Transfección de células madre neurales humanas con el Nucleofector Amaxa
19 de julio de 2007
La introducción de un gen de interés en una célula es un poderoso método para dilucidar su función en vivo. Este protocolo describe un método eficaz para la transfección de una cultura de derechos humanos madre neurales / células precursoras (hNSPCs) utilizando el aparato de electroporación Nucleofector hecha por Amaxa.
Hola, soy Steve. Trabajo en el laboratorio del Dr. Flanagan en el Departamento de Patología de la uc, Irvine. Hoy les mostraré cómo transfectar células precursoras neuronales humanas utilizando un factor nuclear maxis.
Primero que todo, necesitará muchas células. Diría que al menos un frasco T25 confluyente, ya que este protocolo requiere una densidad celular muy alta, por lo que necesitará al menos un millón de células. Primero, voy a comenzar separando las células de la superficie utilizando tampón de disociación celular y luego contándolas.
Y para ese procedimiento, consulte mi protocolo de transfección. La razón por la que prefiero usar Amaxa en mis experimentos de transfección es porque Amaxa desarrolla protocolos de transfección personalizados para tipos celulares específicos, y en mi caso, para células madre neurales. Y funciona muy bien.
Proporciona una eficiencia de transfección muy alta y una viabilidad celular muy elevada. Comencemos. Ahora estoy listo para realizar una transfección.
Así que, como preparación para esta transfección, ya he recubierto mi placa de cultivo celular con fibrina durante la noche. Y después de eso, he añadido algo de medio de crecimiento. En este momento está en el incubador esperando recibir las células.
Además, he preparado todos mis reactivos, mi vector de ADN y la solución de transfección. Así que todo está esperando aquí sobre hielo. Y estoy listo para comenzar la transfección.
Entonces, este es el factor nuclear M máx, y antes de colocarlo en la cabina, lo voy a desinfectar con etanol al 70 % y luego lo voy a secar con una toalla de papel. Acabo de contarme a mí mismo para asegurarme de tener un total de 4 millones de células y las he sembrado. Ahora estoy listo para comenzar la transfección.
Primero voy a eliminar el medio en el que se encuentran. Tengo mi pellet celular justo aquí, y voy a aspirar el medio en el que estaban. Voy a tratar de eliminar la mayor cantidad posible de medio, porque no quiero que haya proteínas ni sustancias similares en el medio de transfección, ya que esto podría afectar el protocolo de transfección.
Así que he eliminado casi todo el medio, y ahora voy a resuspender este pellet celular en cien microlitros de esta solución específica de factores nucleares para células madre neurales de ratón. Mxa fabrica una solución de transfección para transfectar células madre neurales de ratón, y aunque no tienen una formulación para células madre neurales humanas, descubrimos que la solución para células de ratón funciona muy bien. Así que voy a tomar cien microlitros de esta solución de efectores nucleares para células madre neurales de ratón.
Y voy a resuspender muy bien mi precipitado celular en él, de modo que no queden grumos de células. Así, básicamente, obtendré una suspensión celular homogénea. Por lo tanto, voy a pipetear arriba y abajo aproximadamente 10 veces.
Entonces, creo que ahora tengo una mezcla bastante homogénea, y voy a transferirla ahora a un tubo Eppendorf abierto de 1,5 ml. Estoy usando una pipeta P1000 y me aseguraré de obtener toda esta solución. Ahora tengo mis 4 millones de células resuspendidas en solución de transfección para ratón, nueva solución para ratón, y ahora voy a añadir cinco microlitros de mi vector.
Así que lo he mantenido en hielo todo este tiempo hasta ahora. Y entonces, primero voy a cuadruplicar cinco microlitros. Ahora voy a añadirlo a la suspensión celular.
Ahora voy a usar un P200 ajustado a unos 50 microlitros, y voy a mezclar bien, muy bien las células con el vector. Así que voy a pipetear arriba y abajo 10 veces. Bien, eso ya está listo.
Y yo, estoy listo para transfectar. Así que voy a abrir un nuevo tubo ette. Además, voy a tomar una pipeta especial proporcionada por Amaxa.
Ahora voy a quitar la tapa y voy a extraer suavemente esta mezcla. Voy a insertar la pipeta completamente dentro del vial y voy a expulsar la solución suavemente. Voy a encender el factor nuclear máximo y voy a configurarlo en 33 0 3 3, luego voy a presionar enter.
Luego voy a colocar el vete en el soporte para vete y, a continuación, giraré la rueda; ahora estoy listo para transfectar. Pero antes de eso, verificaré que tengo medio tibio preparado para añadirlo inmediatamente a las células transfectadas. Eso ayuda a aumentar la viabilidad celular si añado medio tibio al vete justo después de la transfección.
Así que voy a preparar un P1000. Y también voy a tomar el medio ya preparado que está en este momento en la incubadora, para poder transferir las células al medio inmediatamente. Ahora voy a presionar enter nuevamente y ya está listo.
Y la transfección exitosa, como pueden ver, presenta aquí una capa muy gruesa de burbujas que indica una transfección exitosa. Así que voy a añadir 500 microlitros de medio precalentado al vial. Estoy añadiendo más medio que las células desean desesperadamente, y voy a usar la misma pipeta MX para extraer las células del vial.
Así que en este momento están muy estresadas. Por lo tanto, voy a colocarlas directamente en medio tibio, más medio tibio. Y finalmente, el último paso: voy a enjuagar el Q vete con un poco más de medio precalentado para asegurarme de recuperar todas estas células, y luego lo colocaré en el mismo pocillo L y pondré la placa inmediatamente en el incubador.
