Name: Microdisección de Negro Araña Viuda producción de las glándulas de seda (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T23:59:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprende a aislar las siete glándulas productoras de seda del abdomen de arañas viuda negra mediante microdisección. Este método permite extraer tejidos puros para estudios moleculares y bioquímicos de la producción de seda.

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Este trabajo fue apoyado por una subvención NSF RUI de MCB-0950372 titulado Caracterización molecular de la Seda Negro Araña Viuda.

1. Anestesiar a la araña y el aislamiento del abdomen <ol><li> La transferencia de la araña de un frasco de vidrio en una caja de cartón forrada con plástico (Figura 1). Por lo general recogen las arañas de las pilas de madera, garajes o arbustos y la casa en el laboratorio en frascos de vidrio. Debido a que la araña no puede subir por las paredes de plástico, que proporciona un método eficiente para la transferencia de la araña de un frasco de vidrio o lata de café en un frasco más pequeño para fines de anestesia. Durante la manipulación de la araña en este punto, usted debe usar dos pares de guantes de látex o guantes de jardinería para la seguridad. </li><li> Mientras que la araña se encuentra en la caja forrada de plástico, el enfoque de la araña de su espalda y dejó caer la araña en el vial de la cultura de plástico. Después de la araña entra en el vial, inmediatamente coloque el enchufe en la parte superior (fig. 1B). Le recomendamos que utilice un vial que es de aproximadamente 101,6 mm x 31,75 mm (L x D). Esto minimiza la cantidad de dióxido de carbono necesarios para el paso de anestesia. </li><li> Anestesiar a la araña con la introducción de gas de dióxido de carbono a 10.5 libras por pulgada cuadrada de 10 min (fig. 1C). Esta cantidad de gas sólo se va a eliminar la araña a cabo por alrededor de 5 minutos, así que después de anestesia que de inmediato debe proceder a los pasos 1.4-1.5. </li><li> Coloque la araña anestesiados en un plato pequeña disección y el uso de fórceps para la posición de la araña a la cara dorsal (reloj de arena hacia abajo). </li><li> Clip del pedicelo (tallo delgado que conecta el cefalotórax y el abdomen) para liberar el abdomen del resto de la araña (Figura 1D). Guarde el cefalotórax en el congelador durante la noche en una placa de Petri y deseche después de congelado al día siguiente. Tenga cuidado al mover el cefalotórax como los colmillos de la araña están presentes en este segmento. </li><li> Fije el abdomen con el material Sylgard en el plato pequeña disección utilizando un alfiler insecto. Inserte el pasador de los insectos a través del agujero hecho en el recorte del pedúnculo (Figura 1). Esto puede ser fácilmente identificado como el sitio donde el líquido está saliendo de la saturación del pedúnculo. Asegúrese de que la hilera (extremo opuesto del pedúnculo) está orientado hacia la parte inferior (la más cercana a usted). </li></ol> 2. La eliminación del exoesqueleto <ol><li> Hacer la primera incisión a través del exoesqueleto con un par de micro tijeras, empezando por el agujero de la saturación del pedúnculo. Corte lateralmente hasta la cara dorsal se alcanza en ambos lados (Figura 1 F). Con un par de pinzas, pele el segmento de exoesqueleto anterior e insertar un segundo pasador en este lugar. Después de la inserción de la espiga en segundo lugar, a su vez la bandeja de disección de caudal (90 °) a partir de los cortes laterales inicial y seguir cortando hasta que las hileras se alcanzan (Figura 1G). Esta incisión será perpendicular o vertical para el corte lateral inicial. No corte a través de las hileras, cuando la incisión vertical se hace (en relación posterior a la del reloj de arena y tiene un aspecto circular). La falta de insertar el pasador de segundo resultado en el abdomen de girar cuando las incisiones verticales se llevan a cabo. </li><li> Sumerja el abdomen en la disección de solución tampón (0,1 M de cloruro de sodio, citrato de sodio 0,015 M, un 0,1% dietil pirocarbonato). </li><li> Pelar el exoesqueleto restantes a partir de la incisión inicial, lateral. Cuando se termine esto, el tejido graso debe ser claramente visible (Figura 1H). </li></ol> 3. El aislamiento de las glándulas productoras