Name: Nucleofection y cultivos primarios de neuronas del hipocampo de embriones de ratón y corticales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-24T17:50:00.000+00:00
Duration: 15 min 40 s
Description: Aprende a realizar nucleofección y cultivos primarios de neuronas del hipocampo y corteza de embriones de ratón. Este método permite estudiar el crecimiento axonal, la sinaptogénesis y la dinámica de proteínas fluorescentes en neuronas.

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Todos los procedimientos fueron aprobados por la Universidad de Wisconsin Comité de Cuidado de Animales y estaban en conformidad con las directrices del NIH. Agradecemos a la Dra. Katherine Kalil para el uso generoso de su dispositivo Nucleofector. También queremos agradecer a los miembros del laboratorio de Dent para comentarios sobre el protocolo. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH R01-NS064014, Fundación Dana y la Fundación de Whitehall EWD Christopher Viesselmann, Ballweg Jason y Derek Lumbard contribuyeron igualmente a este trabajo.

1. Preparación de cubreobjetos y Cámaras <ol><li> Preparación de cubreobjetos limpio y las cámaras es esencial para las culturas saludables. Los accesos directos no se debe tomar en cualquiera de estos pasos. </li><li> Lave el cubreobjetos (12 mm o 22 mm redondo, vidrio alemán - Carolina Marca auxiliar) durante la noche en ácido nítrico concentrado (HNO3) en un frasco de vidrio dedicado o un vaso. </li><li> Quitar los cubreobjetos de ácido nítrico y lavar ampliamente (5-7x) en agua destilada. </li><li> Separar el cubreobjetos y seca en una campana de flujo laminar o gabinete de bioseguridad. Una vez seco, esterilizarlos con luz UV durante 30 minutos. Lugar esterilizados cubreobjetos en placas de Petri estéril para su almacenamiento. Si las neuronas chapado en cubreobjetos de 12 mm directamente lugar cubreobjetos en una placa de 35 mm estériles y proceder a la Sección 2. </li><li> Cámaras de imágenes están construidas mediante la perforación de un agujero de 15 mm en la parte inferior de 35 mm placas de Petri (eliminar todas las rebabas) y adjuntar los cubreobjetos de limpiar con una mezcla de 3:1 de parafina y vaselina. </li><li> Derrita la parafina / mezcla de vaselina en un tubo cónico en un baño de agua hirviendo. Utilice un pincel pequeño y cubrir la parte inferior de la placa alrededor del agujero de 15 mm. Asegúrese de seguir revolviendo la parafina / mezcla de vaselina, ya que se separarán. Esto usualmente resulta en cámaras pegadas entre sí con una mayor concentración de la jalea de petróleo, que se convertirá en viscosa cuando los platos se colocan en la incubadora, lo que resulta en el desprendimiento de cubreobjetos. El resto de parafina / vaselina se puede almacenar a temperatura ambiente. </li><li> Coloque el plato boca abajo sobre una bandeja plana y colocar el cubreobjetos sobre el agujero. Calor en el horno 80 ° C hasta que la mezcla de parafina se funde (~ 10 minutos). Quite los platos sobre una superficie plana y dejar que el conjunto de la mezcla de parafina. </li><li> A su vez los platos una y esterilizar tanto el interior de las tapas y los fondos de las cámaras con luz UV. </li><li> Cubreobjetos de abrigo o regiones de vidrio de las cámaras con 1.0mg/mL poli-D-lisina (30kDa) en tampón de borato (borato de sodio 0.1 M, pH 8,5) durante una hora. Enjuague 3-5 veces con abundante cantidad de agua de grado de cultivo de tejidos desionizada. Asegúrese de eliminar todos los rastros de tampón borato. Seco y utilizar inmediatamente o almacenar cámaras / cubreobjetos para su uso posterior. Por lo general, el uso cubreobjetos limpiar el plazo de un mes de preparación. </li></ol> 2. Preparación de la disección neuronal y medio de cultivo <ol><li> Preparar el medio de la disección (DM) mediante la adición de cantidades adecuadas de HBSS 10x y 100x HEPES al agua de grado de cultivo de tejidos. Almacenar a 4 ° C. Mantener en hielo durante la disección. </li><li> El día antes de la disección de preparar el medio de chapado (PM) y el medio libre de suero (SFM). PM se compone de medio Neurobasal, suplemento de B27, 2 mM de glutamina, un 0,3% de glucosa, 37,5 mM de NaCl y 5% de suero fetal bovino (SFB). SFM se compone de medio Neurobasal, suplemento de B27, 2 mM de glutamina, un 0,3% de glucosa y 37,5 mM NaCl. </li><li> Haz sólo lo suficiente para la disección y guardar en un cultivo de tejido durante la noche con la tapa de la incubadora entreabierta para que la temperatura y el contenido de CO 2 del medio se equilibra. Añadimos la glucosa extra y aumentar la osmolaridad de aproximadamente 310mOsm con