Name: Superficies micropatterned para estudiar las interacciones de ácido hialurónico con células de cáncer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-22T17:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Aprende a crear superficies micropatterned con ácido hialurónico para estudiar la adhesión y migración de células de cáncer. Este método utiliza fotolitografía estándar y química de carbodiimida para visualizar interacciones celulares.

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Los autores reconocen el uso del laboratorio de análisis de la superficie en la Universidad Johns Hopkins, financiado en el marco de la Investigación en Ciencias de Materiales e Ingeniería a través de la National Science Foundation. LED es un aprendiz de IGERT y un becario de la Fundación Nacional de Ciencias de Posgrado. Esta investigación fue financiada parcialmente por el NIH subvención U54CA143868.

1. La fotolitografía estándar para la fabricación de sellos micropatterned <ol><li> Aclarar una oblea de silicio nuevo con etanol y secar con corriente de aire. Use unas pinzas para manipular la oblea y prevenir los defectos de la superficie durante todo el proceso. </li><li> Transferencia de obleas para hacer girar recubrimiento y cubrir la superficie de la oblea con el SU-2025 fotosensible negativa. Cubrir al menos el 80% de la oblea con fotoprotector. Giro capa durante 10 segundos a 600 rpm, seguido de 30 segundos a 3000 rpm. Debido a la fotosensibilidad de la fotosensible, apagar luces de la sala a partir de ahora. </li><li> Transferencia de obleas de silicio fotosensible recubierto con placa caliente de "soft-cocer al horno" a 95 ° C durante 3 minutos. Retire de la placa caliente y dejar un minuto para enfriar. </li><li> Coloque una pre-fabricados máscara con el modelo deseado en la parte superior de la oblea de silicio fotosensible cubierto y exponer a los rayos ultravioleta (UV) (350-450 nm) durante 20 segundos. </li><li> Transferencia de obleas de silicio de la placa caliente de "hard-cocer al horno" a 110 ° C durante 6 minutos. </li><li> Encienda las luces y retirar la oblea de la placa caliente. Distintos patrones deben ser visibles en este momento. </li><li> Enjuagar cuidadosamente oblea de silicio con SU-8 desarrollador fotosensible. Después de tres enjuagues con solución reveladora, enjuagar con etanol. Si cualquier residuo blanco, repita enjuague con solución reveladora fotosensible, o simplemente sumergirse en la oblea solución reveladora durante 2 minutos y proceder de nuevo con etanol enjuague. Lavar con agua y aire seco. </li><li> Mezcla de polidimetilsiloxano (PDMS) solución de elastómero y agente de curado en una proporción de 10:1. Centrifugar a 900 rpm durante 5 minutos para eliminar las burbujas de aire. </li><li> Lugar con dibujos de obleas en una placa de Petri y verter PDMS en oblea de silicio. Si hay burbujas presentes, lugar en desecador de vacío y un par de minutos hasta que las burbujas desaparezcan. </li><li> Curar toda la noche a temperatura ambiente (TA) para formar un sello elastomérico complementarias. Si PDMS no sana completamente después de 12 horas, lugar en el horno a 60 ° C durante 30 minutos. </li><li> Retire con cuidado PDMS de oblea de silicio. Use un filo de la navaja para cortar el sello al tamaño deseado. Sonicado en etanol durante 15 minutos. Obleas se pueden utilizar varias veces para crear nuevos sellos de elastómero. </li></ol> 2. HA micropatterning <ol><li> Plasma de vidrio limpio se desliza por 5 minutos. Coloque todos los portaobjetos en la cámara de vacío y durante 5 minutos. A continuación, permitir el flujo bajo de oxígeno para entrar en la cámara. A su vez limpio el plasma durante 5 minutos. Eliminar de limpiador de plasma y colocarlo en una placa de Petri con las pinzas. </li><li> Durante la limpieza de plasma, ultrasonidos sellos PDMS en etanol durante 15 minutos. </li><li> Preparar un nuevo máximo de 3% v / v de 3-aminopropiltrimetoxisilano (APTMS) en el 95% v / v de etanol en un tubo de centrífuga de 15 ml. Dejar actuar durante 5 minutos a temperatura ambiente para formar un silanol. </li><li> Coloque el sello del patrón de PDMS-up sobre la transferencia de aplicador plato y cubrir con una solución de modelado de superficie APTMS. Spincoat a 3500 rpm durante 30 segundos. No toque la superficie del sello, sólo los lados del sello PDMS. </li><li> Transferir la solución a la APTMS plasma limpiar las superficies de vidrio: El sello de conjunto hacia abajo en un extremo del lado del patrón y se deslizan suavemente presionando PDMS lo que es completamente en contacto con la superficie del vidrio durante 1 minuto. </li><li> Retire con cuidado el sello PDMS, y permitir que la diapositiva patrón de vidrio para la incubación en RT durante 30 minutos. Enjuague las superficies modeladas con etanol y