En esta imagen, observamos células precursoras neuronales humanas que han sido transfectadas con un factor nuclear de acceso y sembradas sobre cubreobjetos cuadriculados. Incluso dos días después de la transfección, tenemos una eficiencia de transfección de aproximadamente el 50 %, que podemos observar mediante la expresión de GFP. Hoy les he mostrado cómo transfectar células precursoras neuronales humanas utilizando el factor nuclear Xis.
Buena suerte con su transfección.
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Descripción general
Este protocolo describe un método eficiente para transfectar células madre/neurales precursoras humanas (hNSPCs) utilizando el aparato de electrotransferencia Nucleofector. El proceso es crucial para estudiar la función génica in vivo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Análisis de la función génica
Antecedentes
- La transfección es una técnica clave para el estudio de genes.
- Las células precursoras neuronales humanas son fundamentales para la investigación en neurociencia.
- La tecnología Nucleofector mejora la eficiencia de la transfección.
- Comprender la función de los genes puede conducir a avances en neurobiología.
Objetivo del estudio
- Introducir un gen de interés en células progenitoras neurales humanas (hNSPCs).
- Elucidar la función de genes en un contexto neural.
- Proporcionar un protocolo confiable para investigadores.
Métodos Utilizados
- Disociación celular utilizando un tampón.
- Conteo de células para asegurar una alta densidad.
- Uso del aparato Nucleofector para la electrotransferencia.
- Transfección de células precursoras neuronales humanas.
Resultados Principales
- Transfección exitosa de hNSPCs.
- La alta densidad celular es crucial para una transfección eficaz.
- El protocolo demuestra reproducibilidad en los resultados.
- Facilita estudios posteriores sobre la función génica.
Conclusiones
- El protocolo es efectivo para la transfección génica en cNPCs humanas.
- Proporciona una base para futuras investigaciones en neurociencia.
- Mejora la comprensión de los roles genéticos en el desarrollo neural.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La transfección de células madre/neurales precursoras humanas (hNSPCs) sigue siendo un cuello de botella en la validación de dianas en neurociencia debido a la baja eficiencia y viabilidad con métodos convencionales. El protocolo de electrotransferencia mediante Nucleofector descrito permite una entrega génica confiable con una eficiencia de transfección inicial de ~35% y estable de ~70%, lo que apoya la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. Este enfoque mejora la confianza predictiva para la interrogación de vías y la validación funcional de dianas en modelos de enfermedades neurodegenerativas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación funcional de dianas terapéuticas en un sistema neural humano fisiológicamente relevante.
- Valor operativo: Logra una alta eficiencia de transfección sin los plazos de producción de vectores virales ni preocupaciones de bioseguridad.
- Valor predictivo: Facilita la reducción del riesgo asociado a dianas al vincular la modulación génica con fenotipos neuronales en un formato escalable.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera resultados cuantitativamente medibles (por ejemplo, expresión de GFP) para ensayos de respuesta a dosis y cribado fenotípico.
- Valor operativo: Utiliza parámetros estandarizados de electrotransferencia y un tampón optimizado para obtener resultados reproducibles entre experimentos.
- Preparación del ensayo: Produce células transfectadas establemente, adecuadas para el desarrollo prolongado de ensayos y estudios de interacción con dianas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Utiliza células neuronales humanas primarias, lo que aumenta la relevancia para los mecanismos de enfermedades humanas en comparación con líneas inmortalizadas.
- Modelado Preclínico: Permite la creación de modelos neuronales isogénicos para la validación de dianas y estudios del mecanismo de acción.
- Avance Ajustado al Riesgo: Facilita la evaluación temprana de los efectos de la modulación de dianas antes de recurrir a modelos in vivo.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método de transfección con Nucleofector se integra en la fase temprana del descubrimiento, facilitando la validación de dianas hasta la identificación de compuestos prometedores mediante la modulación génica confiable en células neuronales humanas relevantes para la enfermedad.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante la sobreexpresión o inhibición eficiente de genes en cNPCs humanos.
- Selección: Proporciona células listas para ensayos con métricas de transfección cuantificables para la selección de compuestos y la validación de dianas.
- Análisis: Permite lecturas basadas en fluorescencia (por ejemplo, GFP) para cuantificar la eficiencia de transfección y correlacionarla con resultados fenotípicos.
- Investigación Traducional: Utiliza células humanas primarias para mejorar la fidelidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma estandarizada y reutilizable de transfección para múltiples dianas y programas en el descubrimiento en neurociencia.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del blanco mediante una entrega génica eficiente y reproducible en células neuronales humanas primarias.
- Valor operativo: Elimina la necesidad de producción de vectores virales, reduciendo los plazos y la carga de seguridad biológica.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al permitir la evaluación funcional temprana de blancos en un sistema relevante para el ser humano.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al reducir la ambigüedad biológica en el mecanismo del blanco.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el cultivo de células primarias y en la optimización de la electrotransferencia.
- Depende del acceso al dispositivo Nucleofector y a soluciones de transfección específicas para cada tipo celular.
- Exige la estandarización de la densidad celular y de la concentración de ADN entre diferentes usuarios y laboratorios.
- Implica consideraciones de adaptación al extenderse a otros tipos celulares primarios, neuronales o no neuronales.
- Está limitado por la necesidad de una alta cantidad inicial de células y un manejo inmediato tras la transfección para mantener la viabilidad.