NaCl. Nos encontramos con las culturas de hacerlo mejor en una osmolaridad más fisiológica (osmolalidad Neurobasal suele ser de 205 245mOsm). </li></ol> 3. Cortical alimentador gliales Preparación de capas de los cultivos a largo plazo <ol><li> Si a largo plazo, las culturas se han de preparar, realizar esta parte del protocolo de dos a tres semanas antes de continuar con las disecciones cortical o del hipocampo. </li><li> Preparar el medio gliales (GM) con el MEM, el 0,3% de glucosa, penicilina / estreptomicina y 10% suero de caballo. </li><li> Eutanasia P1-P3 crías de ratón de un enfriamiento en hielo durante 5 minutos. Eliminar a las crías en el hielo y gas con 70% de etanol. Rápidamente decapitar con unas tijeras. Quite todo el cerebro a un plato que contiene frío DM (paso 2.1). </li><li> Retire los dos hemisferios cerebrales y las meninges. Impuestos Especiales de la corteza cerebral y trasladarlo a un nuevo plato que no contiene los medios de comunicación. Prepare las cortezas de cuatro cerebros total. </li><li> Picar la corteza con un cuchillo limpio, maquinilla de afeitar estéril tan fina como sea posible y eliminar el tejido picado con una pipeta de plástico a un tubo cónico de 50 ml que contienen 12 ml de frío DM. Añadir la tripsina y DNasa a la concentración final de 0,25% (1,5 ml) y 0,1% (1,5 ml), respectivamente. Incubar en un baño de agua a 37 ° C durante 10 minutos con agitación intermitente. </li><li> Retire el tubo que contiene el tejido cortical y limpiar a fondo con etanol al 70% antes de la puesta en el capó de cultivo de tejidos. Tejido cortical pipeta de arriba y abajo con una pipeta de 10 ml aproximadamente 10-15 horas, o hasta que la mayoría de los trozos de desaparecer. </li><li> Devuelva el tubo a 37 ° C en un baño de agua durante 10 minutos con intermitentes remolino. </li><li> Limpiar a fondo el tubo con etanol al 70% y traerlo de vuelta a la campana de cultivo de tejidos. Pipeta el tejido cortical de arriba a abajo con un 5 mL pipeta de aproximadamente 10-15 horas, o hasta que los trozos de desaparecer. </li><li> Agregar 15 ml de agua tibia GM y centrifugar a 200xg (1000 rpm) durante 10 minutos. </li><li> Desechar el sobrenadante, resuspender las células sedimentadas en 20 ml de agua dulce GM y contar con un hemocitómetro. Lámina 5-7.5x10 6 células en 15 ml de GM por 75 cm 2 matraz. </li><li> Después de un día y cada 2-3 días posteriores en la cultura, separar las células sueltas, golpeando el frasco contra su mano. Eliminar el medio junto con las células desalojados y reemplazar con 15 ml de agua dulce GM. </li><li> Glía se puede cosechar después de 1-2 semanas de crecimiento en los frascos, cuando están a punto 70-100% confluente. Para preparar cada cubreobjetos recubiertos con células gliales, lugar ácido nítrico 6 limpiar y esterilizar 25 mm cubreobjetos redondo en un plato de 10 cm, y el lugar 3 puntos de la mezcla de 3:1 de parafina / vaselina en cada portaobjetos en un patrón triangular con un pincel pequeño . El tratamiento de platos abiertos con luz UV durante 30 minutos. Cubra el cubreobjetos con 0,1 mg / ml de poli-D-lisina (30kDa) en tampón borato durante una hora, luego lave exhaustivamente (3 a 5 veces) con agua estéril de grado de cultivo de tejidos desionizada y dejar secar. </li><li> Retirar el frasco que contiene la glía de la incubadora, se elimina el medio y enjuague con 5 ml de pre-calentado tripsina / EDTA. Retire la solución de tripsina / EDTA en el matraz y pipeta de 3 ml de agua dulce precalentado tripsina / EDTA en el matraz. Incubar el matraz durante 1 minuto a 37 ° C antes de añadir 5 ml de GM para detener la tripsina. </li><li> Retire la glia del frasco por las reiteradas pipeteado 10-15 veces, y luego transferir los medios de comunicación a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 200xg (1000 rpm) durante 8 minutos. Eliminar el sobrenadante y agregar 10 ml de GM, cuentan las células, y la placa de 5x10 células 5 en 12,5 ml de GM por plato de 10 cm que contiene el cubreobjetos. </li><li> Intercambio con el medio fresco precalentado GM cada 2-3 días. El día antes de la disección de las neuronas, retire la GM y reemplazar con la ordenación forestal sostenible (sección 2.2). Utilice esta SFM gliales acondicionado en el paso 4.12, cuando las inundaciones cultivos corticales o del hipocampo. </li></ol> 4. Disección cortical y / o del hipocampo y la electroporación <ol><li> Eliminar la cantidad adecuada de soluciones nucleofection (Lonza), combinar, y la temperatura ambiente antes de comenzar la disección. Ya que la solución Nucleofection tiene una vida útil limitada cuando se combinan, sólo