Inducción y seguimiento de activos de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) en ratas

Hola, soy Christine Beaton. Trabajo en el laboratorio de George Chandy en el Departamento de Fisiología y Biofísica de la UCI. Hoy les mostraré cómo inducir la DHTr activa en ratas.

Para ello, voy a preparar una emulsión de KLH, que es mi antígeno, en adyuvante de Freund. Luego, voy a inyectar esta emulsión en la base de la cola de ratas Lewis. Esto va a inducir la inmunización de las ratas contra KLH. Y en una semana voy a desafiar a las ratas con KLH y medir la reacción de hipersensibilidad tardía (DTH) mediante la medición del hinchazón.

Ese es el sitio de desafío y lo estamos utilizando en el laboratorio para observar el efecto de los bloqueadores del canal PO sobre reacciones inflamatorias como la DH. Así que aquí está el adyuvante trans incompleto que voy a usar para preparar la emulsión. También podría usar el adyuvante trans completo.

Aquí hay cuarzo de KLH, que es mi antígeno de hoy, y tengo una solución aquí a dos miligramos por ml. En PBS, voy a usar esta jeringa de cinco ml para extraer el adyuvante incompleto y transferirlo a un tubo de 15 ml. Luego, colocaré un tubo en el vórtex y, mientras se agita en el vórtex, añadiré mi antígeno gota a gota al adyuvante.

Luego, voy a mezclar en vórtex durante cinco minutos más. Después de eso, voy a llenar esta jeringa de vidrio de 5 M con mi mezcla y debe ser una jeringa de vidrio porque el adyuvante tiende a disolver el plástico. Y las jeringas de 5 M que hemos encontrado son las mejores para preparar la emulsión.

Más pequeñas o más grandes no son tan buenas. Y una vez que haya llenado mi jeringa con la mezcla, voy a usar este puente metálico para conectar esta jeringa de vidrio con otra jeringa de vidrio de cinco mililitros. Luego, aplicaré presión sobre las jeringas para hacer que mi mezcla pase de una jeringa a la otra lo más rápido posible, hasta que se endurezca mucho, hasta que la emulsión se endurezca completamente, y entonces estará lista para la inyección.

Así que voy a colocar 2,5 ml de mi adyuvante. Primero inyecto aire para poder extraer el adyuvante más fácilmente y luego coloco todo el adyuvante en mi tubo. Ahora lo que voy a hacer es tomar 2,5 ml de eso y agregarlos al vórtex.

Dado que tomé 2,5 ml del adyuvante, voy a tomar 2,5 ml de mi KLH. A medida que agregue gota a gota, verán que la mezcla va a cambiar de color y se volverá blanca. Ahora he agregado todo el antígeno al adyuvante.

Entonces, lo que voy a hacer es agitar la mezcla en vórtex durante cinco minutos más. Pero como no quiero sostener el tubo durante cinco minutos, lo que haré será fijarlo con cinta al vórtex para crear el remolino dentro del tubo. Usted no quiere que sea lento, sino lo más rápido posible sin que rebose. Así que lo dejaré así durante cinco minutos.

Así que han pasado los cinco minutos. Ahora voy a detener el vórtex y mi mezcla es blanca. Así que saco el tubo. Ups.

La mezcla ya está completamente blanca, pero aún es bastante líquida. Y yo quería una consistencia más firme para la inyección. Por lo tanto, voy a transferir toda la mezcla a una jeringa de vidrio de 5 M.

Por lo tanto, esas jeringas han sido autoclavadas. Así, conecto una jeringa completa a mi puente. Y de la otra jeringa, solo conecto el cilindro.

Dejo el émbolo fuera y luego voy a verter mi mezcla en la jeringa superior. Voy a transferir todo a la jeringa inferior. Luego necesito empujar la burbuja de aire que tengo aquí.

Ahora voy a desconectar la jeringa superior y voy a empujar la burbuja de aire. La burbuja es difícil de ver, pero está justo aquí. Así que empujo la burbuja de aire.

También lo expulso desde el puente y luego vuelvo a conectar la jeringa superior. Me aseguro de que todo esté firmemente conectado y entonces voy a pasar mi mezcla de una jeringa a la otra. Al principio es fácil, pero pronto la mezcla se volverá dura.

Así que esta noche se está volviendo más difícil y no quiero romper el puente, así que simplemente giro mis jeringas. A veces lleva más tiempo. Varía de una emulsión a otra.

Probablemente depende de la temperatura y del nivel de humedad también. Pero creo que mi emulsión ya está lista. Está mucho más espesa de lo que estaba cuando la vertí.

Es completamente blanco. Y solo hay una fase. Nunca debería haber separación de la fase de ACO del aceite.

