Name: Transfección de células madre neurales humanas con el Nucleofector Amaxa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Aprende a transfectar células madre neurales humanas mediante electroporación con el Nucleofector Amaxa. Este protocolo eficiente permite estudiar la función génica en neurociencia con alta viabilidad celular.

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Los autores desean agradecer al Dr. Philip H. Schwartz de la Comisión Nacional de Recursos Humanos de las células madre neurales en el Hospital Infantil s, Condado de Orange el Instituto de Investigación para proporcionar culturas hNSPC.

Nota: Consulte la pases Humanos troncales nerviosas artículo células ( <a href="/index/Details.stp?ID=263">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> ) y el conteo Humanos troncales nerviosas artículo células ( <a href="/index/Details.stp?ID=262">https://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262</a> ) para aprender a volver a suspender y contar hNSPCs. Preparación <ol><li> Asegúrese de que hay un montón de células disponibles para la transfección (varios millones de células por cada ADN se transfectadas). </li><li> Cubra un plato de cultivo de tejidos, en la que las células transfectadas será cabeza de serie, con 10 mg / ml fibronectina humana la noche antes de la transfección. Justo antes de iniciar el protocolo de transfección, retire la fibronectina, enjuagar el recipiente con PBS, y los medios de comunicación sitúan la cultura en el plato. Deja el plato en el 37 ° C incubadora de cultivo de tejidos para calentar los medios de comunicación. Además, colocar 1 ml de medio de cultivo en la incubadora para pre-calentar a 37 º C. </li><li> Coloque el ADN (s) para ser transfectadas, y la solución de transfección (de Amaxa), en el hielo. </li></ol> Transfección <ol><li> Lavar un número determinado de células con PBS (por lo general el uso ~ 5 x 106 células por transfección). Precipitar las células por centrifugación (1000 rpm (~ 200xg) durante 5 minutos), eliminar la mayor cantidad posible de PBS y resuspender el botón celular en 100 l de la solución de transfección suministrado con el kit de transfección. La transferencia de la suspensión de células a un tubo de 1,7 ml eppendorf. </li><li> Añadir 5 l de ADN (~ 5-10 ug de ADN por transfección) a la suspensión celular y mezclar suavemente. </li><li> Utilizando el mini-Amaxa pipeta, transferir la mezcla de células de ADN en una cubeta de transfección Amaxa. Asegúrese de que tiene de 1 ml de medio de cultivo pre-calentado para el siguiente paso. También, retirar la cápsula de células con medio de cultivo de la incubadora y colocarlo en la capilla de cultivo de tejidos. </li><li> Coloque la cubeta en el Nucleofector, gire la rueda hacia la derecha, y seleccionar el programa &quot;A-033&quot;. Pulse Intro. </li><li> Un éxito de la transfección se indica por la presencia de una capa muy densa de burbujas en la parte superior de la solución en la cubeta. Añadir 500 l de medios cálidos en la cubeta, y con el mini-Amaxa pipeta, transferir las células transfectadas en el plato, pre-calentado los medios de comunicación. Enjuague el tubo con los medios de comunicación más caliente y añadir el enjuague para el mismo plato. Coloque el plato con las células en los 37 ° C incubadora de cultivo de tejidos. </li></ol>

<ol><li>Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+non-viral+method+for+gene+transfer+into+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">New non-viral method for gene transfer into primary cells.</a> Methods. 33, 151-163 (2004).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> (2007).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Counting Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262</a> (2007).</li>
</ol>

Este protocolo describe un procedimiento de transfección relativamente rápido y eficaz para hNSPCs. El uso de este procedimiento, se han obtenido eficiencias de transfección inicial de ~ 35%. Las células transfectadas por este procedimiento puede ser utilizado para estudios a corto plazo (células transfectadas transitoriamente) o para estudios a largo plazo si un agente de selección se utiliza para generar una población transfectadas establemente. Hemos generado células transfectadas establemente en el que ~ 70% de las células que expresan ...

