Name: Analizando la expresión de superficie de los receptores Quimiosensoriales en células heterólogas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Aprende a detectar la expresión de superficie de receptores quimiosensoriales en células HEK293T mediante tinción en células vivas. Este protocolo utiliza inmunofluorescencia para visualizar receptores de manera efectiva.

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Agradecemos a los miembros de Matsunami de laboratorio para la lectura crítica de este manuscrito.

1. Procedimiento: El procedimiento consta de tres partes completadas en un tiempo total de 3 días: la transferencia de células, transfección y la inmunocitoquímica, un paso llevado a cabo al día. Transferencia y la transfección de células en los dos primeros días se llevó a cabo en condiciones estériles en una cámara de flujo laminar. Día 1: Traslado de las células HEK293T para el ensayo de la superficie de la expresión. <ol><li> Medio de transmisión (M10): Mezclar medio mínimo esencial suplementado con 10% (en volumen) de suero fetal bovino en condiciones estériles. </li><li> Se cultivan las células a una confluencia deseado en una placa de cultivo de 100 mm, dependiendo del número de platos necesarios para configurar. Es importante para determinar la fracción de células que se transfieren para evitar las células cubierto o escasa: por ejemplo, de un 100% confluentes plato de 100 mm, se puede transferir de 3% a un plato de 35 mm para obtener aproximadamente el 30% de confluencia en el este último. </li><li> Antes de la transferencia de células, en la cámara de flujo laminar estéril, capa de 22 X 22 mm se desliza con cubierta de vidrio estéril lisina poli D (1 mg / ml) y colocar una en cada placa de cultivo celular de 35 mm, con revestimiento hacia arriba para las células de revestimiento (Figura 1 ). Deje que la solución se seque durante 5 - 10 minutos. Durante este intervalo, la fuente de UV en la cámara de laminar puede ser activado para esterilizar el cubreobjetos, si lo desea. Poli D lisina ayuda a las células heterólogas se adhieren a la cubierta se desliza. </li><li> Para la transferencia de células, aspirar a los medios de comunicación existentes en la placa de 100 mm, lave cuidadosamente la adición de 8 ml de PBS estéril, aspirar el PBS y trypsinize las células en 3 mL 0,05% de tripsina-EDTA, cuando las células se desprenden de la placa, bloque de reacción enzimática más la adición de 5 ml M10. Triturar las células y la transferencia de volumen requerido para un tubo cónico estéril, centrifugar a 200 g durante 5 minutos para que sedimenten las células. Aspirar a cabo sobrenadante que contiene tripsina-EDTA, dejando el pellet de células intactas. Para transferir las células a placas de 35 mm, añada 1 ml M10 para cada plato y triturar para disociar las células. Añadir 1 ml de las células se resuspendieron a cada plato. Las células se incuban durante la noche a 37 ° C, 5% de CO 2. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Coat 22 X 22 mm cubreobjetos de vidrio con poli-D de lisina y el lugar estucado por una cara en cada plato de 35 mm. </li></ol> Día 2: La transfección de células HEK293T. <ol><li> 18-24 horas después de la transferencia, las células están listas para la transfección de los receptores a ensayar. El uso de los receptores y RTP1S clonado en el vector de expresión de mamíferos PCI, preparado a partir de cultivos bacterianos utilizando Qiagen Miniprep protocolo Kit se describe a continuación antes de las 4. Use receptores que son etiquetados con terminal N 20 aminoácidos de largo epítopo rodopsina para facilitar la inmunotinción. </li><li> El uso de la construcción de 1000 ng receptor, 250 ng de RTP1S construir y 50 ng de proteína de fluorescencia verde cada transfección. Realizar la transfección utilizando Lipofectamine 2000, según manual del fabricante. </li></ol> Día 3: La inmunocitoquímica para visualizar receptores de las células teñidas superficie. <ol><li> Antes de comenzar, prepare las manchas y soluciones de lavado y enfriamiento a 4 ° C. Tinción medio: medio esencial mínimo, 45 ml, suero fetal bovino, 5 ml; HEPES (1M), 500 l (concentración final 10 mM), azida de sodio (1,5 M), 500 l (concentración final 15 mM). Solución de lavado: HBSS, 500 ml; HEPES (1M), 5 ml (concentración