionario cuando se aplica la función de ruido, esta función podría interferir con el cálculo de la curva IV, en cuyo caso debe utilizarse la grabación de control. Para calcular la curva IV para cada escalón de voltaje en una grabación, calcule la FFT de la porción de la grabación donde se insertó la función de ruido. Combine la transformada de Fourier de cada escalón de voltaje en una matriz M por N, donde M es el número de frecuencias en la FFT y N es el número de escalones de voltaje en esta configuración.Cada fila de la matriz representa la amplitud de la FFT de una frecuencia individual en todos los pasos de voltaje del experimento. El siguiente paso consiste en calcular los coeficientes de correlación para cada frecuencia, correlacionando la fila con la curva IV generada previamente. Registre el coeficiente de correlación.A continuación, genere un gráfico del coeficiente de correlación frente a la frecuencia para visualizar las frecuencias que se correlacionan altamente con la curva IV. Aquí se muestran los resultados de las mediciones del clamp de voltaje sin una función de ruido insertada. Durante los primeros y últimos 20 milisegundos de cada barrido, el potencial se mantuvo en el potencial de reposo de cero milivoltios.Entre medias, el voltaje aumentó desde menos 150 milivoltios hasta más 50 milivoltios en incrementos de cinco milivoltios. Cada paso de voltaje duró 80 milisegundos para facilitar la lectura de la figura; solo se incluye en la figura cada quinto barrido. El cuadro rojo indica cuándo se habría aplicado la función de ruido si hubiera existido una función de ruido en estos barridos.Esta figura es similar a la figura anterior, pero con la función de ruido insertada en el protocolo de escalón de voltaje 40 milisegundos después del inicio del escalón de voltaje; el cuadro rojo muestra dónde se insertó la función de ruido. La función de ruido tuvo una duración de 30 milisegundos y contenía frecuencias entre uno y 15 kilohercios. Esta figura muestra la curva IV que se calculó para la célula modelo.Esta curva IV es lineal, lo cual es esperado ya que la célula modelo es un circuito RC paralelo simple. Esta figura muestra el resultado de la FFT sin la función de ruido para cada barrido. En las grabaciones de la célula modelo, la FFT se calculó durante el período de tiempo en el que se insertó la función de ruido.El componente de CC, que se resalta en rojo, parece imitar la forma de la curva IV. Todas las frecuencias por encima de CC parecen tener amplitudes cercanas a cero; solo por claridad, se incluye en la figura la FFT de cada quinto barrido. Cuando se calcula la FFT para las grabaciones con la función de ruido insertada, las frecuencias entre uno y 15 kilohercios tienen amplitudes notables. La presencia de estas frecuencias más altas, que normalmente no están presentes en experimentos de bloqueo de voltaje, plantea la pregunta de si la magnitud de alguna de estas frecuencias cambia proporcionalmente con la amplitud de la corriente.Estas tres figuras siguientes muestran el coeficiente de correlación entre la amplitud de la frecuencia individual y la curva IV de la grabación. En la primera figura, no se utilizó ninguna función de ruido. En la segunda figura, la función de ruido tenía una amplitud máxima de 50 milivoltios, y en la tercera figura, la función de ruido tenía una amplitud máxima de 100 milivoltios.Téngase en cuenta que en todos los casos la componente de corriente continua, es decir, la respuesta a cero hercios, tiene un coeficiente de correlación mayor que 0,99, por lo que parece correlacionarse casi perfectamente con la curva IV. Asimismo, obsérvese que en las tres figuras, ninguna de las otras frecuencias presenta coeficientes de correlación superiores a 0,5. Además, la inserción de la función de ruido con una amplitud de 50 o 100 milivoltios no alteró este patrón.Estos resultados indican que la circuitería del clamp de voltaje y la función de ruido en sí misma no introducen altas correlaciones en la curva IV. Esta validación es importante para aplicar esta técnica a preparaciones que contienen canales iónicos. Esta figura recrea la curva IV para mostrar la correlación o la ausencia de ella en dos conjuntos de datos de frecuencia.La curva IV para la celda modelo etiquetada como IV real en esta figura es la línea punteada que parece superponerse sobre la línea roja discontinua. La línea roja discontinua muestra la componente de corriente continua, que tiene un coeficiente de correlación de 0,995 respecto a la línea IV real. La tercera curva, mostrada como una línea dentada, corresponde a una frecuencia elegida al azar de 4,399 kilohercios con baja correlación.El coeficiente de correlación entre esta línea y la curva IV es 0,3212. Estos resultados indican que el equipo de medición y la función de ruido no causan por sí solos que ninguna frecuencia se correlacione con la amplitud de la corriente. Basándose en esta verificación, el método aquí presentado, que consiste en insertar una función de ruido en los escalones de voltaje durante experimentos de bloqueo de voltaje, puede aplicarse primero a preparaciones de membrana que contengan un único tipo de canal iónico y posteriormente a preparaciones que contengan múltiples tipos de canales. Los resultados de los experimentos con un solo tipo de canal iónico pueden analizarse utilizando la TDF y el análisis de correlación propuestos aquí.Este análisis puede utilizarse para identificar frecuencias cuyas amplitudes se correlacionan específicamente con ese tipo particular de canal. Se ha presentado evidencia sólida que sugiere que múltiples constantes de velocidad desempeñan un papel en la conducción de iones a través de diferentes canales. Por lo tanto, una vez identificadas las frecuencias, estas se correlacionan altamente con un tipo de canal y se correlacionan mínimamente con otros tipos de canales.Estas frecuencias pueden luego utilizarse para estimar la contribución actual de múltiples tipos de canales medidos simultáneamente siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos como el bloqueo farmacológico y los pulsos previos para responder preguntas adicionales, tales como cómo se comporta la respuesta en frecuencia de los canales cuando un canal iónico se encuentra en una conformación bloqueada o inactiva.

recapitulation-of-an-ion-channel-iv-curve-using-frequency-components

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Corriente iónica de los canales BK se registraron con la técnica de patch clamp. Canales BK se expresan...

