En la inyección intraventricular Utero y electroporación de embriones de ratón E15

Hola, soy William Tis del Laboratorio Krete. Hoy, yo y otros vamos a mostrarles inyecciones intrauterinas de embriones de ratón E 15. Hola, mi nombre es Laura Elías.

Hoy les voy a mostrar cómo preparar las pipetas de microinyección y cargar las pipetas para las inyecciones intraventriculares y la electroporación que vamos a hacer. Mi nombre es David Castaneda y hoy estaré asistiendo con inyecciones in vivo en el útero de embriones de ratones. Inyectaremos ADN plasmídico en el ventrículo lateral de embriones de ratones en desarrollo.

Nos dirigimos a la corteza CE de estos embriones para que consigamos la expresión de diferentes moléculas por parte de las células gliales y que se convertirán en neuronas más adelante en el desarrollo. Al hacer estas inyecciones intrauterinas, hay algunas herramientas importantes que deberá usar y se las mostraré. Ahora. Usamos un libre, un par de pinzas adicionales.

Uno, un par que está dentado, y otro par que tiene un pequeño diente en el extremo. Usamos un par de hemostáticos. Se trata de unas tijeras.

Y luego usamos estas dos grapadoras. Estos son los más grandes que usamos para las ratas. Este es el más pequeño que usamos para los ratones.

Usa una grapa de tamaño siete, y esta es usa una grapa de tamaño nueve y solo están cargados por resorte. Algunas de las cosas que usamos aquí para ayudar con las cirugías, simplemente usamos una fuente de luz de fibra óptica simple con una cabeza doble. Usamos una almohadilla térmica que hace circular agua caliente a través de allí para mantenerla caliente.

La superficie de trabajo, utilizamos este sistema de electroporación fabricado por BTX. Tenemos un par de tamaños diferentes de paletas que usamos en función de qué tan grandes son los embriones. El lado azul es el lado positivo.

Bien, para los ratones usamos un vaporizador de flúor iso. Descubrimos que aumenta la tasa de supervivencia de la madre y de los embriones. También nos permite hacer que el animal entre y salga de la conciencia muy rápidamente y de una manera muy controlada.

Así que por esa razón, nos resultó muy útil. Muy bien, ahora vamos a biselar nuestras pipetas de inyección. Y esto es muy importante para que tu pipeta tenga una abertura lo suficientemente grande como para que puedas cargar tu ADN, pero también que esté muy, muy afilada para que no dañe el embrión cuando inyectes.

Y si dañas el embrión cuando te inyectas, vas a tener una tasa de mortalidad mucho más alta. Y eso no es bueno. Así que este es en realidad un proceso muy importante como en esta cirugía.

Y primero vamos a poner un poco de agua en esta piedra biselada que está girando aquí. Y luego vamos a tomar, veamos aquí, solo un, un, un palo. Y vamos a colocar nuestra pipeta que acabamos de tirar en este palo con un poco de cinta adhesiva.

Y vamos a usar uno de estos micro manipuladores para sujetar la pipeta en el bisel y permitir que se bisele aquí. Entonces, y simplemente colocamos esto y usamos el microscopio para visualizar la punta de la pipeta. Y lo colocaremos en el agua encima del bisel para que haya un poco de presión.

Y Uds. pueden ver la punta presionando contra la piedra aquí. Y deja que se bisele durante algún tiempo durante al menos, ya sabes, 15 minutos. Me gusta dejarlos incluso durante, ya sabes, una hora.

A veces son simplemente, se vuelven muy, muy afilados, pero definitivamente depende de cada persona cuánto tiempo biselan sus pipetas. Muy bien, aquí tenemos, pueden ver en la parte superior que tenemos una pipeta que se ha tirado y que aún no se ha biselado. Entonces, si bien es afilado, no tiene ninguna abertura a través de la cual pueda cargar su ADN.

Ahora la pipeta inferior ha sido biselada y puedes ver esta bonita abertura en ángulo que te permitirá cargar tu ADN, pero todavía tiene una punta afilada para que puedas inyectar sin crear ningún daño. Muy bien, ahora vamos a llenar nuestras pipetas de inyección con ADN. Por lo tanto, es importante que prepare su ADN libre de endotoxinas para que no se inyecte ninguno de los lipopolisacáridos cuando inyecte su ADN.

Así que vamos a tomar nuestro ADN y aquí, preparar nuestra paraforma. Así que vas a hacer tu paraforma aquí y vas a querer recolectar tu ADN y simplemente colocarlo como un pequeño punto en esta película para. Y luego vamos a tomar, por lo que generalmente tomo por cada 10 microlitros de mi ADN, que generalmente uso a aproximadamente 1.5 a 1.7 microgramos de un microlitro.

Usaré aproximadamente un microlitro de este tinte verde rápido. Y esto es solo para ayudarnos a localizar nuestra inyección y asegurarnos de que hemos inyectado con éxito en el ventrículo. Así que luego mezclaré este tinte verde rápido con mi ADN.