secar al aire. Sonicar PDMS sello durante 15 minutos para eliminar el exceso de APTMS. </li><li> Las superficies de calor en el horno o en la placa caliente durante 1 hora a 115 º C. Enjuagar con etanol y secar con aire. </li><li> Prepare polietilenglicol fresca (PEG)-silano solución de 20% v / v 2 - [metoxi (polietilenoxi) propil] trimetoxisilano en tolueno. Esto servirá como una región no adhesiva alrededor de los patrones. </li><li> Transferencia de lámina de vidrio con dibujos a un plato de Petri de vidrio y se incuban en PEG-silano solución durante 45 minutos a 75 ° C en un plato caliente. Enjuague con tolueno, el agua y secar con aire. </li><li> Esterilizar durante 1 hora con irradiación germicida ultravioleta en una cámara de seguridad biológica. Proceder en el gabinete de seguridad biológica a partir de ahora para mantener la esterilidad. </li><li> Prepare una solución acuosa estéril HA. 10 mM de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) 5 mM de N-hidroxisuccinimida 50 microgramos / ml marcado con fluoresceína HA </li><li> Aplique una solución de HA a los sustratos de vidrio con dibujos en condiciones de esterilidad y protegido de la luz. Estampados sustratos deben ser molestados durante 16-24 horas. </li><li> Aspirar de solución de HA, lavar con tampón fosfato salino (PBS), y cubrir la superficie con bovino al 1% de albúmina sérica (BSA) en PBS durante 1 hora. La superficie ya está lista para el cultivo celular. </li></ol> 3. Cultivo de células en superficies HA micropatterned <ol><li> Ampliar MDA-MB-231 células humanas de cáncer de mama y LS174T células carcinoma colorrectal, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Suspensiones de semillas de células individuales de las células cancerosas con una densidad de entre 0,4 y 1x10 2 de superficie de vidrio y en superficies HA inmovilizado. Incubar en incubadora humidificada (37 ° C) en atmósferas mantiene con 5% de CO 2. La adhesión celular debe ocurrir dentro de 24 horas y se puede observar con microscopio de luz invertida </li><li> Las superficies de cultivo celular puede mantenerse hasta por 5 días en condiciones estándar de la incubadora. Cambiar los medios de comunicación todos los días. Morfología de las células y el crecimiento se puede observar con microscopio de luz invertida. Otros ensayos celulares se pueden aplicar para analizar las respuestas a la superficie de HA. </li></ol> 4. Los resultados representativos: La química carbodiimida para inmovilizar covalentemente HA a las diapositivas de cristal APTMS patrón se muestra en la Figura 1. EDC es un agente de reticulación de longitud cero que reacciona con grupos carboxilo HA para formar amina reactiva intermedios. Ya que este medio es susceptible a la hidrólisis, NHS se agrega para aumentar la eficacia de la reacción de carbodiimida. Como solución de HA interactúa con micropatrones APTMS, se forma una amida estable vínculo entre HA intermedios y amina primaria de ATPMS. Un ejemplo de HA superficie modelada visualizaron utilizando un microscopio de fluorescencia y un análisis ImageJ intensidad de fluorescencia demostrar la inmovilización con dibujos de HA se muestran (Figura 1B-C). Las superficies HA micropatterned permitirá el estudio de las interacciones de célula de cáncer con HA expgenous. Tanto MDA-MB-231 materna y LS174T líneas celulares humanas de cáncer de colon preferentemente se adhieren a las regiones micropatterned HA (Figura 2). Imágenes de alta resolución mediante microscopía electrónica de barrido se puede utilizar para analizar las interacciones de las células cultivadas con superficies HA inmovilizado (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 HA micropatterned superficies (A) Esquema que describe el desarrollo de superficies funcionales HA, (B) Imagen de fluorescencia de la fluoresceína (verde) de la etiqueta HA superficie micropatterned. (C) de píxeles 3D mapa de distribución utilizando el software ImageJ demostrando los patrones HA discretos. Barra de escala = 100μm. Modificado a partir de 9 con permiso de Elsevier. <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Cáncer de adhesión celular en las superficies HA micropatterned. Ambos puntos (A) y de mama (B) carcinoma de preferencia conforme a los parches de HA con 24 horas de cultivo. Modificado a partir de 9 con permiso de Elsevier. <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Interacción de las células del cáncer con HA. (A) Digitalización de imágenes de microscopía electrónica de las células de cáncer de colon (A) en las superficies cultivadas HA demostrado a bajo aumento (izquierda) y el gran aumento (derecha, de las plazas a la izquierda) y de las células de cáncer de mama (B) cultivadas en las superficies de HA se muestra a bajo aumento (izquierda) y el gran aumento (derecha, de los cuadrados de la izquierda).