final 10 mM), azida de sodio (1,5 M), 5 ml (concentración final 15 mM). Ambas soluciones pueden ser almacenadas a 4 º C para su reutilización. Preparar las soluciones de anticuerpos mediante la dilución de anticuerpos necesarios en el medio de tinción de 100 veces. </li><li> Inicio inmunoquímica para la tinción de la superficie de los receptores de olor alrededor de 24 horas después de la transfección. Para realizar la tinción de células vivas, el trabajo experimental debe ser enfriado a 4 ° C: llenar un gran contenido de hielo y patrones de la superficie de hielo para que sea lo más uniforme posible, coloque una bandeja en el hielo y rociarlo con el 70% etanol. Cortar un trozo de parafina (más pequeño que la longitud de la bandeja) y colocar en la bandeja de etanol rociado, para obtener una superficie lisa. La transferencia de la cubierta de vidrio que contiene las células transfectadas se desliza sobre la parafina, de uno en uno, lado celda hacia arriba, usando unas pinzas. Cada capa de hoja de cubierta con 100 L solución fría tinción primaria, extrusión cuidadosamente una esquina de la hoja (Figura 2). Después de todas las capas de la cubierta se desliza con una solución de anticuerpos, la cubierta de la bandeja para evitar el secado de la solución en el aire. Llevar a cabo la incubación primaria durante 45-60 minutos. </li><li> Después de la incubación primaria, de forma rápida transferencia de la cubierta se desliza a las placas de cultivo de 35 mm original, que contiene los medios de comunicación. Aspirar los medios de comunicación y agregar 2 ml de solución de lavado enfriado ligeramente desde el borde del plato para evitar la pérdida de las células de la hoja de la cubierta. Aspirar la solución de lavado y repetir dos veces para completar tres lavados. Al final del tercer lavado, no aspirar a la solución de lavado. </li><li> Prepare anticuerpo secundario solutien los medios de tinción y la transferencia de la cubierta se desliza desde la solución de lavado a una capa de parafina recién colocada en la misma bandeja. Una vez más suave extrusión de 100 L de solución de anticuerpos a la capa de cada hoja de la cubierta, desde la esquina, como la incubación primaria. Llevar a cabo la incubación secundaria de 30 a 45 minutos y traslado de regreso a la solución de lavado de la vajilla original de 35 mm. Una vez más, lavar la cubierta se desliza tres veces como se describe. </li><li> Aspirar la solución de lavado de último lavado y añadir 2 ml de paraformaldehído al 1% frío. Fijar las células en una solución fría paraformaldehído al 1%, en hielo durante 15 minutos. </li><li> Monte la cubierta se desliza sobre el cristal de microscopio limpio diapositivas con montaje Mowiol reactivo, con la cara de la celda hacia abajo y con cautela excluir todas las burbujas de aire (Figura 3). Deje secar al aire una vez Mowiol, lavar la cubierta se desliza suavemente por la adición de agua destilada en la superficie y aspirar de inmediato. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Capa de cada cubreobjetos con 100 L solución fría tinción primaria. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Montar el cubreobjetos con la cara hacia abajo en la celda de cristal de microscopio limpios diapositivas usando el reactivo de montaje Mowiol. </li></ol> 2. Los resultados representativos: Tinción de células vivas le permite a uno visualizar las proteínas en la superficie de las células, en la transfección de los receptores con los acompañantes (en este caso de los receptores odoríferos Olfr62, con RTP1S receptor de proteína transportadora) (Figura 4). Tinción de la superficie celular de los receptores se caracteriza por el patrón de tinción puntiforme (Figura 4B, el recuadro). Tinción realizado inadecuadamente puede conducir a un mayor ruido, lo que hace difícil para el observador para distinguir las manchas de la superficie real del ruido. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Transfección Figura 4. De los receptores con chaperones permite la visualización de proteínas en la superficie de las células mediante la tinción de células vivas. Transfección del receptor odorante Olfr62 solo (A) y la transfección de Olfr62 con acompañante RTP1S (B). Los niveles de expresión de GFP servir como control de transfección (A 'y B').