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

Plenario de células patch-clamp grabaciones de las dendritas de fibras nerviosas auditivas en la sinapsis cinta del pelo interior de células de la cóclea de los mamíferos.

Grabaciones postsinápticos en las dendritas aferentes cocleares ponerse en contacto con las células ciliadas internas: Comunicado de Vigilancia multivesiculares en una sinapsis cinta

Se describe la preparación de rodajas finas de la retina acuáticos salamandras tigre...

Simultáneas registros de células de fotorreceptores y las neuronas de segundo orden en una rebanada preparación retina Anfibios

Descrito aquí es un procedimiento para la obtención de largos tramos de grabación actual de un canal de iones con la técnica de patch-clamp de células-adjunto. Este método permite observar, en tiempo real, el modelo de open-close conformaciones de canales que son la base de la señal biológica. Estos datos informan acerca de las propiedades de los canales en las membranas biológicas inalteradas.

Un canal celular conectado a Patch-clamp grabación

La reconstitución de la proteína transmembrana, KvAP, en vesículas unilamelares gigantes (GUVs) se demostró por dos métodos de deshidratación-rehidratación - electroformation e inflamación gel asistida. En ambos métodos, pequeñas vesículas unilamelares que contienen la proteína se fusionan para formar GUVs que luego pueden ser estudiadas mediante microscopía de fluorescencia y la electrofisiología patch-clamp.

Reconstitución de una proteína transmembrana, el canal iónico dependiente de voltaje, KvAP, en Gigante vesículas unilamelares para Microscopía y Patch Clamp Estudios

Este artículo describe cómo se determina la selectividad iónica de la canalrodopsina con registros electrofisiológicos de patch-clamp de células completas utilizando células HEK293. Aquí, se demuestra el procedimiento experimental para investigar la selectividad del cloruro de una canalrodopsina selectiva de aniones. Sin embargo, el procedimiento es transferible a otras rodopsinas de clara selectividad.

Grabaciones con abrazadera de parche de células enteras para la determinación electrofisiológica de la selectividad iónica en canalrhodopsins

Este artículo describe una mejora de la Fluorometría de Voltaje-Clavija convencional (VCF) donde se usan Fluorescentes Aminoácidos No Naturales (fUAA) en lugar de tintes de maleimida, para sondar reordenamientos estructurales en canales iónicos. El procedimiento incluye inyección de ADN de ovocitos de Xenopus , coinjección de ARN / fUAA y mediciones de corriente y fluorescencia simultáneas.

Pinza de tensión Fluorometría en<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocitos Usando Fluorescentes Aminoácidos No Naturales

El protocolo aquí describe las interacciones de la proteína de canal de iones hEAG1 purificada con la pequeña molécula lipídica ligando fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato (PIP2). La medición demuestra que BLI podría ser un método potencial para la detección de iones de molécula pequeña novela canal ligando.

Captura de la cinética de la interacción de una proteína de canal iónico con moléculas pequeñas por el ensayo de interferometría de la Bio-capa

El presente protocolo describe un método eficiente para la adquisición dinámica y en tiempo real de corrientes de canal de potasio (Kv) dependientes de voltaje en cardiomiocitos H9c2 utilizando la técnica de pinza de parche de células enteras.

Registro de corriente de potasio dependiente del voltaje en cardiomiocitos H9c2 mediante la técnica de pinza de parche de células enteras

La electrofisiología de pinza dinámica puede establecer vínculos causales entre los déficits de activación neuronal y la disfunción del canal iónico. Describimos los métodos y protocolos de pinzamiento dinámico en neuronas de Purkinje cerebelosas de ratón, señalando recursos útiles y consideraciones técnicas. En un estudio representativo, agregamos conductancia de sodio modelada a las neuronas de Purkinje Tsc1-/- para rescatar disparos repetitivos.

Métodos de pinza dinámica para investigar la alteración de la excitabilidad neuronal asociada con el autismo

Se presenta un protocolo experimental para ensamblar, estimular eléctricamente y analizar bicapas de interfaz de gotas dopadas con gramicidina A. Las relaciones estructura-función lipídio-proteína se cuantifican midiendo cambios en el área de membrana, el flujo iónico y la conductancia de canal único, y relacionando estas respuestas con cambios similares a la plasticidad en la conducción iónica en un modelo de membrana inspirado en sinapsis eléctricas.

Caracterización de la estructura y función de la membrana lipído-proteína usando bicapas de interfaz de gotas

Aprende a caracterizar la respuesta de frecuencia de canales iónicos mediante componentes de frecuencia de 1-15 kHz en electrofisiología. Este método permite medir múltiples tipos de canales simultáneamente sin agentes farmacológicos.

Recapitulación de una curva de canal iónico IV Uso de componentes de frecuencia

Explorar más videos