Nucleofection y cultivos primarios de neuronas del hipocampo de embriones de ratón y corticales

Las neuronas hipocampales y corticales se han utilizado ampliamente para estudiar la polarización neuronal del sistema nervioso central, el crecimiento de axones y dendritas, y la formación y función de sinapsis. Una ventaja del cultivo de estas neuronas es que se polarizan fácilmente, formando axones y dendritas distintivos sobre un sustrato bidimensional a densidades muy bajas. Este video demuestra una técnica para diseccionar, cultivar y transfectar neuronas embrionarias hipocampales y corticales de ratón mediante nucleofección, lo que permite la expresión de proteínas de fusión marcadas con fluoróforo desde las primeras etapas del desarrollo, aproximadamente entre cuatro y ocho horas después de sembrarlas. La expresión de las proteínas marcadas con fluoróforo se mantiene durante toda la vida de la neurona, por más de dos meses en cultivo. Esto posibilita el estudio de la función proteica durante eventos tempranos del desarrollo, como el crecimiento axonal, y eventos posteriores, como la sinaptogénesis y la plasticidad sináptica.

Primero, las células gliales se aíslan de los hemisferios corticales de ratones posnatales de uno a tres días de edad y se siembran en frascos. Después de alcanzar una confluencia del 70 al 100 %, las células gliales se vuelven a sembrar sobre cubreobjetos de vidrio.

Luego, se aíslan neuronas del hipocampo o la corteza de ratones E 15.5 y se transfectan mediante nucleofección con plásmidos que codifican proteínas de fusión fluorescentes, como la proteína fluorescente roja. Las neuronas transfectadas se siembran entonces en cámaras de imagen para estudios a corto plazo. Para cultivos a largo plazo, se invierten células gliales sobre laminillas de vidrio encima de cultivos de hipocampo o corteza para proporcionar soporte trófico, y luego se pueden observar neuronas individuales para mostrar la localización dinámica de las proteínas de fusión a lo largo de los axones o dendritas de las neuronas.

Hola, soy Eric Dent, profesor asistente de anatomía en la Universidad de Wisconsin Madison. Hoy, tres de mis estudiantes universitarios, Chris Wezelman, Jason Bwe y Derek Lombard, van a demostrar un procedimiento para aislar, sembrar y mantener cultivos de neuronas corticales e hipocampales para cultivo a corto y largo plazo. Estos cultivos pueden utilizarse para estudiar la dinámica de proteínas de fusión fluorescentes durante todo el desarrollo neuronal, desde el crecimiento inicial de los neuritos hasta el desarrollo de axones y dendritas y la sinaptogénesis.

Para preparar las cámaras para la obtención de imágenes de neuronas embrionarias de hipocampo y corteza de ratón, comience con placas de Petri de 35 milímetros que tengan orificios de 15 milímetros perforados en la base y todos los rebabas eliminados. Derrita una mezcla de parafina y vaselina en proporción tres a uno en un tubo cónico colocándolo en un baño de agua hirviendo.

Luego, use un pincel pequeño para recubrir la parte inferior del recipiente alrededor del orificio. Asegúrese de revolver la mezcla de parafina y vaselina entre las cámaras, ya que esta se separará. Coloque la laminilla sobre el orificio.

Una vez que se hayan preparado todos los recipientes, colóquelos en un horno a 80 grados Celsius hasta que se derrita la mezcla de parafina. Esto debería tardar aproximadamente 10 minutos. Luego, retire los recipientes y colóquelos sobre una superficie plana y deje que la mezcla de parafina solidifique durante al menos un minuto.

Dar la vuelta a las placas y colocarlas bajo una campana. Encender la luz UV durante 30 minutos para esterilizar tanto el interior de las tapas como la base de las cámaras. A continuación, recubrir.

Incube las cubreobjetos de la cámara con poli-D-lisina durante una hora. Luego, enjuague minuciosamente las cubreobjetos recubiertas de tres a cinco veces con agua desionizada estéril filtrada para eliminar todos los rastros de tampón borato. Después del enjuague final, use un vacío para secar las cámaras. Estas pueden usarse inmediatamente o almacenarse en una sala de cultivo de tejidos para su uso posterior.