Y luego toma su electrodo de inyección y simplemente estaremos llenando la pipeta tirando hacia atrás del émbolo. Y puede ver aquí si, si la pipeta está biselada correctamente y tiene una abertura bastante grande, el DNI debería cargarse con bastante facilidad. A veces es necesario mover el émbolo hacia adelante y hacia atrás para ayudar a que se cargue correctamente.

Y así puedes cargar la pipeta así. Y así tenemos el ADN completamente cargado en esta pipeta y está lista para la inyección. Está bien, ahora voy a lavar al animal con alcohol y yodo, pero primero, por supuesto, quiero pellizcar los dedos de los pies para asegurarme de que el animal esté completamente debajo y se vea bien.

Así que puedo seguir adelante y comenzar. Y empiezo con el etanol, al igual que en las ratas, hacemos una serie de tres, empezando por el etanol. Está bien, yodo.

Para minimizar el riesgo de infección, tenga en cuenta que cuando William abrió las toallitas, limpia al animal con la parte que no ha sido tocada por sus dedos. De modo que para maximizar que el área esté limpia. En segundo lugar, hace una sola toallita para evitar distribuir gérmenes por la superficie abdominal.

Está bien, genial. Ahora voy a limpiarme un poco y nos pondremos unos guantes quirúrgicos. Está bien, está bien, está bien, así que ahora voy a abrir el ratón y sacar los cuernos uterinos y voy a empezar con un pequeño pellizco en la piel.

Déjame hacer otro pellizco en el dedo del pie aquí solo para asegurarme de que ella esté completamente debajo y eso es bueno. Así que pellizco la piel y hago una pequeña ondulación que sobresale, lo que me facilita el corte. Y de nuevo, queremos hacer la incisión justo a lo largo de la línea media del animal para evitar cualquier vaso sanguíneo.

Por lo general, corto la piel así y la separo y expongo el músculo. Y una vez que hayas hecho eso, puedes ver fácilmente la línea media allí en el músculo. Está muy definido.

Voy a agarrar un poco de músculo allí, cortar, y esa es una incisión de buen tamaño. Realmente no querría ir más allá de eso. Y luego uso este liberador solo para levantar el músculo y la piel, tirar de él hacia un lado, y luego hago una sonda muy suave aquí y trato de colocar el liberador entre los dos embriones, entre dos embriones para poder tirar suavemente de ellos sin dañarlos en absoluto.

A veces es más fácil que otras. Aquí vamos. Así que simplemente lo atraviese suavemente y una vez que lo logre, entonces puedo empujarlos hacia afuera.

Es importante nunca pellizcar los embriones, pero solo quieres guiarlos, simplemente empujarlos. Y una vez que los saques, quiero asegurarme de mantenerlos siempre muy húmedos. No quieres permitir que se sequen.

Y a ver, vuelvo a usar mi freer aquí, sondeo alrededor. Aquí vamos. Genial.

Y por eso siempre quiero asegurarme de tenerlos todos porque es fácil dejar uno allí si no revisas los ovarios. Así que siempre los vuelvo a sacar con mucha suavidad, pero buscando y mirando para ver los ovarios al final, que está justo ahí. Y sólo se ve como una pequeña masa de tejido rojo en este animal.

Y luego les doy la vuelta, vuelvo y reviso el otro lado y puedo verlos allí. Así que asegúrate de mantenerlos hidratados y estamos listos para comenzar. Algo que quiero señalar es que no lo haces, debes agarrar los embriones muy suavemente y solo agarrar los embriones.

No agarres donde están los vasos sanguíneos porque se convertirán, pueden dañarse muy fácilmente y tendrán, el animal tendrá una hemorragia y la tasa de supervivencia disminuirá drásticamente. Así que lo primero que queremos determinar es dónde está la cabeza en el embrión al que queremos inyectar el ADN. Lo hacemos rotando al animal suavemente y mirando la parte ventral, cada parte ventral.

Así que en este ejemplo en particular tenemos que la cabeza está a mi derecha y la cola está cerca de mi izquierda. La línea media está en esta posición y William va a proceder a colocar el embrión de la manera adecuada para que pueda inyectarlo como en las ratas. Siempre los coloco con la cabeza en alto, el lado derecho de la madre mirando hacia mí.

Y por eso voy a empezar ahora. Bien, puedes ver el poste izquierdo del piso allí, muévete solo un poco y definitivamente puedes ver la línea media justo allí. Intentaré darle un poco de vueltas para que esté en una buena posición para David.

Bien, y ahora voy a proceder a inyectar el ventrículo izquierdo. Podemos ver aquí que el ventrículo izquierdo está totalmente, completamente lleno de ADN. Podemos ver que algunos troqueles se han diseminado al ventrículo derecho y también al tercer y cuarto ventrículo aquí.

Ese es un buen indicador de una buena inyección. Así que ahora procederemos a electro el ADN en las células. La consideración importante aquí es saber qué electrodo es el lado positivo.