de seda <ol><li> Utilizando unas pinzas empiezan las burlas de distancia de la capa de grasa (Figura 1H). La grasa tiene un color blanquecino de aspecto amarillento. Continúe hasta que la mayor parte de la grasa se elimina y las glándulas de seda son claramente visibles. La glándula tubuliform consta de tres pares de mucho tiempo, tubos cilíndricos que son abundantes en la cavidad abdominal. El ampullate principales, que se encuentra en parejas, es una ampolla grande, forma de media luna con una larga cola de contorneado distal y proximal de un conducto que la disminución de anchura que se acerca a las hileras de la araña. El ampullate menores es muy similar en morfología a la ampullate importante, pero es significativamente menor. La glándula flagelliform, también se producen en pares, es redondo y multilobular de un tanque pequeño zig-zag del conducto que se extiende hacia abajo, hacia las hileras. La glándula agregada (que se encuentran en pares) es un muy grande, la glándula multinodular que tiene un conducto excretor muy grande que tiene grandes lóbulos, irregular en él. Las glándulas aciniform se producen en grandes cantidades y se asemejan a las proyecciones a corto, con forma de dedo pequeño. La glándula piriforme es la más pequeña glándula en el abdomen y tiene muchas vías compacta, cilíndrica que se asemejan a un ventilador con muchos pequeños conductos excretores que se extienden hasta las hileras. </li><li> Le recomendamos que quite las glándulas en el siguiente orden: tubuliform, ampullate importante, flagelliform, ampullate menor de edad, total, aciniform, y luego el piriforme (Figura 2A-B). </li><li> A partir de la tubuliform, se burlan de estas glándulas fuera del resto de thglándulas e - que debe estar sentado en la parte superior de las otras glándulas (Figura 2A). Hay tres pares de glándulas tubuliform en una sola araña. Les permiten flotar libremente, pero permanecer unidos a sus hileras de sus conductos. </li><li> A continuación, se burlan de distancia de las glándulas ampullate importante. Hay dos glándulas ampullate principales presentes en una araña. Durante el procedimiento de extracción, asegúrese de que los conductos de permanecer unidos a las glándulas (Figura 2A). </li><li> Seguir para molestar a los demás de las glándulas de distancia el uno del otro, trabajando con cuidado para evitar la perforación de cualquiera de las glándulas, sobre todo el conjunto y las glándulas flagelliform. Cada glándula debe ser de libre flotación todo el camino hasta su punto de salida en el exoesqueleto de las hileras. Estas glándulas se encuentran también en pares. Retire cada glándula apretando el conducto con una pinza y con mucho cuidado tirando hasta que se rompe con el punto de salida. El ampullate importante, flagelliform, ampullate menor de edad, y las glándulas agregado se encuentran en pares. Las glándulas aciniform piriforme y se producen en muchos pares más. </li><li> Retire cada glándula apretando el conducto con una pinza y con mucho cuidado tirando hasta que se rompe con el punto de salida por la hilera. Por lo general almacenar las glándulas húmedo, sin embargo, no añadimos tampón adicionales. </li><li> Como las glándulas se retiran, los coloca en el estéril pre-etiquetados de microcentrífuga de 1,5 ml. Glándulas individuales se muestran en la Figura 3-G. Mantenga estas glándulas en hielo y luego Flash congelarlos en nitrógeno líquido. Tras la congelación de flash en nitrógeno líquido, los colocan a -80 ° C para su almacenamiento. </li></ol> 4. Resultados representante Al extraer las glándulas diferentes, el cuidado extremo se debe tomar en la manipulación del flagelliform y las glándulas agregado, ya que estas dos estructuras pueden ser fácilmente perforados y dañados con las pinzas. Por otra parte, cabe destacar que morfológicamente las glándulas flagelliform y agregados son muy similares antes de su retirada y que a menudo se entrelazan unos con otros. Para evitar la contaminación cruzada de estos tejidos después de la retirada, el disector cuidadosamente burlan de estas estructuras de separación. Además, en la exposición inicial de las glándulas productoras de seda, las glándulas aciniform y piriforme será el más difícil de visualizar de inmediato debido a su menor tamaño y localización anatómica. A menudo no es la