se combinan la cantidad necesaria para cada preparación (100 l por transfección). </li><li> La eutanasia a un ratón embarazadas en E15.5 con CO 2 (día de enchufe E0.5) y extraer el útero de una placa de Petri de 10 cm. Eliminar los fetos y decapitar al frío DM (sección 2.1). </li><li> Quite todo el cerebro en un plato aparte de frío DM y con una aguja de tungsteno dobladas, eliminar tanto neocortices. Quite la meninges con microforceps y cortezas lugar en nuevo plato frío de DM. Con una tijera pequeña iris o Wecker, quitar la corteza o el hipocampo y el lugar en un tubo Eppendorf de 1,5 ml lleno con 1,0 ml de frío DM. Mantenga este tubo en hielo. </li><li> Después de la disección de todas las cortezas o hipocampos, añadir 110 l de 2,5% de tripsina al tubo Eppendorf que contiene el tubo de tejido y colocarlo en una incubadora a 37 ° C durante 20 minutos. </li><li> Quitar la corteza sobrenadante y lavar o hipocampos con 1,0 mL PM (sección 2.2) suavemente invirtiendo el tubo Eppendorf. Repita el lavado dos veces, dejando 1 ml de la tarde en el tubo. </li><li> Triturar los trozos de 15 veces con una pipeta P1000, y eliminar las células sobrenadante / a un nuevo tubo de 15 mL cónico que contiene 4 ml de la tarde, dejando a los trozos que quedan en el tubo Eppendorf. </li><li> Girar el tubo de 15 ml en 20xg (350rpm) durante 7 minutos con el freno de apagado. Descartar el sobrenadante y añadir 100 ml de premezcla, la solución de sala de nucleofection temperatura (Lonza) para cada uno de transfección. Triturar 5 veces con un suave movimiento hacia arriba y abajo de la pipeta P1000. </li><li> Eliminar 100 L de la solución nucleofection / célula mezcla a cada nuevo tubo Eppendorf y añadir la cantidad apropiada de ADN. A largo plazo las culturas que utilizan generalmente 1-2μg de ADN por la transfección. Sin embargo, esta etiqueta sólo una pequeña proporción &lt;10% de las neuronas en la cultura. Por lo general, el uso de 5-10μg de DNA por transfección si desea una mayor eficiencia de transfección de la cultura a corto plazo. Hemos utilizado hasta un total de 40μg de ADN cuando la transfección con dos plásmidos diferentes. Los plásmidos son almacenados en buffer TE a 1 g / mL. </li><li> Añadir la suspensión de células / ADN a la cubeta (Lonza) y electroporar las células en el Nucleofector (Lonza), mediante el programa S-005 (sistema nervioso central del ratón neuronas). </li><li> Trabajando rápidamente, añadir 500 l de PM pre-calentado y equilibrada a la cubeta y remover la solución / células a un nuevo tubo Eppendorf de 1,5 ml. Añadir PM suficiente para reducir el volumen de cada transfección de 1,0 ml. Contar las células con un hemocitómetro y la placa en 3-5x10 3 células / cm 2 para los cultivos jóvenes, o 5-10x10 3 células / cm 2 para los cultivos a largo plazo. &lt;/ Li&gt; </li><li> A corto plazo las culturas, las inundaciones las placas de cultivo de 35 mm con 2,0 ml de calentado, CO 2-equilibrio SFM después de una hora de la siembra. Si se utiliza cubreobjetos, se elimina la mitad de la PM y reemplazarla con la ordenación forestal sostenible, y luego repetir dos veces más. Cualquiera de las inundaciones de las cámaras de imagen o el lavado de los resultados cubreobjetos en un contenido muy bajo en suero (&lt;0,5%). A corto plazo las culturas no necesitan ser cultivadas con una capa de alimentación gliales y no necesitan volver a ser alimentado. </li><li> De cultivos a largo plazo, eliminamos las células de un cubreobjetos cubiertos con tres puntos de parafina / vaselina e invertirlo en el agujero de 15 mm en la placa de 35 mm, una hora después de la siembra inicial. Dos mililitros de la ordenación forestal sostenible acondicionado en el plato gliales se añade a la cámara de imágenes. Para alimentar a los cultivos de largo plazo, se elimina un tercio de la ordenación forestal sostenible, cada 2-3 días y sustituirla por nueva, previamente calentada y CO 2-equilibrada ordenación forestal sostenible. </li></ol> 5. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2373/2373fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Que viven las neuronas del hipocampo en las sucesivas etapas de desarrollo. Imágenes pareadas de representante vivo las neuronas del hipocampo se muestran tanto como una imagen de contraste de interferencia diferencial y una micrografía fluorescente correspondiente. Cada una de estas células ha sido transfectadas con EGFP-tubulina y DsRed2 en vectores pCAX. Las neuronas fueron estudiados en los próximos días in vitro (DIV): Etapa 1 (1DIV), nivel 2 (1DIV), Etapa 3 (2DIV), Etapa 4 (11DIV) y Etapa 5 (32DIV). Barra de escala es 20μm.