Entonces, ahora está listo para inyectar. Ahora la inmersión está lista para inyectar. Para inyectarla, utilizo, voy a inyectar 200 microlitros por hut.

Y para ello voy a utilizar jeringas de tres mililitros. Utilizo jeringas con punta de bloqueo para asegurarme de que la aguja no se salga, ya que la emulsión puede ser muy espesa y difícil de inyectar. En cuanto a las agujas, intento usar las más pequeñas posibles que aún permitan el paso de la emulsión.

Y descubrí que las jeringas de 20 3G son suficientemente adecuadas para esta emulsión. Para emulsiones más espesas, podría ser necesario utilizar jeringas más grandes. Ahora bien, la forma en que lo hacemos es que una persona sostiene la rata mientras la otra realiza la inyección.

Y para una seguridad máxima, la persona que sostiene las ratas, aunque estas estén muy tranquilas y estén acostumbradas a ser manipuladas, utiliza guantes resistentes a las mordeduras de roedores solo por seguridad máxima; no queremos que nos muerda ninguna rata. Así que coloco toda la emulsión en una jeringa de vidrio y desconecto la jeringa de vidrio vacía del puente. Y en su lugar, coloco mi jeringa plástica de tres mililitros con cierre inferior.

Ahora transfiero más de lo que necesito para una inyección de emulsión. Persigo la burbuja de aire. Como voy a inyectar 200 microlitros por inyección, dejo 300 microlitros en mi jeringa.

Desconecto el puente, coloco mi aguja en la jeringa de plástico y luego lleno la aguja, bajando el émbolo hasta 200 microlitros. Así me aseguro de no tener burbujas de aire. Ahora estamos listos para inyectar.

Por lo tanto, queremos asegurarnos de que la rata no se mueva. Agarramos la rata y coloco un dedo por encima del hombro y otro por debajo; luego, con la otra mano, sostengo las patas traseras y la cola, y vamos a inyectar en los flancos aquí, unos microlitros en este lado y luego microlitros en el otro lado. La semana pasada inmunicé a las ratas con una emulsión que contenía KLH como antígeno.

Hoy voy a desafiarlos intradérmicamente en el dorso con KLH, que es mi antígeno, y con ovoalbúmina, que es un antígeno relevante, pero para poder inyectarlos intradérmicamente en el dorso primero debo afeitarlos. Y para ello estoy usando simplemente una afeitadora eléctrica común. Sí, bueno, cambio las agujas entre cada rata para asegurarme de que la aguja no esté desafilada.

Facilita mucho la inyección intradérmica, especialmente cuando estoy inyectando volúmenes pequeños de 20 microlitros de cada antígeno. Así que ya he inyectado mis dos antígenos a todas las ratas y las voy a dejar en sus jaulas hasta mañana. Y mañana vamos a poder observar una inflamación.

Por lo tanto, el sitio de inyección estará enrojecido e hinchado, y podremos medir el diámetro del sitio de inflamación como un indicador de la inflamación. Ayer inyecté a las ratas por vía intradérmica en la espalda un antígeno relevante, que es la KLH, y un antígeno irrelevante, que es la albúmina. Ahora, 24 horas después, voy a observar a las ratas para ver si presentan inflamación.

Así que espero inflamación solo en el sitio de KLH, y la inflamación se manifestará como enrojecimiento e hinchazón. Y después de observar la inflamación, voy a medir el área inflamada simplemente midiendo el diámetro de la zona. Este es aquí el sitio inyectado con KH y se puede ver sin problema que hay una inflamación considerable.

Es muy rojo en comparación con la piel normal y está hinchado. Si ahora observamos el otro sitio que recibió albúmina, se puede ver el sitio de inyección justo aquí, pero no hay enrojecimiento ni hinchazón significativos. Por lo tanto, el control negativo funcionó.

Ahora voy a medir el sitio de inflamación. Para ello, voy a utilizar una regla común y voy a realizar una medición en milímetros. Esto mide seis milímetros y tomo una segunda medida.

Esto pesa cinco milímetros. Hay muy poca enrojecimiento; se tomará la medición, pero apenas alcanza un milímetro. Entonces, lo que les he mostrado aquí es cómo preparar una emulsión con un antígeno, cómo inmunizar ratas con esta emulsión y luego hacerles una prueba una semana después con el antígeno utilizado para la inmunización, así como con un antígeno relevante, y cómo visualizar y medir el grado de inflamación en el uso común y en el laboratorio Chan.

Utilizamos esta técnica de manera bastante rutinaria como un ensayo sencillo para medir el efecto de los bloqueadores de canales de potasio sobre la inflamación en ratas.