presencia de muchos huevos. Por otra parte, la atención de las necesidades adicionales que deben adoptarse cuando la eliminación de la glándula piriforme, ya que este tejido es muy pegajosa y con frecuencia se adhiere a su fórceps. Cuando este procedimiento se realiza correctamente, es posible obtener las siete glándulas productoras de seda de la araña solo de una manera altamente purificada. Por lo general, se puede recuperar cantidades de microgramos de RNA total y proteínas a partir de una disección de la araña sola. Un ejemplo del uso del ARN total de qPCR para examinar los niveles de ARNm de un gen tubuliform restringido fibroína, TuSp1, se muestra (Figura 4). Representante experimentos que involucran proteínas lisados ​​recogidos de las glándulas, por ejemplo en la solución de digestión tríptica seguido por el análisis de MS (también podrían ser utilizados para análisis MS / MS) o un análisis de composición de aminoácidos se muestra (Figura 5.6, respectivamente). <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1a.jpg" alt="Figura 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1a"><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1e.jpg" alt="Figura 1e" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1e"> Figura 1. Manipulación, anestesiar, y la eliminación del exoesqueleto del abdomen de una araña viuda negro femenino. A) La transferencia de la araña en una caja de cartón forrada con plástico para facilitar el movimiento de la araña en un frasco de plástico más pequeñas. B) Spider coloca en un frasco de plástico con tapón. C) La anestesia de la araña con el gas de dióxido de carbono. D) La separación del cefalotórax del abdomen utilizando micro tijeras. E) La inmovilización del abdomen en la bandeja de disección con alfileres de insectos. F) Vista después de una incisión lateral se hace con las tijeras y una parte del exoesqueleto se repicaron de nuevo con las pinzas. G) Las incisiones que se hizo el corte perpendicular al lateral inicial. H) La eliminación del exoesqueleto y la exposición de la capa de grasa. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Visualización de los siete diferentes glándulas productoras de seda, mientras permanezca intacto en el abdomen de la araña, así como los tejidos circundantes. A) Las imágenes de la tubuliform, ampullate importante, flagelliform, tejidos agregado, ampullate menores con un aumento de 12X. B) Imagen de la aciniform piriforme y glándulas con un aumento de 12X. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3a.jpg" alt="Figura 3a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3a"><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3e.jpg" alt="Figura 3e" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3e"> Figura 3. Fotografías de las siete glándulas productoras de seda después de su eliminación del abdomen. Todas las imágenes fueron captadas a 20X, con la excepción de la aciniform y las glándulas piriforme, que se realiza a 40X. Una de las principales)ampullate glándula; B) ampullate mayores y menores (lado derecho) para la comparación de tamaño; C) tubuliform; D) flagelliform; E) total; F) aciniform; G) piriforme. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Los resultados representativos del patrón de expresión del gen de la seda, TuSp1, después de examinar el TuSp1 niveles de mRNA en la producción de diferentes glándulas de seda (con exclusión de la glándula piriforme) utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) de aislamiento tras de ARN total de las glándulas. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Ejemplo de análisis de MS de extractos de proteínas obtenidos a partir de la glándula piriforme después de la digestión en solución tríptico. Nota: x2 representa 2 veces el aumento de la intensidad del espectro. Espectro de masas de iones de péptidos que corresponden a las regiones de la fibroína PySp1 se muestran con el símbolo #. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Resultado típico del perfil de composición de aminoácidos de las proteínas extraídas de la glándula tubuliform. Nota: ASX = Asp y Asn; GLX = Glu y Gln. Coloración azul refleja aminoácidos con grupos polares de la cadena lateral, mientras que la coloración roja representa los residuos de aminoácidos con grupos no polares de la cadena lateral.