<ol><li>Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Chapter 13. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoslin%2C+K+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Goslin, K., Banker, G. , The MIT Press. 339-370 (1998).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+and+movement+of+microtubules+in+axonal+growth+cones+and+developing+interstitial+branches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches.</a> J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).</li>
<li>Dent, E. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+neuronal+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of neuronal cytoskeleton.</a> Methods Enzymol. 361, 390-407 (2003).</li>
<li>Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+are+required+for+cortical+neurite+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Filopodia are required for cortical neurite initiation.</a> Nat Cell Biol. 9, 1347-1359 (2007).</li>
<li>Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dynamic+microtubule+invasion+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines.</a> J Neurosci. 28, 13094-13105 (2008).</li>
<li>Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+Ena%2FVASP+proteins+for+filopodia+formation+in+neurons+and+in+function+downstream+of+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Critical role of Ena/VASP proteins for filopodia formation in neurons and in function downstream of netrin-1.</a> Neuron. 42, 37-49 (2004).</li>
<li>Meberg, P. J., Miller, M. W. Chapter 7. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeberg%2C+PJ+%22Neurons%3A+Methods+and+Applications+for+the+Cell+Biologist%22">Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist</a>. Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. , Academic Press. Volume 71 112-129 (2003).</li>
<li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li>
<li>Zeitelhofer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+of+mammalian+neurons+via+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection.</a> Nat Protoc. 2, 1692-1704 (2007).</li>
</ol>

Este protocolo para el cultivo de neuronas de ratón embrionario del hipocampo y la corteza se desarrolló como una modificación del protocolo de Banker, que utiliza ratas 1,2 neuronas. Hemos utilizado este protocolo para el ratón y el cultivo de neuronas de hámster, así 3,4,5,6,7. Este protocolo funciona igualmente bien para las neuronas del hipocampo y el neocórtex tanto y es similar a un protocolo publicado por Meberg y Miller 8. En general, usamos las neuronas del hipocampo a largo plazo la cultura, ya que están bien caracterizados y un sistema de modelo más establecido. Además, es probable que contienen una población más homogénea de las neuronas de la neocorteza. Sin embargo, las neuronas neocortical cultivadas usando este protocolo también sobreviven y se diferencian de manera similar (datos no publicados). Nosotros usamos las neuronas del hipocampo y el neocórtex para el cultivo a corto plazo. La disección del neocórtex también da lugar a neuronas mucho más (1.5x10 6 neuronas por cada par de cortezas) que la disección del hipocampo (2.5x10 5 neuronas por cada par de hipocampo), que hace que sea una mejor elección de material para el Western Blot, por ejemplo. Como con cualquier otro cultivo primario, es esencial para minimizar el tiempo que se tarda desde la muerte del animal para el revestimiento de las células. Por lo general, se llevará a 20.10 disecciones para convertirse en rápido y consistente en la disección y de las planchas. Además, cuando se trabaja con la Nucleofector Lonza, es fundamental trabajar con rapidez durante el proceso de electroporación, como la viabilidad de las neuronas disminuye rápidamente si se dejan en la memoria nucleofection. Gran parte de nuestra imagen se lleva a cabo con un total de microscopía de fluorescencia de reflexión interna (TIRFM). Este tipo de microscopio es sólo capaz de obtener imágenes de varios cientos de nanómetros más allá de los cubreobjetos. Por lo tanto, las áreas de las neuronas que con frecuencia la imagen, el cono de crecimiento axonal y las espinas dendríticas, es necesario adherirse directamente a la cubreobjetos. Por lo tanto, utilizar cultivos de baja densidad que requieren alimentación gliales a largo plazo de la cultura. Hemos utilizado la más alta densidad de cultivos (&gt; 2x10 4 células / cm 2), sin capas de alimentación gliales de cultivos a largo plazo y encontró que sobreviven muy bien con la alimentación poco. Sin embargo, las espinas dendríticas de las neuronas son a menudo muy lejos de la imagen en el sustrato de TIRFM, a pesar de que se puede detectar fácilmente con un amplio campo de la microscopia o microscopía confocal. En la mayoría de nuestros estudios nos transfectar neuronas de las placas, y se han fotografiado las proteínas fluorescente marcada con un máximo de tres meses en la cultura. Esta expresión a largo plazo de las proteínas marcadas con fluorescencia nos da confianza en que mediante el uso de bajas concentraciones de ADN (1-2μg) no estamos produciendo artefactos sobreexpresión en las neuronas. Sin embargo, este procedimiento también se puede utilizar para estudiar si la sobreexpresión de las proteínas de grandes cantidades de ADN se utilizan (10-20 microgramos). Los plásmidos que se utiliza para transfectar neuronas suelen contener proteínas EGFP o mCherry de fusión, aunque también marca el citoplasma neuronal con DsRed2 o EGFP solo. Esta técnica de electroporación trabaja bien con un número de vectores. Nosotros preferimos los plásmidos que contienen un promotor β-actina con un potenciador de CMV y β-globina cola poli-A (pCAGGs o plásmidos pCAX) 9, debido a los relativamente altos niveles de expresión, y el hecho de que son bien tolerados por las neuronas tanto en la cultura de corto y largo plazo. En general, las proteínas comienzan a expresarse dentro de unas 4 horas de la siembra y alcanzar niveles suficientes para obtener imágenes de un plazo de 10-24h 10. Hemos utilizado con éxito por CMV impulsada por el promotor de plásmidos en corto plazo, las culturas, pero han encontrado que pueden provocar altos niveles de sobre-expresión que matan a las neuronas en el largo plazo la cultura. Sin embargo, hemos encontrado que el condicionamiento gliales de cultivos de baja densidad ayuda a la supervivencia de las neuronas transfectadas con plásmidos promotor CMV impulsada, en comparación con una mayor densidad (no gliales Fed) culturas.