<ol><li>Buck, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors%3A+a+molecular+basis+for+odor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65, 175-187 (1991).</li>
<li>Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+receptor+codes+for+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Combinatorial receptor codes for odors.</a> Cell. 96, 713-723 (1999).</li>
<li>Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RTP+family+members+induce+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors.</a> Cell. 119, 679-691 (2004).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cell-surface+expression+and+measuring+activation+of+mammalian+odorant+receptors+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells.</a> Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).</li>
</ol>

Cada paso debe ser realizado cuidadosamente para asegurarse de tinción de la superficie importante y distintivo. El proceso de tinción completa debe ser llevado a cabo en frío (sobre hielo), y la bandeja en la que se establecen cubreobjetos debe ser enfriado antes de su uso para asegurar las células sobrevivir. Por otra parte la fijación se realiza al final del proceso de tinción de la superficie. Esto está en agudo contraste con la tinción de interior en el que precede a la fijación de tinción para permeabilizar las me...

<table><tbody><tr><td>Cubreobjetos de 22 x 22 mm (#1)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>72200-11</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Medio mínimo esencial</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4655</td><td>Con L-glutamato, sales de Earle&amp;rsquo;s y bicarbonato</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>EMS</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) 1X</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>14025</td><td>Con cloruro de calcio y cloruro de magnesio</td></tr><tr><td>Solución tampón HEPES</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>Sin calcio ni magnesio</td></tr><tr><td>Poli-D-lisina hidrobromuro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SX0299-1</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de 35 x 10 mm</td><td>Falcon BD</td><td>353801</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>25300</td><td>0,05%</td></tr></tbody></table>

analizando la expresión de superficie de los receptores quimiosensoriales en células heterólogas

Assaying Surface Expression of Chemosensory Receptors in Heterologous Cells

El vívido mundo de los olores es reconocido por el sentido del olfato. El olfato de los ratones es mediada por un repertorio de alrededor de 1.200 receptores acoplados a proteínas G (GPCR) 1 que se postulan para unirse las moléculas volátiles de olor y la conversión de la señal extracelular en una señal intracelular mediante el acoplamiento con la proteína G Gαolf. La unión de los olores de los receptores se cree que siguen una regla combinatoria, es decir, un olor puede obligar a varios receptores y un receptor puede unirse olores varios en distintos grados 2. Señalización bioquímica, y ligando los estudios de unión han sido convenientemente llevado a cabo para la mayoría de los GPCRs utilizando células heterólogas. Sin embargo el uso de células heterólogas para el estudio de los receptores de olor, fue excluida por mucho tiempo ya que en la transfección no pudieron exportar a la superficie. Saito et al han demostrado receptores de membrana de una sola pasada de Transporte de proteínas (RTP) acompañantes de la familia muestran una mayor expresión en las neuronas olfativas sensoriales y actuar como acompañantes a los receptores de olor de tráfico a la superficie en células heterólogas, cuando co transfectadas juntos 3. Para llevar a cabo los análisis bioquímicos de los receptores con células heterólogas, primero hay que determinar si el receptor muestra la expresión de superficie sólida en la línea celular. Esto se puede probar por sobreexpresión de los receptores con el RTP1S acompañante seguido por tinción de células vivas para la etiqueta fluorescente el dominio extracelular o una etiqueta en el dominio extracelular de forma exclusiva. Aquí se demuestra un protocolo para llevar a cabo la tinción de células vivas que se pueden utilizar para detectar los receptores de olor en la superficie de las células HEK293T convenientemente. Además, también puede ser utilizado para el ensayo de expresión en la superficie de otros receptores o quimiosensoriales GPCRs.

Aquí se demuestra un protocolo para llevar a cabo la tinción de células vivas que se pueden utilizar para detectar los receptores de olor en la superficie de las células HEK293T convenientemente. Además, también puede ser utilizado para el ensayo de expresión en la superficie de otros receptores o quimiosensoriales GPCRs.

Analizando la expresión de superficie de los receptores Quimiosensoriales en células heterólogas