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</ol>

Nuestra metodología para la microdisección de las glándulas productoras de seda de la araña viuda negro ofrece un medio eficaz para obtener altamente purificada producir seda glándulas. Disecciones se puede completar en 1,5 a 3 horas, produciendo un conjunto completo de las siete distintas glándulas productoras de seda de cobweavers. La obtención de alta pureza glándula de seda muestras permite a los investigadores la posibilidad de realizar una amplia gama de estudios bioquímicos, incluyendo la identificación de seda n...

<table><tbody><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SX0420-1</td><td>0,1 M en agua</td></tr><tr><td>Pirocarbonato de dietilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5758 - 5 ml</td><td>0,1% v/v</td></tr><tr><td>Citrato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804 - 1 kg</td><td>0,015 M en agua</td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica MZ16</td><td></td></tr><tr><td>Cámara digital para microscopio</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC320</td><td>Software - Leica Application Suite v2.8.1</td></tr><tr><td>Tijeras de Vannas</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500260</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de acero inoxidable</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501764</td><td>Mini Dumont #M5S</td></tr><tr><td>Alfileres para insectos</td><td>Indigo Instruments</td><td>33414-2</td><td>Alfileres para insectos #2</td></tr><tr><td>Platos de disección pequeños o grandes</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>DD-50-S o DD-90-S</td><td>52 mm de diámetro x 18 mm de alto (profundidad de Sylgard ~6 mm) o 93 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; frascos de cultivo</td><td>Carolina Biological</td><td>FR-17-3076</td><td>El tamaño es de 31,75 mm de diámetro x 101,6 mm</td></tr></tbody></table>

microdisección de negro araña viuda producción de las glándulas de seda

Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Arañas modernas giro fibras de alto rendimiento de seda con una amplia gama de funciones biológicas, incluyendo la captura de presas de locomoción, y la protección del desarrollo de 1,2 hijos. Arañas realizar estas tareas al girar varios tipos de fibras distintas que tienen diferentes propiedades mecánicas. Esta especialización de los tipos de fibra se ha producido a través de la evolución de las diferentes glándulas productoras de seda, que funcionan como biofábricas pequeños. Estos fabricación biofábricas y almacenar grandes cantidades de proteínas de seda para la producción de fibra. A través de una serie compleja de eventos bioquímicos, estas proteínas de la seda se convierten de un líquido en un material sólido con la extrusión. Estudios de mecánica han demostrado que las sedas de araña es más fuerte que acero de alta resistencia 3. Los análisis para comprender la relación entre la estructura y función de hilos de seda de araña han revelado que la seda de araña consiste en gran parte de las proteínas, o fibroins, que se repite dentro de su bloque de secuencias de proteínas 4. Común firmas moleculares que contribuyen a la resistencia a la tracción increíble y la extensibilidad de las sedas de araña se deshizo a través del análisis de ADNc de seda traducido. Teniendo en cuenta las propiedades del material extraordinario de araña sedas, los laboratorios de investigación en todo el mundo están compitiendo para comprender y simular el proceso de hilado para producir fibras sintéticas de seda para aplicaciones comerciales, industriales y militares. Uno de los principales desafíos a la hilatura de seda de araña artificial en el laboratorio de investigación consiste en un completo entendimiento de los procesos bioquímicos que ocurren durante la extrusión de las fibras de las glándulas productoras de seda. Aquí presentamos un método para el aislamiento de los siete productores de seda diferentes glándulas de la araña viuda cobweaving negro, que incluye las glándulas ampullate mayores y menores [fabrica de seda draga y andamios] 5,6, tubuliform [huevo sintetiza seda caso] 7 , 8, flagelliform [función desconocida en la mazorca de los tejedores], agregado [hace cola de seda], aciniform [envolver la presa sintetiza las discusiones y huevo caso] 9 y piriforme [archivo adjunto produce seda disco] 10. Este enfoque se basa en anestesiar a la araña con el gas de dióxido de carbono, la posterior separación del cefalotórax del abdomen, y microdisección del abdomen para obtener las glándulas productoras de seda. Tras la separación de los diferentes productores de seda glándulas, estos tejidos se pueden utilizar para recuperar las macromoléculas diferentes para los distintos análisis bioquímicos, incluyendo cuantitativos PCR en tiempo real, en el norte y el Western Blot, análisis de espectrometría de masas (MS o MS / MS) para identificar nuevas secuencias de proteínas de seda, la búsqueda de proteínas que participan en la ruta de la seda de montaje, o usar el tejido intacto para el cultivo celular o histológico experimentos.