* La mayoría de los reactivos que se almacenan a -80 ° C se puede almacenar a -20 ° C también. El almacenamiento a -80 ° C se alarga su vida útil y los resultados en las culturas un poco más consistente.

nucleofection y cultivos primarios de neuronas del hipocampo de embriones de ratón y corticales

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Las neuronas del hipocampo y la corteza se han utilizado ampliamente para estudiar el sistema nervioso central (SNC) la polarización neuronal, axón / dendrita y la formación de sinapsis y la función. Una de las ventajas del cultivo de estas neuronas es que fácilmente se polarizan, la formación de los axones y las dendritas distintivo, sobre un sustrato de dos dimensiones en densidades muy bajas. Esta propiedad les ha hecho extremadamente útil para la determinación de muchos aspectos del desarrollo neuronal. Además, al proporcionar acondicionado gliales de estas neuronas van a seguir para desarrollar, formar conexiones sinápticas funcionales y sobrevivir durante varios meses en la cultura. En este protocolo se plantean una técnica de disecar, la cultura y transfectar neuronas embrionarias de ratón del hipocampo y la corteza. Transfección se lleva a cabo electroporating ADN en las neuronas de las placas, a través de nucleofection. Este protocolo tiene la ventaja de expresar la fluorescencia de etiquetado proteínas de fusión en el desarrollo temprano (~ 4 8 horas después de la siembra) para estudiar la dinámica y función de las proteínas durante el axón de polarización, y la ramificación. También hemos descubierto que la transfección de las placas, solo mantiene la expresión fluorescente marcada con la proteína de fusión en los niveles apropiados para la imagen durante toda la vida de la neurona (&gt; 2 meses en la cultura). Por lo tanto, esta metodología es útil para el estudio de la localización y función de proteínas durante el desarrollo del SNC, con poco o ningún trastorno de la función neuronal.

Este protocolo describe los pasos necesarios para analizar, a través de la electroporación y transfectar neuronas del hipocampo del ratón y la cultura cortical. Corto plazo, las culturas pueden ser utilizados para los estudios del axón y la orientación, mientras que a largo plazo las culturas pueden ser utilizados para estudios de la sinaptogénesis y el análisis espina dendrítica.

Nucleofection y cultivos primarios de neuronas del hipocampo de embriones de ratón y corticales

Las neuronas hipocampales y corticales se han utilizado ampliamente para estudiar la polarización neuronal del sistema nervioso central (SNC), el crecimiento axonal y dendrítico, y...

