Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 3:13 min. • September 26th, 2025
Tome un cultivo de Bacillus megaterium, una bacteria grampositiva.
Diluir el cultivo en medios frescos e incubarlo agitándolo para promover la división bacteriana.
Transfiera el cultivo a un tubo y centrífuzcalo para granular las bacterias.
Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en un medio que contenga estabilizadores osmóticos para evitar la lisis de los protoplastos.
Transfiera la solución resuspendida a un matraz, agregue lisozima e incube agitando.
Durante la incubación, la lisozima degrada la gruesa pared celular de peptidoglicano de la bacteria.
A medida que la pared celular se degrada, las bacterias cambian de una forma en forma de varilla a cuerpos esféricos limitados solo por la membrana plasmática, formando protoplastos.
Visualice la suspensión bajo un microscopio.
Las bacterias de forma redonda confirman la formación de protoplastos, mientras que las bacterias hinchadas en forma de varilla indican una digestión incompleta.
Transfiera la solución a un tubo y centrífuga para granular los protoplastos.
Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los protoplastos en medios nuevos que contengan estabilizadores osmóticos para su posterior análisis.
Para preparar protoplastos Gram-positivos de B. megaterium , diluya el cultivo bacteriano durante la noche en una proporción de uno a 1000 en 100 mililitros de TSB al tres por ciento en un matraz de 250 mililitros para una incubación de 4,5 horas a 37 grados Celsius con agitación. Cuando el cultivo líquido alcance una densidad óptica de 0,9 a 1,0 a 600 nanómetros, divida las bacterias en dos tubos cónicos de 50 mililitros para su centrifugación y use una pipeta sirológica para aspirar los sobrenadantes. Vuelva a suspender los gránulos en 2,5 mililitros de medio de protoplasto por tubo y tire de la suspensión en un solo tubo cónico para el cultivo en un matraz de 125 mililitros.
Agregue un mililitro de cinco miligramos por mililitro de lisozima al cultivo para una incubación de una hora a 37 grados centígrados con agitación. Monitorear el crecimiento del protoplasto bajo el microscopio óptico y observar cualquier irregularidad, como bacterias que aparecen como bastones hinchados en lugar de esferas. Al final de la incubación, transfiera la suspensión a un tubo cónico de 15 mililitros para centrifugación y vuelva a suspender el gránulo en cinco mililitros de medio protoplasto.
El protoplasto se puede almacenar a menos 20 grados centígrados durante una semana o hasta que hayan pasado por tres ciclos de congelación y descongelación.