<table><tbody><tr><td>Dispositivo Nucleofector</td><td>Herramienta</td><td>Amaxa</td><td>AAD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Kit Nucleofector para células madre neurales de ratón</td><td>Reactivo</td><td>Amaxa</td><td>VPG-1004</td><td></td></tr></tbody></table>

transfección de células madre neurales humanas con el nucleofector amaxa

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

La transfección de células primarias de mamífero neural, como la humana madre neurales / células precursoras (hNSPCs), con reactivos de uso común lípido catiónico transfección a menudo ha resultado en la viabilidad celular pobres y la eficiencia de transfección de baja. Otros métodos mecánicos de la introducción de un gen de interés, tales como una pistola de genes o de la microinyección, también están limitados por la viabilidad celular pobres y un bajo número de células transfectadas. La estrategia de utilizar las construcciones virales para introducir un gen exógeno en las células primarias se ha visto limitada tanto por la cantidad de tiempo y mano de obra necesaria para crear vectores virales y posibles problemas de seguridad. Se describe aquí un protocolo de paso a paso para la transfección hNSPCs con dispositivo Nucleofector Amaxa y la tecnología eléctrica con los parámetros actuales y las soluciones buffer optimizado específicamente para la transfección de células madre neurales. El uso de este protocolo, que han alcanzado eficiencias de transfección inicial de ~ 35% ~ 70% y después de la transfección estable. El protocolo implica la combinación de un elevado número de hNSPCs con el ADN que se transfectadas en el tampón adecuado seguido por electroporación con el dispositivo Nucleofector.

La introducción de un gen de interés en una célula es un poderoso método para dilucidar su función en vivo. Este protocolo describe un método eficaz para la transfección de una cultura de derechos humanos madre neurales / células precursoras (hNSPCs) utilizando el aparato de electroporación Nucleofector hecha por Amaxa.

Transfección de células madre neurales humanas con el Nucleofector Amaxa

Transfección de células neurales primarias de mamíferos, tales como células madre/precursoras neurales humanas (hNSPCs), con transfección lipídica catiónica de uso común...

Hola, soy Steve. Trabajo en el laboratorio del Dr. Flanagan en el Departamento de Patología de la uc, Irvine. Hoy les mostraré cómo transfectar células precursoras neuronales humanas utilizando un factor nuclear maxis.Primero que todo, necesitará muchas células. Diría que al menos un frasco T25 confluyente, ya que este protocolo requiere una densidad celular muy alta, por lo que necesitará al menos un millón de células. Primero, voy a comenzar separando las células de la superficie utilizando tampón de disociación celular y luego contándolas.Y para ese procedimiento, consulte mi protocolo de transfección. La razón por la que prefiero usar Amaxa en mis experimentos de transfección es porque Amaxa desarrolla protocolos de transfección personalizados para tipos celulares específicos, y en mi caso, para células madre neurales. Y funciona muy bien.Proporciona una eficiencia de transfección muy alta y una viabilidad celular muy elevada. Comencemos. Ahora estoy listo para realizar una transfección.Así que, como preparación para esta transfección, ya he recubierto mi placa de cultivo celular con fibrina durante la noche. Y después de eso, he añadido algo de medio de crecimiento. En este mo

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

A pesar de los recientes avances en la modificación genética, la transfección de células madre embrionarias humanas (células madre embrionarias humanas) sigue siendo un proceso caprichoso. Para nuestro conocimiento, los métodos sistemático y eficiente para transfectar las células madre pluripotentes inducidas (CMPi) no se han reportado. Aquí se describen los protocolos robustos para transfectar eficiente y nucleofect CMPi humanos.

Transfección y Nucleofecting Humanos células madre pluripotentes inducidas

Este video describe una técnica precisa de edición del genoma en células madre pluripotentes inducidas humanas, o hiPSCs, que utilizan TALEN para crear roturas de doble cadena en un locus específico, induciendo la reparación dirigida por homología para la integración de genes de proteínas de fluorescencia.