A continuación se describe una estrategia eficaz para extirpar las glándulas productoras de seda desde el abdomen de la mujer araña viuda negro. Este procedimiento permite el rápido aislamiento de los productores de seda siete diferentes glándulas de una forma altamente purificada, un proceso importante para los investigadores que estudian la producción de la seda de araña y el montaje de la fibra.

Microdisección de Negro Araña Viuda producción de las glándulas de seda

Las arañas modernas tejen fibras de seda de alto rendimiento con una amplia gama de funciones biológicas, que incluyen la locomoción, la captura de presas y la protección de...

El objetivo general de este procedimiento es aislar las siete glándulas productoras de seda distintas de la araña, del abdomen, y utilizar estos tejidos para estudios moleculares y bioquímicos. Esto se logra primero anestesiando a la araña. El segundo paso del procedimiento consiste en separar la cefálica, el tórax y el abdomen, y fijar el abdomen con alfileres para insectos en un pequeño recipiente para disección.El tercer paso del procedimiento consiste en realizar incisiones en el exoesqueleto para exponer las glándulas productoras de seda. El paso final del procedimiento es la extracción de las diferentes glándulas productoras de seda. En última instancia, se pueden obtener resultados que demuestran que las distintas glándulas productoras de seda expresan ARNm o proteínas de seda diferentes mediante enfoques moleculares y bioquímicos, como la PCR cuantitativa en tiempo real o la espectrometría de masas, respectivamente.Este método proporcionará una información importante para la investigación en biología de las arañas, revelando las proteínas almacenadas dentro de las glándulas productoras de seda. Estas proteínas tienen aplicaciones en los ámbitos militar y médico, así como en numerosos usos comerciales e industriales. Tuvimos por primera vez la idea de realizar este estudio particular cuando necesitamos aprender más sobre las proteínas almacenadas dentro de las glándulas productoras de seda.La principal ventaja de esta técnica es que las arañas viuda negra hembra tienen abdomen muy grandes, lo que facilita enormemente el aislamiento de las glándulas productoras de seda. Las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque a menudo las glándulas se rompen durante la disección. También existen ciertas estructuras anatómicas que son difíciles de aislar.La demostración visual es fundamental para una buena disección. El procedimiento será demostrado por Kobe LaMattina, Tiffany Tootin, Blasingame y Y Shaw antes de comenzar la disección. Prepare 500 mililitros de solución tampón para disección compuesta por cloruro de sodio 0,1 molar, citrato de sodio 0,015 molar y etil bicarbonato al 0,1 %.Luego prepare una caja de cartón con un revestimiento de plástico para contener la araña y evitar que se escape. Normalmente obtenemos arañas viudas negras de pilas de madera, arbustos o garajes, y utilizamos frascos de vidrio para alojarlas en el laboratorio. Una vez obtenida, transfiera la araña de un frasco de vidrio a la caja mientras la manipula.Use dos pares de guantes de látex o guantes de jardinería por seguridad. Luego, con un pequeño vial de cultivo de plástico, acérquese a la araña por la parte trasera y deslice la araña dentro del vial, tapándolo inmediatamente. Introduzca gas de dióxido de carbono en el vial a una presión de cinco a 10 PSI durante 10 minutos para anestesiar a la araña; la disección inicial del abdomen desde el tórax cefálico debe realizarse dentro de los cinco minutos, mientras la araña aún esté bajo anestesia.Coloque la araña anestesiada en un pequeño recipiente para disección. Corte el pedículo, el estrecho tallo que conecta el cefalotórax con el abdomen, para liberar el abdomen. El cefalotórax contiene las quijadas de la araña y requiere una eliminación adecuada.Retire cuidadosamente el tórax cefálico colocado en una placa de Petri y congélelo durante la noche. Antes de desecharlo, localice el orificio en el abdomen de la araña producido por el corte de la célula del pedestal, identificando el sitio de donde emerge líquido del abdomen. Utilizando un solo alfiler de disección, inserte el alfiler a través del orificio y dentro del abdomen para sujetar el abdomen a la bandeja de disección, orientando la araña de modo que el pedestal quede más alejado del diseccionador y el eje gire más cercano al diseccionador.Con un par de tijeras microscópicas, comience en el orificio del pedículo celular y corte lateralmente a cada lado a través del exoesqueleto hasta alcanzar el lado dorsal. Con pinzas, retire el segmento anterior del exoesqueleto e inserte una segunda aguja en este lugar. A continuación, gire la bandeja de disección 90 grados con respecto a los cortes laterales iniciales.Continúe cortando hasta alcanzar los espolones. La incisión será perpendicular o vertical al corte lateral inicial. Los espolones se encuentran debajo de la cintura de avispa y tienen un aspecto circular.No corte los músculos cuando se realice la