Las neuronas hipocampales y corticales se han utilizado ampliamente para estudiar la polarización neuronal del sistema nervioso central, el crecimiento de axones y dendritas, y la formación y función de sinapsis. Una ventaja del cultivo de estas neuronas es que se polarizan fácilmente, formando axones y dendritas distintivos sobre un sustrato bidimensional a densidades muy bajas. Este video demuestra una técnica para diseccionar, cultivar y transfectar neuronas embrionarias hipocampales y corticales de ratón mediante nucleofección, lo que permite la expresión de proteínas de fusión marcadas con fluoróforo desde las primeras etapas del desarrollo, aproximadamente entre cuatro y ocho horas después de sembrarlas. La expresión de las proteínas marcadas con fluoróforo se mantiene durante toda la vida de la neurona, por más de dos meses en cultivo. Esto posibilita el estudio de la función proteica durante eventos tempranos del desarrollo, como el crecimiento axonal, y eventos posteriores, como la sinaptogénesis y la plasticidad sináptica.Primero, las células gliales se aíslan de los hemisferios corticales de ratones posnatales de uno a tres días de edad y se siembran en frascos. Después de alcanzar una confluencia del 70 al 100 %, las células gliales se vuelven a sembrar sobre cubreobjetos de vidrio.Luego, se aíslan neuronas del hipocampo o la corteza de ratones E 15.5 y se transfectan mediante nucleofección con plásmidos que codifican proteínas de fusión fluorescentes, como la proteína fluorescente roja. Las neuronas transfectadas se siembran entonces en cámaras de imagen para estudios a corto plazo. Para cultivos a largo plazo, se invierten células gliales sobre laminillas de vidrio encima de cultivos de hipocampo o corteza para proporcionar soporte trófico, y luego se pueden observar neuronas individuales para mostrar la localización dinámica de las proteínas de fusión a lo largo de los axones o dendritas de las neuronas.Hola, soy Eric Dent, profesor asistente de anatomía en la Universidad de Wisconsin Madison. Hoy, tres de mis estudiantes universitarios, Chris Wezelman, Jason Bwe y Derek Lombard, van a demostrar un procedimiento para aislar, sembrar y mantener cultivos de neuronas corticales e hipocampales para cultivo a corto y largo plazo. Estos cultivos pueden utilizarse para estudiar la dinámica de proteínas de fusión fluorescentes durante todo el desarrollo neuronal, desde el crecimiento inicial de los neuritos hasta el desarrollo de axones y dendritas y la sinaptogénesis.Para preparar las cámaras para la obtención de imágenes de neuronas embrionarias de hipocampo y corteza de ratón, comience con placas de Petri de 35 milímetros que tengan orificios de 15 milímetros perforados en la base y todos los rebabas eliminados. Derrita una mezcla de parafina y vaselina en proporción tres a uno en un tubo cónico colocándolo en un baño de agua hirviendo.Luego, use un pincel pequeño para recubrir la parte inferior del recipiente alrededor del orificio. Asegúrese de revolver la mezcla de parafina y vaselina entre las cámaras, ya que esta se separará. Coloque la laminilla sobre el orificio.Una vez que se hayan preparado todos los recipientes, colóquelos en un horno a 80 grados Celsius hasta que se derrita la mezcla de parafina. Esto debería tardar aproximadamente 10 minutos. Luego, retire los recipientes y colóquelos sobre una superficie plana y deje que la mezcla de parafina solidifique durante al menos un minuto.Dar la vuelta a las placas y colocarlas bajo una campana. Encender la luz UV durante 30 minutos para esterilizar tanto el interior de las tapas como la base de las cámaras. A continuación, recubrir.Incube las cubreobjetos de la cámara con poli-D-lisina durante una hora. Luego, enjuague minuciosamente las cubreobjetos recubiertas de tres a cinco veces con agua desionizada estéril filtrada para eliminar todos los rastros de tampón borato. Después del enjuague final, use un vacío para secar las cámaras. Estas pueden usarse inmediatamente o almacenarse en una sala de cultivo de tejidos para su uso posterior.Las cámaras recubiertas deben usarse dentro de una semana después de su preparación si se van a realizar cultivos a largo plazo. Las capas alimentadoras de glía cortical deben iniciarse de dos a tres semanas antes de continuar con las disecciones corticales o hipocampales. Coloque los cerebros de cuatro crías de ratón P1 a P3 en un recipiente que contenga medio de disección frío y colóquelo bajo el microscopio estereoscópico.Retire los bulbos olfativos, los dos hemisferios cerebrales y las meninges. Transfiera los hemisferios a un nuevo recipiente que no contenga medio. Usando una cuchilla estéril limpia, pique las cortezas lo más finamente posible.Luego, con una pipeta de plástico, transfiera el tejido picado a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 12 mililitros de medio de disección frío. Añada tripsina y ADN hasta concentraciones finales de 0,25 % y 0,1 %, respectivamente. Incube en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 10 minutos con agitación intermitente.Tras la incubación, retire el tubo del baño de agua y límpielo cuidadosamente con etanol al 70 % antes de introducirlo en la cabina de cultivo de tejidos. Pipetee el tejido cortical hacia arriba y hacia abajo.Con una pipeta de 10 mililitros, aspire aproximadamente de 10 a 15 veces o hasta que desaparezca la mayor parte de los fragmentos, luego regrese el tubo al baño de agua durante otros 10 minutos con agitación