En la inyección intraventricular Utero y electroporación de embriones de ratón E15

Hola, soy William Tis del Laboratorio Krete. Hoy, yo y otros vamos a mostrarles inyecciones intrauterinas de embriones de ratón E15. Hola, mi nombre es Laura Elias.

Hoy les mostraré cómo preparar las pipetas de microinyección y cargarlas para las inyecciones intraventriculares y la electroporación que realizaremos. Mi nombre es David Castaneda y hoy estaré ayudando con inyecciones in vivo in utero en embriones de ratón. Inyectaremos ADN plasmídico en el ventrículo lateral de embriones de ratón en desarrollo.

Dirigimos la corteza CE de estos embriones para obtener la expresión de diferentes moléculas por parte de las células gliales, las cuales se convertirán en neuronas más adelante durante el desarrollo. Al realizar estas inyecciones intrauterinas, hay algunas herramientas importantes que necesitará utilizar y se las mostraré ahora. Utilizamos un freer, un par de fórceps adin.

Uno, un par que está dentado y otro par que tiene un pequeño diente en el extremo. Utilizamos un par de hemostatos. Este es un par de tijeras.

Luego utilizamos estas dos grapadoras. Esta es la más grande, que usamos para ratas. Esta es la más pequeña, que usamos para ratones.

Utiliza una grapa tamaño siete, y esta utiliza una grapa tamaño nueve, y ambas están simplemente cargadas por resorte. Algunas de las herramientas que utilizamos aquí para ayudar con las cirugías incluyen una fuente de luz fibra óptica sencilla con una cabeza doble. Usamos una almohadilla térmica que simplemente circula agua caliente por dentro para mantenerla tibia.

La superficie de trabajo, utilizamos este sistema de electroforesis fabricado por BTX. Tenemos varios tamaños diferentes de paletas que usamos según el tamaño de los embriones. El lado azul es el lado positivo.

Vale, para los ratones utilizamos un vaporizador de isoflurano. Hemos descubierto que aumenta nuestra tasa de supervivencia de la madre y de los embriones. Además, nos permite inducir y recuperar al animal del estado de inconsciencia de forma muy rápida y controlada.

Por esa razón, lo encontramos muy útil. Muy bien, ahora vamos a biselar nuestras pipetas de inyección. Esto es muy importante para que la pipeta tenga una abertura lo suficientemente grande como para cargar el ADN, pero también para que sea muy, muy afilada y no dañe el embrión durante la inyección.

Y si daña el embrión durante la inyección, tendrá una tasa de mortalidad mucho más alta. Y eso no es bueno. Por lo tanto, este es en realidad un proceso muy importante en esta cirugía.

Y primero vamos a colocar un poco de agua sobre esta piedra de biselado que está girando aquí. Luego vamos a tomar, veamos aquí, simplemente un palo. Y vamos a colocar nuestra pipeta que acabamos de estirar sobre este palo con un poco de cinta.

Y vamos a utilizar uno de estos micromanipuladores para sostener la pipeta sobre el bisel y permitir que se biselé aquí. Entonces, simplemente colocamos esto y usamos un microscopio para visualizar la punta de la pipeta. Y la colocaremos justo dentro del agua, encima del bisel, de modo que haya una pequeña presión.

Y puede observarse cómo la punta presiona contra la piedra aquí. Y déjela afilarse durante un tiempo, al menos, digamos, 15 minutos. Me gusta dejarlas incluso, por ejemplo, una hora.

A veces son simplemente muy, muy afiladas, pero definitivamente depende de la persona el tiempo que afilen sus pipetas. Muy bien, aquí tenemos, pueden ver en la parte superior una pipeta que ha sido estirada pero que aún no ha sido afilada. Aunque es afilada, no tiene ninguna abertura a través de la cual podrían cargar su ADN.

Ahora la pipeta inferior ha sido biselada y se puede ver esta abertura angulada. Esto permitirá cargar el ADN, aunque aún tiene una punta afilada para poder inyectar sin causar daño. Muy bien, ahora vamos a llenar nuestras pipetas de inyección con ADN. Es importante que prepare el ADN de manera libre de endotoxinas para no inyectar lipopolisacáridos junto con el ADN.

Así que vamos a tomar nuestro ADN y, en este momento, preparar nuestro parafilm. Vas a hacer tu parafilm aquí y querrás recoger tu ADN y colocarlo simplemente como un pequeño punto sobre esta película de parafilm. Luego vamos a tomar, por ejemplo, yo suelo tomar por cada 10 microlitros de mi ADN, que generalmente uso en aproximadamente 1,5 a 1,7 microgramos por microlitro.

Usaré aproximadamente un microlitro de este colorante verde rápido. Esto simplemente nos ayudará a localizar nuestra inyección y asegurarnos de que hemos inyectado con éxito en el ventrículo. Luego, mezclaré este colorante verde rápido con mi ADN.