Las cámaras recubiertas deben usarse dentro de una semana después de su preparación si se van a realizar cultivos a largo plazo. Las capas alimentadoras de glía cortical deben iniciarse de dos a tres semanas antes de continuar con las disecciones corticales o hipocampales. Coloque los cerebros de cuatro crías de ratón P1 a P3 en un recipiente que contenga medio de disección frío y colóquelo bajo el microscopio estereoscópico.

Retire los bulbos olfativos, los dos hemisferios cerebrales y las meninges. Transfiera los hemisferios a un nuevo recipiente que no contenga medio. Usando una cuchilla estéril limpia, pique las cortezas lo más finamente posible.

Luego, con una pipeta de plástico, transfiera el tejido picado a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 12 mililitros de medio de disección frío. Añada tripsina y ADN hasta concentraciones finales de 0,25 % y 0,1 %, respectivamente. Incube en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 10 minutos con agitación intermitente.

Tras la incubación, retire el tubo del baño de agua y límpielo cuidadosamente con etanol al 70 % antes de introducirlo en la cabina de cultivo de tejidos. Pipetee el tejido cortical hacia arriba y hacia abajo.

Con una pipeta de 10 mililitros, aspire aproximadamente de 10 a 15 veces o hasta que desaparezca la mayor parte de los fragmentos, luego regrese el tubo al baño de agua durante otros 10 minutos con agitación intermitente. Nuevamente, limpie cuidadosamente el tubo con etanol al 70 % y llévelo de vuelta a la campana de cultivo de tejidos.

Pipetee el tejido cortical hacia arriba y hacia abajo. Como antes, esta vez con una pipeta de cinco mililitros, agregue 15 mililitros de medio glial tibio y centrifugue a 1000 RPM durante 10 minutos. Descarte el sobrenadante y resuspenda las células del sedimento en 20 mililitros de medio glial fresco.

Utilice un citómetro de hemocitos para contar las células. A continuación, siembre de cinco a 7,5 millones de células en 15 mililitros de medio glial por matraz de 75 centímetros cuadrados. Coloque las células en el incubador a 37 grados Celsius y, después de un día, y cada dos o tres días posteriores en cultivo, desprenda las células sueltas golpeando el matraz contra la superficie de la cabina.

Retire el medio junto con cualquier célula desprendida y sustitúyalo por 15 mililitros de medio glial fresco. El medio glial se puede recolectar después de una a dos semanas de crecimiento en los frascos, cuando estén a punto de alcanzar la confluencia al 100 %. Para preparar portaobjetos individuales recubiertos con glía, comience colocando seis portaobjetos limpiados con ácido nítrico y esterilizados.

Cubos de 25 milímetros redondos en un recipiente de 10 centímetros y, utilizando un pincel pequeño, coloque tres puntos de la mezcla tres a uno de parafina y vaselina petrolera. Sobre cada cubreobjetos en un patrón triangular. Coloque dos puntos en los bordes del cubreobjetos para fijarlo al recipiente.

Someta los cultivos abiertos a luz UV durante 30 minutos. Recubra las laminillas con poli-D-lisina durante una hora. Luego lave abundantemente tres a cinco veces con agua desionizada estéril filtrada y deje secar; retire las células gliales del incubador.

Deseche el medio y lave con cinco mililitros de tripsina precalentada. Añada tres mililitros de tripsina al frasco e incube durante un minuto a 37 grados Celsius. Una vez que las células se hayan desprendido, añada cinco mililitros de medio glial para detener la acción de la tripsina.

Retire el GL del matraz pipeteando de arriba abajo de 10 a 15 veces. Luego, transfiera el medio a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a 1000 RPM durante ocho minutos. Tras la centrifugación, suspenda las células en 10 mililitros de medio glial.

Luego, después de contar las células, siembre cinco veces 10 a la quinta células en 12,5 mililitros de medio glial por placa de 10 centímetros que contenga las laminillas. Cambie el medio con medio glial fresco y precalentado cada dos o tres días, el día anterior a la disección de las neuronas. Retire el medio glial y sustitúyalo por medio sin suero.