incisión vertical. Sumerja el abdomen en solución tampón de disección. Retire hacia atrás el exoesqueleto restante comenzando desde la incisión lateral inicial.Una vez completado esto, el tejido graso de aspecto blanquecino a amarillento debe ser claramente visible utilizando pinzas. Comience a separar cuidadosamente la capa de grasa hasta que se haya eliminado la mayor parte de ella y las glándulas sericígenas sean claramente visibles. Si están presentes huevos, deben eliminarse.En este momento, diseque las glándulas en el siguiente orden: forma tubular, forma de flagelos mayor, agregado de la forma menor de asa, forma y luego la piriforme. Describiremos cada glándula en el orden del disección.Las glándulas en forma tubular se sitúan encima de todas las demás glándulas y presentan tres pares de tubos cilíndricos muy largos que son abundantes en la cavidad abdominal. Separe cuidadosamente estas glándulas del resto de las glándulas. Deje que floten libremente, pero que permanezcan unidas a las glándulas espineras mediante sus conductos.A continuación, separen los dos glándulas ampollares mayores que también se encuentran en las peras. Estas glándulas son grandes y con forma de creciente, con largas colas distales tortuosas y conductos proximales que disminuyen en anchura. Al acercarse a las espinas de la araña, retiren las glándulas ampollares mayores y colóquenlas en tubos estériles de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Coloque las glándulas sobre hielo tras su extracción. A continuación, retire el flagelo de la glándula formm. El flagelo de la glándula formm también está presente como una pera.Tiene una estructura multilobulada con un pequeño conducto cilíndrico en zigzag que se extiende hacia abajo en dirección a los espinos; tras su extracción, se colocan sobre hielo. A continuación, el alete menor presenta una morfología muy similar a la del alete mayor, pero es significativamente más pequeño. La glándula agregada, presente en pares, es grande y multilobulada, y posee un conducto excretor muy amplio con lóbulos grandes e irregulares.Las glándulas sino formm ocurren en gran número y se asemejan a proyecciones cortas y pequeñas con forma de dedo. La glándula piriforme es la glándula más pequeña del abdomen y posee muchos conductos cilíndricos compactados que se asemejan a un abanico, con numerosos conductos excretores pequeños que se extienden hasta los espinos. Ahora que la glándula tubular formm es la única glándula que queda libre y flotando, retírela pellizcando el conducto con pinzas y tirando cuidadosamente hasta que se desprenda del punto de salida cerca del espinoso. Después de la disección, congele rápidamente todas las glándulas disecadas colocando el tubo en nitrógeno líquido hasta que se congelen, y almacénelas a menos 80 grados Celsius para su conservación.Alternativamente, las glándulas pueden congelarse inmediatamente después de ser removidas independientemente durante el procedimiento de disección. Esta figura muestra el aislamiento del gen de seda, los niveles de ARNm de TUSP uno en las diferentes glándulas productoras de seda, excluyendo la glándula piriforme, mediante análisis de PCR cuantitativa en tiempo real tras el aislamiento de ARN total de las glándulas. Las glándulas en forma tubular contienen la mayor abundancia de ARNm de TUSP uno.Esta figura muestra un resultado típico del perfil de composición de aminoácidos de las proteínas extraídas de la glándula piriforme. La coloración azul refleja aminoácidos con grupos laterales polares, mientras que la coloración roja representa residuos de aminoácidos con grupos laterales no polares. Esta figura muestra el análisis por espectrometría de masas de extractos proteicos obtenidos de la glándula piriforme tras la triptización en solución.La digestión aquí por dos representa una amplificación dos veces mayor de la intensidad del espectro. Las masas de iones peptídicos del espectro marcadas con el símbolo de número indican péptidos derivados de la fibroína de seda PYSP uno tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para los investigadores en la comunidad científica de biología de inmersión.Se utilizó para explorar los procesos químicos y moleculares implicados en la producción de fibras por empapado, el ensamblaje de la fibra de seda y la extrusión. Si esta técnica se realiza correctamente, puede completarse entre una hora y media y tres horas. Durante el intento de este procedimiento, es importante usar dos pares de guantes hasta que se retiren los colmillos de la araña.Al finalizar este método, las glándulas productoras de seda pueden utilizarse para extraer ARN y proteína. Estos materiales pueden emplearse en aplicaciones posteriores, como la PCR cuantitativa en tiempo real, así como en espectrometría de masas. La información que puede obtenerse de estos estudios nos ayudará a comprender mejor el ensamblaje de la seda y la vía de extrusión de la seda.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar las siete glándulas productoras de seda distintas de la araña viuda negra hembra.

