Expresión génica mediante electroporación unicelular en cultivos de cortes de hipocampo de ratón

Comience con una rebanada de hipocampo de un cerebro de ratón cultivado en un inserto de cultivo en un plato.

Corte el inserto que contiene la rebanada y asegúrelo en una cámara de electroporación bajo un microscopio.

Perfunda la cámara con un tampón que contenga un bloqueador de canales de sodio dependiente de voltaje para inhibir la sobreexcitación y prevenir la toxicidad celular.

Coloque una pipeta que contenga plásmidos con el gen de interés cerca de la rebanada.

Mantenga la presión positiva para evitar la obstrucción de la pipeta mientras se acerca a una neurona del hipocampo objetivo hasta que se forme un hoyuelo en la membrana.

Cambie a presión negativa para crear un sello con la membrana.

Alterne entre presión positiva y negativa para minimizar el daño celular.

Aplique un pulso de electroporación para permeabilizar transitoriamente la membrana, facilitando la entrada de plásmidos.

Retire la pipeta mientras mantiene la presión positiva y repita la electroporación para las neuronas diana vecinas.

Transfiera la rebanada electroporada a un inserto nuevo e incube para permitir la expresión del gen de interés.

Para preparar cultivos en rodajas para la electroporación, transfiera los insertos de cultivo de interés a placas de Petri individuales de tres centímetros cargadas con 900 microlitros de medio de cultivo y coloque los cultivos en una incubadora de dióxido de carbono de mesa. A continuación, preincube los insertos de cultivo frescos con un mililitro de medio de cultivo en rodajas por inserto en una placa de Petri de 3,5 centímetros durante al menos 30 minutos, y esterilice las líneas del equipo de electroporación con lejía al 10% durante cinco minutos.

Al final de la perfusión, enjuague las vías con el agua ionizada esterilizada en autoclave durante al menos 30 minutos antes de perfundir con aCSF esterilizado con filtro que contenga 0,001 milimolar de tetrodotoxina. Ajuste el pulso del electroporador a una amplitud de menos cinco voltios, un pulso cuadrado, un tren de 500 milisegundos, una frecuencia de 50 hercios y un ancho de pulso de 500 microsegundos. Llene una pipeta de vidrio con cinco microlitros de solución interna que contenga plásmidos y golpee suavemente la punta varias veces para eliminar las burbujas atrapadas.

Utilice un microscopio de disección para confirmar que la punta no está dañada y fije firmemente la punta de la pipeta al electrodo. Cuando la punta entre en contacto con el aCSF, registre la lectura de resistencia de la pipeta del electroporador. Para aislar un cultivo en rodajas, corte la membrana del inserto de cultivo con una cuchilla afilada y use pinzas en ángulo afilado para transferir cuidadosamente el cultivo en rodajas a la cámara de electroporación.

A continuación, fije la posición de la referencia cultural con un anclaje de sector. Para la electroporación de las células de interés, aplique presión positiva a la pipeta por vía oral y use los controles de perilla tridimensionales para maniobrar la punta de la pipeta cerca de la superficie del cultivo de corte. Al ver el cultivo con el microscopio, acérquese a la célula diana con la punta, manteniendo la presión positiva aplicada hasta que se forme un hoyuelo en la superficie celular.

Tras la visualización del hoyuelo, aplique rápidamente una presión negativa suave por la boca para que se forme un sello suelto entre la punta de la pipeta y la membrana plasmática. La membrana entrará ligeramente en la pipeta. Se debe observar un aumento de aproximadamente 2,5 veces en la resistencia inicial de la pipeta, como lo indica un aumento en el tono de los altavoces.

Vuelva a aplicar rápidamente la presión positiva para que el hoyuelo se reforme. Luego, complete inmediatamente al menos dos ciclos de presión más como se acaba de demostrar sin pausa. Después del último pulso de presión, mantenga la presión negativa durante un segundo.

Cuando el tono de los altavoces alcance un vértice estable en tono, use el pedal para pulsar rápidamente el electroporador. Después de la electroporación, retraiga suavemente la pipeta aproximadamente a 100 micras de la celda sin aplicar presión y vuelva a aplicar presión positiva, verificando que la resistencia sea similar a la lectura de referencia antes de acercarse a la siguiente celda. Cuando todas las células de interés hayan sido electroporadas, transfiera el cultivo de rodajas a uno de los insertos de cultivo frescos preparados y coloque el inserto a 35 grados Celsius durante un máximo de tres días.