intermitente. Nuevamente, limpie cuidadosamente el tubo con etanol al 70 % y llévelo de vuelta a la campana de cultivo de tejidos.Pipetee el tejido cortical hacia arriba y hacia abajo. Como antes, esta vez con una pipeta de cinco mililitros, agregue 15 mililitros de medio glial tibio y centrifugue a 1000 RPM durante 10 minutos. Descarte el sobrenadante y resuspenda las células del sedimento en 20 mililitros de medio glial fresco.Utilice un citómetro de hemocitos para contar las células. A continuación, siembre de cinco a 7,5 millones de células en 15 mililitros de medio glial por matraz de 75 centímetros cuadrados. Coloque las células en el incubador a 37 grados Celsius y, después de un día, y cada dos o tres días posteriores en cultivo, desprenda las células sueltas golpeando el matraz contra la superficie de la cabina.Retire el medio junto con cualquier célula desprendida y sustitúyalo por 15 mililitros de medio glial fresco. El medio glial se puede recolectar después de una a dos semanas de crecimiento en los frascos, cuando estén a punto de alcanzar la confluencia al 100 %. Para preparar portaobjetos individuales recubiertos con glía, comience colocando seis portaobjetos limpiados con ácido nítrico y esterilizados.Cubos de 25 milímetros redondos en un recipiente de 10 centímetros y, utilizando un pincel pequeño, coloque tres puntos de la mezcla tres a uno de parafina y vaselina petrolera. Sobre cada cubreobjetos en un patrón triangular. Coloque dos puntos en los bordes del cubreobjetos para fijarlo al recipiente.Someta los cultivos abiertos a luz UV durante 30 minutos. Recubra las laminillas con poli-D-lisina durante una hora. Luego lave abundantemente tres a cinco veces con agua desionizada estéril filtrada y deje secar; retire las células gliales del incubador.Deseche el medio y lave con cinco mililitros de tripsina precalentada. Añada tres mililitros de tripsina al frasco e incube durante un minuto a 37 grados Celsius. Una vez que las células se hayan desprendido, añada cinco mililitros de medio glial para detener la acción de la tripsina.Retire el GL del matraz pipeteando de arriba abajo de 10 a 15 veces. Luego, transfiera el medio a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a 1000 RPM durante ocho minutos. Tras la centrifugación, suspenda las células en 10 mililitros de medio glial.Luego, después de contar las células, siembre cinco veces 10 a la quinta células en 12,5 mililitros de medio glial por placa de 10 centímetros que contenga las laminillas. Cambie el medio con medio glial fresco y precalentado cada dos o tres días, el día anterior a la disección de las neuronas. Retire el medio glial y sustitúyalo por medio sin suero.Utilice posteriormente este medio libre de suero condicionado por células gliales. Al inundar cultivos corticales o hipocampales, se añade una C a una concentración final de cinco micromolares. Con el fin de prevenir la proliferación glial de los reactivos de transfección por nucleoafectación según se indica en las instrucciones del fabricante, luego caliente la solución a temperatura ambiente.Coloque un recipiente que contenga cerebros de ratón E 15.5 en medio de disección frío. Bajo el microscopio de disección, utilice una aguja de tungsteno doblada para retirar ambas neocortezas. Luego, con pinzas microquirúrgicas, elimine las meninges y coloque las cortezas en un nuevo recipiente con medio de disección frío.El hipocampo y la corteza son visibles a lo largo del lado medial del hemisferio cerebral con tijeras de iris pequeñas. Retire cuidadosamente el hipocampo. A continuación, retire la corteza restante.Repita la disección en cerebros de toda la camada. Coloque las cortezas del hipocampo en tubos microcentrífugos separados de 1,5 mililitros, cada uno lleno con un mililitro de medio de disección frío. Coloque los tubos en hielo tras diseccionar todas las cortezas en los hipocampos.Añada 110 microlitros de tripsina al 2,5 % a los tubos de microcentrífuga que contienen el tejido y coloque los tubos en un incubador a 37 grados Celsius durante 20 minutos. Utilizando una pipeta P1000, retire tanto líquido como sea posible del tubo. A continuación, añada un mililitro de medio de siembra a cada tubo y lave el tejido invirtiendo suavemente el tubo de microcentrífuga.Repita el lavado dos veces. Después del lavado final, agregue un mililitro de medio de siembra. Utilice una pipeta P1000 para resuspender los fragmentos 15 veces. Luego, transfiera el sobrenadante y las células a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros que contenga cuatro mililitros de medio de siembra, dejando cualquier fragmento que permanezca en un tubo microfuga.Centrifugar el tubo de 15 mililitros a 350 RPM durante siete minutos con la frenada desactivada tras la centrifugación, desechar el sobrenadante y añadir 100 microlitros de solución de nucleoafectación premezclada a temperatura ambiente. Pase la mezcla arriba y abajo cinco veces con la pipeta para mezclar; a continuación, transfiera 100 microlitros de la solución de nucleoafectación y la mezcla celular a cada nuevo tubo microfuge que contenga una cantidad adecuada de ADN, uno a dos microgramos de ADN por transfección. Para cultivos a largo plazo, esto marcará menos del 10 % de las neuronas en el cultivo.Aunque cinco a 10 microgramos de ADN por transfección darán como resultado una eficiencia de transfección más alta para el cultivo, agregue la suspensión celular y la mezcla de ADN a un vial de electro poración. Luego coloque el vial