Luego tome su electrodo de inyección y llenaremos la pipeta jalando hacia atrás el émbolo. Puede ver aquí que, si la pipeta está biselada correctamente y tiene una abertura suficientemente grande, el DNI debería cargarse bastante fácilmente. A veces es necesario mover el émbolo hacia adelante y hacia atrás para ayudar a que se cargue correctamente.

Y así luego puede cargar la pipeta de esta manera. Entonces, tenemos el ADN completamente cargado en esta pipeta y está listo para la inyección. Muy bien, ahora voy a limpiar al animal con alcohol y yodo, pero primero, por supuesto, quiero hacer una compresión en el dedo del pie para asegurarme de que el animal esté completamente anestesiado y parece estar bien.

Así que puedo continuar y comenzar. Y comienzo, al igual que en las ratas, con una serie de tres, empezando con el etanol. Bien, yodo.

Para minimizar el riesgo de infección, observe que cuando William abre las toallitas, limpia al animal con la parte que no ha sido tocada por sus dedos, de modo que se maximice la limpieza del área. En segundo lugar, realiza solo una pasada para evitar distribuir gérmenes sobre la superficie abdominal.

Vale, perfecto. Ahora voy a limpiar un poco y pondré unos guantes quirúrgicos. Vale. Vale. Vale. Ahora voy a abrir el ratón y extraer los cuernos uterinos, y comenzaré con un pequeño pellizco en la piel.

Permítanme hacer otro pellizco en el dedo del pie aquí solo para asegurarme de que está completamente anestesiada y eso está bien. Así que pellizcaré la piel y haré una pequeña ondulación que sobresalga, lo que facilitará el corte. Y nuevamente, queremos hacer la incisión justo a lo largo de la línea media del animal para evitar cualquier vaso sanguíneo.

Suelo cortar la piel de esa manera y la separo para exponer el músculo. Y una vez que lo has hecho, puedes ver fácilmente la línea media en el músculo. Está muy definida.

Voy a tomar un poco de músculo allí, hacer un corte, y ese es un tamaño adecuado para la incisión. Realmente no querría hacerla más grande que eso. Luego uso este separador para levantar el músculo y la piel, tirarlos hacia un lado, y entonces realizo una sonda muy suave aquí e intento colocar el separador entre los dos embriones, entre dos embriones, para poder extraerlos suavemente sin dañarlos en absoluto.

A veces es más fácil que otras. Ahí vamos. Así que simplemente tire suavemente para pasarla, y una vez que la pase, podré empujarlas un poco para sacarlas.

Es importante que nunca se pellizquen los embriones, sino que simplemente se los guíe, empujándolos suavemente. Y una vez que los saque, quiero asegurarme de mantenerlos siempre muy húmedos. No debe permitir que se deshidraten.

Y veamos, uso nuevamente mi fresa, explorando alrededor. Ahí vamos. Eso es excelente.

Y por eso siempre quiero asegurarme de que los he extraído todos, porque es fácil dejar alguno dentro si no se buscan los ovarios. Así que siempre los saco nuevamente con mucho cuidado, pero buscando y verificando la presencia de los ovarios al final, que están justo ahí. Y simplemente se ven como una pequeña masa de tejido rojo en este animal.

Luego, voltéelos, regrese y revise el otro lado y puedo verlos allí. Así que asegúrese de mantenerlos hidratados y estaremos listos para comenzar. Algo que quiero señalar es que no debe, debe tomar los embriones muy suavemente y solo agarrar los embriones.

No agarre donde están los vasos sanguíneos porque pueden dañarse muy fácilmente y podrían producir una hemorragia, lo que reduciría drásticamente la tasa de supervivencia. Por lo tanto, lo primero que queremos determinar es dónde se encuentra la cabeza en el embrión que deseamos inyectar con el ADN. Hacemos esto rotando suavemente el animal y observando cada parte ventral.

Entonces, en este ejemplo particular, la cabeza se encuentra a mi derecha y la cola está cerca de mi izquierda. La línea media está en esta posición y William procederá a colocar al embrión de manera adecuada para que yo pueda inyectarlo, tal como en las ratas. Siempre los coloco con la cabeza hacia arriba, con el lado derecho de la madre orientado hacia mí.

Y así que comenzaré con eso ahora. Bien, pueden ver el pilar del suelo izquierdo allí, muévanse un poco y definitivamente podrán ver la línea media justo ahí. Intentaré girarlo un poco para que quede en una buena posición para David.

Vale, y ahora voy a proceder a inyectar el ventrículo izquierdo. Aquí podemos ver que el ventrículo izquierdo está totalmente y completamente lleno de ADN. Podemos observar que algo de colorante se ha extendido al ventrículo derecho y también a los ventrículos tercero y cuarto aquí.

Eso es un buen indicador de una buena inyección. Ahora procederemos a electroinsertar el ADN en las células. La consideración importante aquí es saber cuál electrodo es el lado positivo.