Utilice posteriormente este medio libre de suero condicionado por células gliales. Al inundar cultivos corticales o hipocampales, se añade una C a una concentración final de cinco micromolares. Con el fin de prevenir la proliferación glial de los reactivos de transfección por nucleoafectación según se indica en las instrucciones del fabricante, luego caliente la solución a temperatura ambiente.

Coloque un recipiente que contenga cerebros de ratón E 15.5 en medio de disección frío. Bajo el microscopio de disección, utilice una aguja de tungsteno doblada para retirar ambas neocortezas. Luego, con pinzas microquirúrgicas, elimine las meninges y coloque las cortezas en un nuevo recipiente con medio de disección frío.

El hipocampo y la corteza son visibles a lo largo del lado medial del hemisferio cerebral con tijeras de iris pequeñas. Retire cuidadosamente el hipocampo. A continuación, retire la corteza restante.

Repita la disección en cerebros de toda la camada. Coloque las cortezas del hipocampo en tubos microcentrífugos separados de 1,5 mililitros, cada uno lleno con un mililitro de medio de disección frío. Coloque los tubos en hielo tras diseccionar todas las cortezas en los hipocampos.

Añada 110 microlitros de tripsina al 2,5 % a los tubos de microcentrífuga que contienen el tejido y coloque los tubos en un incubador a 37 grados Celsius durante 20 minutos. Utilizando una pipeta P1000, retire tanto líquido como sea posible del tubo. A continuación, añada un mililitro de medio de siembra a cada tubo y lave el tejido invirtiendo suavemente el tubo de microcentrífuga.

Repita el lavado dos veces. Después del lavado final, agregue un mililitro de medio de siembra. Utilice una pipeta P1000 para resuspender los fragmentos 15 veces. Luego, transfiera el sobrenadante y las células a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros que contenga cuatro mililitros de medio de siembra, dejando cualquier fragmento que permanezca en un tubo microfuga.

Centrifugar el tubo de 15 mililitros a 350 RPM durante siete minutos con la frenada desactivada tras la centrifugación, desechar el sobrenadante y añadir 100 microlitros de solución de nucleoafectación premezclada a temperatura ambiente. Pase la mezcla arriba y abajo cinco veces con la pipeta para mezclar; a continuación, transfiera 100 microlitros de la solución de nucleoafectación y la mezcla celular a cada nuevo tubo microfuge que contenga una cantidad adecuada de ADN, uno a dos microgramos de ADN por transfección. Para cultivos a largo plazo, esto marcará menos del 10 % de las neuronas en el cultivo.

Aunque cinco a 10 microgramos de ADN por transfección darán como resultado una eficiencia de transfección más alta para el cultivo, agregue la suspensión celular y la mezcla de ADN a un vial de electro poración. Luego coloque el vial en el electro. Para neuronas del SNC de ratón, configure el programa del nucleo efector en oh 0 0 5 y, trabajando rápidamente, agregue 500 microlitros del medio de siembra precalentado y equilibrado al vial y transfiera la solución celular a un nuevo tubo microfuga de 1,5 mililitros.

Añada medio de siembra suficiente para llevar el volumen de cada transfección a un mililitro. Después de contar las células, siembre de tres a cinco veces 10 a la tercera células por centímetro cuadrado para cultivos jóvenes, o de cinco a diez veces 10 a la tercera células por centímetro cuadrado para cultivos a largo plazo, generalmente cinco veces 10 a la quinta o una vez 10 a la sexta. Las células se utilizan por transfección para preparar cultivos a corto plazo.

Una hora después de sembrar, inunde las placas de cultivo de 35 milímetros con dos mililitros de medio sin suero, equilibrado con dióxido de carbono y tibio. Las cámaras de imagen resultan en un contenido muy bajo de suero, inferior al 0,5 %. Los cultivos a corto plazo no necesitan ser cultivados con una capa de alimentación glial y no necesitan ser repobrecidos. Para preparar cultivos a largo plazo, agregue un mililitro de condición glial al medio sin suero.