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Investigación

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Biología

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Se presenta un protocolo para el spinning de microfluidos y caracterización de la microestructura de monofilamento de fibroína de seda regenerado.

Seco de microfluidos-spinning y caracterización de las fibras regeneradas fibroína de seda

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de entero, intacto el ratón glándulas mamarias para investigar la expresión de matriz extracelular (ECM) y morfología ductal. Las glándulas abdominales de ratón #4 se extrajeron de ratones femeninos nulíparas del 8-10 semanas de edad fijado en formalina tamponada neutra, seccionadas y teñido mediante inmunohistoquímica para las proteínas de la ECM.

Aislamiento de las glándulas mamarias del ratón intacto, todo para el análisis de expresión de la matriz extracelular y la morfología de la glándula

Aunque muchos insectos en el suborden Heteroptera (Insecta: Hemiptera) son venenoso, su composición del veneno y las funciones de las toxinas de su veneno son en su mayoría desconocidas. Este protocolo describe métodos para cosechar heteropteran venenos de más caracterización, mediante electroestimulación, acoso y disección de la glándula.

Recolección de las toxinas del veneno de insectos asesinos y otros insectos Heteropteran

Tamaño de acino de glándula hipofaríngea es una medida robusta de enfermera nutrición de abejas de miel. Presentamos un protocolo detallado para disección, tinción, proyección de imagen y medición acinos de la glándula de enfermera abeja hipofaríngeo.

Medición de hipofaringe tamaño de acino de glándula en trabajadores de la abeja (Apis mellifera)

Aquí, presentamos un protocolo para producir soluciones de proteína de seda de araña recombinante soluble en agua y las formas materiales que se pueden formar a partir de esas soluciones.

Formación material de la araña recombinante sedas a través de la Solvación acuosa utilizando calor y presión

La glándula salival del mosquito adulto (SG) es necesaria para la transmisión de todos los patógenos transmitidos por mosquitos a sus huéspedes humanos, incluidos los virus y parásitos. Este video demuestra el aislamiento eficiente de los SG de los mosquitos Anopheles gambiae en etapa larval (L4) y la preparación de los SG L4 para su posterior análisis.

Disección e inmunotinción de glándulas salivales larvales de mosquitos Anopheles gambiae

Aprende a aislar las siete glándulas productoras de seda del abdomen de arañas viuda negra mediante microdisección. Este método permite extraer tejidos puros para estudios moleculares y bioquímicos de la producción de seda.

Microdisección de Negro Araña Viuda producción de las glándulas de seda

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