Sabemos que el electrodo con mango azul es el positivo y que este lado debe colocarse en el lado en el que deseamos realizar la electro poración del ADN. Dado que hemos inyectado la mayor parte del ADN en el ventrículo izquierdo, colocaré el electrodo positivo en el lado izquierdo así, y luego aplicaremos cinco pulsos; eso es todo. Es importante que los electrodos estén completamente humedecidos en PBS para que el contacto entre los electrodos y el útero sea bueno y la transmisión de los pulsos eléctricos sea adecuada.

Vale, ahora que la exploración ha terminado, voy a proceder a colocar nuevamente las astas en su lugar. Para hacerlo, moveré muy suavemente las astas hacia un lado, introduciré la mano aquí y tomaré el músculo y la piel, e iré introduciéndolos suave, muy suavemente de vuelta hacia adentro. Muy bien, perfecto.

Tenga cuidado con la vejiga. Puedo hacer el otro lado. Y luego lo que hacemos es darle un pequeño movimiento para asentarlos un poco allí dentro.

Puede usar el separador un poco para aplanarlos suavemente. Y luego lo que voy a hacer es irrigar con tres mililitros de antibiótico antimicótico. Vamos a hacer una compresión en el dedo del pie para asegurarnos de que está completamente inconsciente antes de comenzar a suturar.

Y eso se ve bien. Voy a usar Henry Shine. Número seis, sutura quirúrgica.

Yo prefiero hacer puntadas de bloqueo. Creo que resisten mejor. Y vamos a comenzar simplemente pasando la aguja por ahí, sacándola, enrollando tres veces, agarrando el extremo y pasándolo a través.

1, 2, 3, corte el exceso. Así que desea continuar avanzando por la línea, espaciando uniformemente y tirando con firmeza. Y debe avanzar un poco más allá del punto donde termina la incisión y anudar nuevamente.

Y ahora estoy haciendo eso. Retire un poco el tejido o la piel. Hay un poco de sangrado allí.

Debería estar bien. Tenemos un cauterizador a mano por si hay sangrado, lo cual ocurre ocasionalmente. Y el cauterizador funciona bien para detenerlo.

Entonces, bien, ya he traspasado la incisión. Me detendré aquí. Tire hacia adelante, haga un lazo, gire tres veces alrededor, agarre el lazo y tire de él hacia abajo.

Gire tres veces, agarre el lazo, páselo a través, y corte el exceso. Coloque la aguja en el recipiente para objetos punzantes. Luego vamos a usar una grapadora.

Vamos a utilizar grapas tamaño siete en este animal. Usamos el tamaño siete para ratones y el nueve para ratas.

Simplemente tome la piel, levántela un poco y comience a cortar. Vuelva a tomar la pinza. Queremos espaciar los cortes uniformemente hasta un poco más allá de la incisión y eso está bien.

Proceda con una limpieza con alcohol de toda el área. Luego, le administraremos una inyección de buprenorfina solo para asegurarnos de que no experimente dolor. Continuaremos monitoreándola durante los próximos días para asegurarnos de que se mantenga sana y sin ningún tipo de dolor.

Vale, ahora que le hemos administrado una inyección de buprenorfina, la devolveremos a su jaula original para que se sienta cómoda al despertar, la colocaremos en el incubador y la dejaremos allí durante unos 20 minutos, hasta que esté completamente despierta y seca. Les hemos mostrado cómo realizar la electroforesis in vivo in utero de ADN plasmídico. Podemos inyectar cualquier molécula.

Podría ser el patrón D o podrían ser fármacos. Los factores de crecimiento mueren. Si necesita que estas moléculas sean introducidas en las células y no atraviesan la difusión pasiva, necesitará electroporación y, para ello, las moléculas deberán estar cargadas.

Pero básicamente, las posibilidades son ilimitadas. Un ejemplo de un vector alternativo para la entrega de genes en células son nuestros virus.

Y en el pasado hemos utilizado retrovirus para marcar las gls con ADN y mostrar cómo se dividen y se convierten en neuronas, migrando eventualmente hacia la corteza después de marcar las células con un virus o mediante electroporación, o inyectar fármacos u otras moléculas para afectar el desarrollo del cerebro. Esto se puede estudiar mediante varias técnicas. Una de ellas es realizar un registro temporal en el que se harán cultivos de cortes organotípicos.

Luego, seguirá el destino de las células utilizando un microscopio. Como puede ver aquí, tiempo 0.0. Comenzamos con un grupo de células que se encuentran muy cerca del ventrículo lateral.

Y a medida que avanza el tiempo, podemos observar que las células comienzan a migrar fuera de la zona ventricular y hacia la placa cortical. Además, fijamos los embriones y realizamos inmunohistoquímica para estudiar, por ejemplo, la distribución de diferentes moléculas o para determinar el destino de estas distintas células. Otra posibilidad es realizar electrofisiología.

Identificamos las células marcadas y luego estudiamos sus propiedades eléctricas. Bueno, gracias por acompañarnos hoy. Esperamos que disfruten nuestras demostraciones y que tengan éxito al realizar sus experimentos.

Si tiene alguna pregunta, no dude en ponerse en contacto con nosotros. Usted sabe, buena suerte.