Retire un cubreobjetos recubierto con tres puntos de vaselina de parafina y colóquelo invertido sobre el orificio de 15 milímetros en la placa de 35. A continuación, añada otro mililitro de medio para alimentar los cultivos a largo plazo. Reemplace un tercio del medio sin suero cada dos o tres días.

Después de cinco a siete días en cultivo, se añade citosina arabinósido (Ara C) a una concentración final de cinco micromoles para prevenir la proliferación glial. Las siguientes imágenes apareadas de neuronas hipocampales vivas representativas muestran tanto una imagen de contraste de interferencia diferencial como una micrografía fluorescente correspondiente. Cada una de estas células ha sido transfectada con EGFP, tubulina y DS Red 2 en vectores PA.

En la etapa uno, las neuronas se adhieren inicialmente y, transcurrido un período de aproximadamente un día, emiten lamelipodios en forma de lámina y filopodios en forma de dedos alrededor del perímetro del cuerpo celular. En la etapa dos, las protrusiones iniciales se diferencian en varios neuritos que emergen del cuerpo celular, los cuales generalmente permanecen con una longitud de entre 30 y 50 micrones. En la etapa tres, de forma estocástica, uno de los neuritos comienza a alargarse rápidamente para convertirse en el axón.

Las otras neuritas permanecen cortas y se denominan procesos menores. La mayoría de las neuronas hipocampales y corticales progresan a la etapa tres entre dos y tres días en cultivo. Durante la etapa cuatro, que ocurre en la semana o dos siguientes, los procesos menores se engrosan, alargan y ramifican para convertirse en las dendritas; aquí, estas se muestran en verde. Mientras tanto, el axón se adelgaza a medida que continúa creciendo y ramificándose entre las dos y tres semanas.

En cultivo, las dendritas se diferencian formando espinas dendríticas, pequeñas protuberancias a lo largo de las dendritas. Las neuronas en la etapa cinco variarán en su forma y tamaño, pero la mayoría debería atravesar esta serie de etapas de desarrollo. Las neuronas transfectadas podrían no progresar a través de estas etapas si la sobreexpresión de proteínas interrumpe el desarrollo neuronal.

Además, las neuronas pueden no progresar a través de todas las etapas del desarrollo. Si las laminillas no se limpian adecuadamente o la polilisina no se adhiere correctamente, también puede producirse una proliferación extensa de glía, especialmente si no se utiliza una C. Esta es una imagen de contraste de fase de un cultivo de dos semanas de antigüedad en el que la glía ha sobrecrecido el cultivo en los cultivos a largo plazo.

Cambiar el medio con demasiada frecuencia o no con la suficiente frecuencia también puede comprometer la viabilidad de las neuronas. Esta es una imagen de contraste de fase de un cultivo en el que la mayoría de las neuronas han muerto y las neuronas restantes presentan cuerpos celulares encogidos y prolongaciones con forma de cuentas. Para comparación, esta es una imagen de contraste de fase de neuronas hipocampales sanas a las dos semanas en cultivo. Observe los cuerpos celulares más grandes y la ausencia de engrosamientos en las prolongaciones.

Además, en esta etapa, los procesos dendríticos se han engrosado y existe una extensa red de procesos axonales. Una vez dominado, el aislamiento embrionario, cortical y la disección, transfección y siembra de toda una camada de fetos puede realizarse en dos horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las neuronas hipocampales y corticales son muy sensibles a la perturbación mecánica.

Asimismo, es importante mantener las soluciones lo más frías posible durante el aislamiento de neuronas para mantener baja la actividad metabólica. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como imágenes de células vivas y grabación fisiológica de la actividad, con el fin de responder preguntas adicionales, como cómo las proteínas de fusión fluorescentes de interés se segregan a diferentes regiones de la neurona. Si la localización de proteínas está asociada con cambios en la actividad sináptica, o cómo las funciones de estas proteínas se ven afectadas por diferentes tratamientos farmacológicos.