Sabemos que el que tiene el mango azul aquí es el electrodo positivo y ese lado debe ir en el lado en el que queremos electroporar el ADN. Entonces, ya que inyectamos el ventrículo izquierdo con la mayor parte del ADNAI, colocaremos el electrodo positivo en el lado izquierdo de esta manera, y luego aplicaremos cinco pulsos y listo. Es importante tener los electrodos completamente mojados en PBS para que el contacto entre los electrodos y el útero sea bueno y la transmisión de los impulsos eléctricos sea la adecuada.

Bien, ahora que la exploración está completa, voy a seguir adelante y volver a poner los cuernos adentro. Y la forma en que lo haré es que moveré muy suavemente los cuernos hacia un lado, meto la mano aquí y agarro el músculo y la piel y de manera suave, más suave y más fácil allí. Muy bien, muy bien.

Tenga cuidado con la vejiga. Puedo hacer el otro lado. Y luego lo que hacemos es darle un poco de sacudida para que se calmen allí.

Puede usar un poco el liberador para aplanarlos suavemente. Y luego lo que voy a hacer es enjuagar con tres milésimas de pulgada de antibiótico antimicótico. Vamos a pellizcarle el dedo del pie para asegurarnos de que esté completamente fuera antes de empezar a suturar.

Y eso pinta bien. Voy a usar Henry Shine. Número seis, sutura quirúrgica.

Prefiero hacer puntos cuadrados. Creo que aguantan mejor. Y vamos a empezar simplemente metiendo la aguja por ahí, tirando de ella, envolviéndola tres veces, agarrando el extremo, tirando de ella.

1, 2, 3, corta el exceso. Por lo tanto, lo que quieres es seguir bajando por la línea de manera uniforme, espaciar y apretar. Y usted quiere ir un poco más allá de donde se detiene la incisión y atar de nuevo.

Y me estoy acercando a eso ahora. Tire del tejido hacia atrás o de la piel un poco hacia atrás. Hay un poco de sangrado allí.

Debería estar bien. Tenemos un cauterizador a mano en caso de que tengamos sangrado, lo que sucede ocasionalmente. Y su cauterizador funciona bien para detener eso.

Entonces, está bien, estoy más allá de la incisión. Me detendré ahí. Tira a través, haz un bucle, gira tres veces, agarra el bucle y tira de él hacia abajo.

Gira tres veces, agarra el lazo, tira de él y apaga el exceso. Coloque la aguja en los objetos punzantes. Y luego vamos a usar una grapadora.

Vamos a usar grapas de tamaño siete en este animal. Usamos siete para los ratones. Nueve para las ratas.

Simplemente agarra la piel, tira de ella un poco hacia arriba y comienza a cortarla. Vuelve a coger el clip. Queremos ir espaciados uniformemente hasta un poco más allá de la incisión y eso es bueno.

A continuación, limpie toda el área con una toallita con alcohol. Y luego le daremos una inyección de buprenorfina para asegurarnos de que experimente algún dolor. Y continuaremos monitoreándola durante los próximos días para asegurarnos de que se mantenga saludable y no tenga ningún tipo de dolor.

Bien, ahora que le hemos dado una inyección de buprenorfina, vamos a ponerla de nuevo en su jaula original para que se sienta cómoda cuando se despierte, la pondremos en la incubadora y le permitiremos permanecer allí durante 20 minutos más o menos hasta que esté completamente despierta y seca. Hemos Le mostramos cómo realizar in vivo en el útero, electroporación de plasma, ADN. Podemos inyectar cualquier molécula.

Podría ser a cuadros D o podrían ser drogas. Los factores de crecimiento mueren. Si necesitas que estas moléculas entren en las células y no pasen por difusión pasiva, necesitarás electroporación y para eso, las moléculas tendrán que estar cargadas.

Pero básicamente las posibilidades son ilimitadas. Un ejemplo de un vector alternativo para la entrega de genes en la célula. Nuestros virus.

Y en el pasado hemos utilizado retrovirus para etiquetar gls con ADN y mostrar cómo se dividen y se convierten en neuronas, migrando finalmente a la corteza después de etiquetar las células con un virus o mediante electroporación, o inyectar drogas o cualquier otra molécula para afectar el desarrollo del cerebro. Esto se puede estudiar mediante varias técnicas. Una de ellas es hacer TimeLapse en el que harás cultivos de cortes organotípicos.

Y luego seguirás el destino de las células usando un microscopio. Como puedes ver aquí, el tiempo 0.0. Comenzamos con un grupo de células que están muy cerca del ventrículo lateral.

Y a medida que pasa el tiempo, podemos ver que las células comienzan a migrar fuera de la zona ventricular y hacia la placa cortical. Además, fijamos los embriones y hacemos inmunohistoquímica para estudiar, ya sabes, la distribución de diferentes moléculas, o para determinar el destino de estas diferentes células. Otra posibilidad es hacer electrofisiología.

Identificamos las celdas de etiqueta y luego estudiamos sus propiedades eléctricas. Bueno, gracias por estar con nosotros hoy. Esperamos que disfrutes de nuestras demostraciones y que tengas éxito en la realización de tus experimentos.

Si tiene alguna pregunta, no dude en contactarnos. Ya sabes, buena suerte.