El vívido mundo de los olores es reconocido por el sentido del olfato. La olfacción en los ratones está mediada por un repertorio de aproximadamente 1200 receptores acoplados a proteínas G...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo puede detectarse la expresión en superficie de receptores quimiosensoriales mediante tinción de células vivas en células HEK 293T, lo cual se logra primero sembrando las células sobre laminillas recubiertas con poli-D-lisina en placas de cultivo. El segundo paso del procedimiento consiste en transfectar ADN en células HEK 293T. El tercer paso del procedimiento es realizar la tinción de células vivas utilizando anticuerpos primarios y secundarios conjugados con fluoro 4.El paso final del procedimiento consiste en fijar las células teñidas y montar las laminillas. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran la localización de receptores en la superficie de las células mediante microscopía de inmunofluorescencia. Este método nos permite detectar receptores quimiosensoriales exportados a la superficie celular de células heterólogas como las HK 2 93 T. Una demostración visual de este método indicará los pasos clave que deben seguirse cuidadosamente para mantener vivas las células durante la auto-tinción celular.Las personas nuevas en este método pueden encontrar complicados pasos como la transferencia, manipulación y montaje del cubreobjetos. Sin embargo, tras algunas prácticas, la técnica resulta sencilla. Con un protocolo modificado que utiliza una columna cgen, purifique el ADN plasmático del receptor y del receptor. El transporte del RT TP proteico clonado en un vector de expresión PCI asegura que, para la inmunotinción, el receptor recubierto esté marcado en su extremo C-terminal con un epítopo de 20 aminoácidos de longitud para facilitar la adherencia de las células.Codifique cubreobjetos de vidrio con un miligramo por mililitro. Después, coloque los cubreobjetos con la capa de polilisina hacia arriba en placas de cultivo celular de 35 milímetros para que sequen al aire dentro de la cámara de flujo laminar estéril. Siembre células HT K 2 9 3 T hasta alcanzar aproximadamente una densidad del 30 % en un mililitro de medio M 10, asegurándose de que no queden burbujas de aire atrapadas entre el cubreobjetos y la placa de cultivo celular. Incube a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante 18 a 24 horas. Para cada transfección, prepare una mezcla de ADN compuesta por 1000 nanogramos del constructo del receptor, 250 nanogramos del constructo RTP uno s y 50 nanogramos del constructo GFP.Según las instrucciones del fabricante, transfecte las células con lipectomía 2000. Prepare el medio de tinción añadiendo azida sódica y hippies a M 10. Este puede almacenarse a cuatro grados Celsius durante varios meses.A continuación, prepare un tampón de lavado con azida sódica 15 milimolar y heis 10 milimolar. En HBSS frío, el tampón de lavado puede almacenarse a cuatro grados Celsius durante varios meses. Para realizar la tinción en frío, coloque una bandeja con parfum y déjela sobre hielo durante cinco minutos.Con el lado de las células hacia arriba, transfiera las laminillas de vidrio que contienen las células transfectadas al paraform desde la esquina de la laminilla. Añada cuidadosamente 100 microlitros de anticuerpo primario frío diluido en medio de tinción. Incube durante 60 minutos a temperatura ambiente. Lave ahora las células en las placas de cultivo originales de 35 milímetros alternando la adición y la aspiración de solución de lavado fría.Repetir dos veces. De manera similar, incubar con el anticuerpo secundario conjugado SI tres durante 30 minutos. Realizar los lavados tres veces en las placas de 35 milímetros.Finalmente, fije las células con solución fría de paraformaldehído al 1%. Tenga cuidado de excluir todas las burbujas de aire. Monte las laminillas con el lado de las células hacia abajo sobre portaobjetos utilizando mole, enjuague la superficie de las laminillas con agua destilada para eliminar los depósitos de sal.Típicamente, al igual que con el OL FFR 62 y los RTP, la tinción de receptores en la superficie celular se caracteriza por la aparición de señales fluorescentes punteadas provenientes del anticuerpo conjugado. Una vez dominada, esta técnica puede utilizarse para teñir entre 32 y 40 cubreobjetos en tan solo dos horas y media a tres horas. Al realizar este procedimiento con múltiples cubreobjetos, es importante transferir e iniciar la incubación con el anticuerpo un cubreobjeto a la vez para evitar que las células se sequen.

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Research

Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

Fuente: de March, C. A. et. al., Monitoreo in vitro en tiempo real de la activación del receptor de odorante por un odorante en la fase de vapor. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra el método para monitorear la activación en tiempo real de los receptores de odorantes en células recombinantes de mamíferos utilizando la medición de luminiscencia. La unión de odorantes desencadena la activación de la proteína G y la producción de AMPc, activando las proteínas glosensoras que emiten...

Monitorización en tiempo real de la activación del receptor odorante en células recombinantes

La activación persistente de inhibidores G acoplados a proteínas receptores da como resultado la sensibilización de la señalización de la adenilato ciclasa. Para identificar las vías moleculares esenciales, los enfoques no sesgada son necesarios, sin embargo, esta estrategia requiere el desarrollo de un ensayo de sensibilización cAMP basada en células escalable. Aquí se describe un ensayo para la sensibilización y la detección de moléculas pequeñas siRNA.

Inducido por fármacos Sensibilización de adenilciclasa: Racionalización Ensayo y miniaturización de moléculas pequeñas y siRNA aplicaciones de cribado

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Caracterizar la función de receptores odorantes sirve una parte indispensable en el proceso de deorphanization. Se describe un método para medir la activación de receptores odorantes en tiempo real utilizando un ensayo de campo.

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