Integración de genes dirigidos mediada por TALEN: uso de nucleasas específicas de secuencia modificadas para la inserción precisa de genes de proteínas fluorescentes en hiPSC

Este video muestra la reprogramación directa de células progenitoras hematopoyéticas modificadas genéticamente en células madre neuronales. Los factores de transcripción expresados por las células progenitoras hematopoyéticas desencadenan una cascada de eventos moleculares que facilitan su transformación. Se utilizan otros medios específicos para seleccionar y cultivar células madre neuronales inducidas.

Reprogramación directa de células progenitoras hematopoyéticas en células madre neurales

Este video demuestra el proceso de inducir células madre pluripotentes humanas para diferenciarse en neuronas transfectándolas con lentivirus modificados genéticamente que llevan un gen de factor de transcripción neurogénico bajo el control de un elemento sensible a la tetraciclina, seguido de un tratamiento con un derivado de tetraciclina y un medio de maduración.

Diferenciación de células madre pluripotentes humanas en neuronas utilizando lentivirus modificados

Líneas celulares Reporter ofrecen un medio para visualizar, controlar y aislar las células de interés por parte de las poblaciones heterogéneas. Sin embargo, gen de la orientación mediante recombinación homóloga convencional en células madre de embriones humanos es extremadamente ineficiente. Aquí se describe la orientación del SNC locus cerebro medio específico Pitx3 factor de transcripción con EGFP usando nucleasa dedo de zinc mejorado recombinación homóloga.

Nucleasa dedo de zinc-gen mejorada en células madre embrionarias humanas

Se desarrolló un método para derivar directamente las células madre neurales humanas a partir de células progenitoras hematopoyéticas enriquecidas a partir de células de sangre periférica.

La inducción directa de las células madre neurales humanas a partir de células de sangre periférica progenitoras hematopoyéticas

La edición génica mediada por TALEN en el locus AAVS1 de puerto seguro permite la adición de transgenes de alta eficiencia en iPSCs humanas. Este protocolo describe los procedimientos para la preparación de iPSCs para TALEN y la administración de vectores donantes, la transfección de iPSCs y la selección y aislamiento de clones de iPSC para lograr la integración dirigida de un gen GFP para generar líneas reporteras.

La transfección, selección y Colonia-cosecha de células madre humanas pluripotentes inducidas TALEN dirigidos con un gen GFP en el puerto seguro AAVS1

Aquí, describimos un método detallado para la edición de genes sin fisuras en células madre pluripotentes humanas utilizando un plásmido donante basado en piggyBac y el mutante de nickasa Cas9. Se introdujeron dos mutaciones puntuales en el exón 8 del locus alfa del factor nuclear 4 de hepatocitos (HNF4α) en células madre embrionarias humanas (hESCs).

Introducción de mutaciones puntuales en células madre pluripotentes humanas mediante la edición perfecta del genoma

Aquí, describimos un sistema de nucleofección diseñado para mejorar la eficiencia de la entrega de genes en células madre neurales expandidas (NSC) aisladas de la zona subventricular murina adulta. Los hallazgos demuestran que este método mejora significativamente la perturbación génica en las NSC, superando la efectividad de los protocolos tradicionales de transfección y mejorando la tasa de supervivencia celular.

Aislamiento, expansión y nucleofección de células madre neurales de la zona subventricular murina adulta

Aquí, describimos un protocolo para diseñar células madre químicamente reprogramadas para lograr una modulación neuronal precisa mediante la diferenciación de estas células en células precursoras dopaminérgicas, trasplantándolas a modelos de ratón de la enfermedad de Parkinson y evaluando los resultados conductuales y electrofisiológicos para confirmar la integración exitosa y la efectividad funcional de las células trasplantadas.

Regulación quimiogenética en células precursoras derivadas de células madre reprogramadas en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas

Aprende a transfectar células madre neurales humanas mediante electroporación con el Nucleofector Amaxa. Este protocolo eficiente permite estudiar la función génica en neurociencia con alta viabilidad celular.

Transfección de células madre neurales humanas con el Nucleofector Amaxa

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