en el electro. Para neuronas del SNC de ratón, configure el programa del nucleo efector en oh 0 0 5 y, trabajando rápidamente, agregue 500 microlitros del medio de siembra precalentado y equilibrado al vial y transfiera la solución celular a un nuevo tubo microfuga de 1,5 mililitros.Añada medio de siembra suficiente para llevar el volumen de cada transfección a un mililitro. Después de contar las células, siembre de tres a cinco veces 10 a la tercera células por centímetro cuadrado para cultivos jóvenes, o de cinco a diez veces 10 a la tercera células por centímetro cuadrado para cultivos a largo plazo, generalmente cinco veces 10 a la quinta o una vez 10 a la sexta. Las células se utilizan por transfección para preparar cultivos a corto plazo.Una hora después de sembrar, inunde las placas de cultivo de 35 milímetros con dos mililitros de medio sin suero, equilibrado con dióxido de carbono y tibio. Las cámaras de imagen resultan en un contenido muy bajo de suero, inferior al 0,5 %. Los cultivos a corto plazo no necesitan ser cultivados con una capa de alimentación glial y no necesitan ser repobrecidos. Para preparar cultivos a largo plazo, agregue un mililitro de condición glial al medio sin suero.Retire un cubreobjetos recubierto con tres puntos de vaselina de parafina y colóquelo invertido sobre el orificio de 15 milímetros en la placa de 35. A continuación, añada otro mililitro de medio para alimentar los cultivos a largo plazo. Reemplace un tercio del medio sin suero cada dos o tres días.Después de cinco a siete días en cultivo, se añade citosina arabinósido (Ara C) a una concentración final de cinco micromoles para prevenir la proliferación glial. Las siguientes imágenes apareadas de neuronas hipocampales vivas representativas muestran tanto una imagen de contraste de interferencia diferencial como una micrografía fluorescente correspondiente. Cada una de estas células ha sido transfectada con EGFP, tubulina y DS Red 2 en vectores PA.En la etapa uno, las neuronas se adhieren inicialmente y, transcurrido un período de aproximadamente un día, emiten lamelipodios en forma de lámina y filopodios en forma de dedos alrededor del perímetro del cuerpo celular. En la etapa dos, las protrusiones iniciales se diferencian en varios neuritos que emergen del cuerpo celular, los cuales generalmente permanecen con una longitud de entre 30 y 50 micrones. En la etapa tres, de forma estocástica, uno de los neuritos comienza a alargarse rápidamente para convertirse en el axón.Las otras neuritas permanecen cortas y se denominan procesos menores. La mayoría de las neuronas hipocampales y corticales progresan a la etapa tres entre dos y tres días en cultivo. Durante la etapa cuatro, que ocurre en la semana o dos siguientes, los procesos menores se engrosan, alargan y ramifican para convertirse en las dendritas; aquí, estas se muestran en verde. Mientras tanto, el axón se adelgaza a medida que continúa creciendo y ramificándose entre las dos y tres semanas.En cultivo, las dendritas se diferencian formando espinas dendríticas, pequeñas protuberancias a lo largo de las dendritas. Las neuronas en la etapa cinco variarán en su forma y tamaño, pero la mayoría debería atravesar esta serie de etapas de desarrollo. Las neuronas transfectadas podrían no progresar a través de estas etapas si la sobreexpresión de proteínas interrumpe el desarrollo neuronal.Además, las neuronas pueden no progresar a través de todas las etapas del desarrollo. Si las laminillas no se limpian adecuadamente o la polilisina no se adhiere correctamente, también puede producirse una proliferación extensa de glía, especialmente si no se utiliza una C. Esta es una imagen de contraste de fase de un cultivo de dos semanas de antigüedad en el que la glía ha sobrecrecido el cultivo en los cultivos a largo plazo.Cambiar el medio con demasiada frecuencia o no con la suficiente frecuencia también puede comprometer la viabilidad de las neuronas. Esta es una imagen de contraste de fase de un cultivo en el que la mayoría de las neuronas han muerto y las neuronas restantes presentan cuerpos celulares encogidos y prolongaciones con forma de cuentas. Para comparación, esta es una imagen de contraste de fase de neuronas hipocampales sanas a las dos semanas en cultivo. Observe los cuerpos celulares más grandes y la ausencia de engrosamientos en las prolongaciones.Además, en esta etapa, los procesos dendríticos se han engrosado y existe una extensa red de procesos axonales. Una vez dominado, el aislamiento embrionario, cortical y la disección, transfección y siembra de toda una camada de fetos puede realizarse en dos horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las neuronas hipocampales y corticales son muy sensibles a la perturbación mecánica.Asimismo, es importante mantener las soluciones lo más frías posible durante el aislamiento de neuronas para mantener baja la actividad metabólica. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como imágenes de células vivas y grabación fisiológica de la actividad, con el fin de responder preguntas adicionales, como cómo las proteínas de fusión fluorescentes de interés se segregan a diferentes regiones de la neurona. Si la localización de proteínas está asociada con cambios en la actividad sináptica, o cómo las funciones de estas proteínas se ven afectadas por diferentes tratamientos farmacológicos.

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Investigación

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