<ol><li>Toole, B. P., Wight, T. N., Tammi, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan-cell+interactions+in+cancer+and+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan-cell interactions in cancer and vascular disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 277, 4593-4596 (2002).</li>
<li>Hamilton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hyaluronan+Receptors+CD44+and+Rhamm+%28CD168%29+Form+Complexes+with+ERK1%2C2+That+Sustain+High+Basal+Motility+in+Breast+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Hyaluronan Receptors CD44 and Rhamm (CD168) Form Complexes with ERK1,2 That Sustain High Basal Motility in Breast Cancer Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 16667-16680 (2007).</li>
<li>Götte, M., Yip, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparanase%2C+Hyaluronan%2C+and+CD44+in+Cancers%3A+A+Breast+Carcinoma+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Heparanase, Hyaluronan, and CD44 in Cancers: A Breast Carcinoma Perspective.</a> Cancer Research. 66, 10233-10237 (2006).</li>
<li>Lord, M. S., Pasqui, D., Barbucci, R., Milthorpe, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+adsorption+on+derivatives+of+hyaluronic+acid+and+subsequent+cellular+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Protein adsorption on derivatives of hyaluronic acid and subsequent cellular response.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A 91, 635-646 (2009).</li>
<li>Barbucci, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+hyaluronic+acid+by+sulphate+groups+insertion+to+obtain+a+heparin-like+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Gazz.+Chim.+Ital%22%5BJournal%5D)">Modification of hyaluronic acid by sulphate groups insertion to obtain a heparin-like molecule.</a> Gazz. Chim. Ital. 125, 169-180 (1995).</li>
<li>Morra, M., Cassinelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-fouling+properties+of+polysaccharide-coated+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomaterials+Science%2C+Polymer+Edition%22%5BJournal%5D)">Non-fouling properties of polysaccharide-coated surfaces.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 10, 1107-1124 (1999).</li>
<li>Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-by-layer+deposition+of+hyaluronic+acid+and+poly-L-lysine+for+patterned+cell+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Layer-by-layer deposition of hyaluronic acid and poly-L-lysine for patterned cell co-cultures.</a> Biomaterials. 25, 3583-3592 (2004).</li>
<li>Ibrahim, S., Joddar, B., Craps, M., Ramamurthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surface-tethered+model+to+assess+size-specific+effects+of+hyaluronan+%28HA%29+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A surface-tethered model to assess size-specific effects of hyaluronan (HA) on endothelial cells.</a> Biomaterials. 28, 825-835 (2007).</li>
<li>Dickinson, L. E., Ho, C. C., Wang, G. M., Stebe, K. J., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+surfaces+for+high-resolution+analysis+of+cancer+cell+interactions+on+exogenous+hyaluronic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Functional surfaces for high-resolution analysis of cancer cell interactions on exogenous hyaluronic acid.</a> Biomaterials. 31, 5472-5478 (2010).</li>
<li>Gao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+oligosaccharides+promote+excisional+wound+healing+through+enhanced+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan oligosaccharides promote excisional wound healing through enhanced angiogenesis.</a> Matrix Biology. 29, 107-116 (2010).</li>
<li>Slevin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan-mediated+angiogenesis+in+vascular+disease%3A+Uncovering+RHAMM+and+CD44+receptor+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan-mediated angiogenesis in vascular disease: Uncovering RHAMM and CD44 receptor signaling pathways.</a> Matrix Biology. 26, 58-68 (2007).</li>
</ol>

Figura esquemática de vídeo reproducido con permiso; Derechos de Autor Wiley-VCH Verlag GmbH &amp; Co. KGaA. Dickinson LE, Kusuma S, Gerecht S. La reconstrucción del nicho de diferenciación de las células madre embrionarias con biomateriales. Macromol. Biosci. 2010, 21 de octubre. [Epub ahead of print].

El método presentado micropatterning HA permite el estudio de las interacciones celulares con exógenos HA. HA se sabe que juega un papel clave en la progresión del cáncer 1, sin embargo ha habido pocos estudios investigando la interacción de las células cancerosas en dos dimensiones superficies HA patrón. Un estudio controlables en exógenos micropatrones HA de alta resolución permite la visualización de la adhesión de las células cancerosas, el crecimiento y la migración y puede aclarar aún más los fundamento...

<table><tbody><tr><td>Fotorresistente SU-2025</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y111069</td><td></td></tr><tr><td>Desarrollador SU-8</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropiltrimetoxisilano (APTMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>2-[metoxi(polietilenoóxi)propil]trimetoxisilano (silano Peg)</td><td>Gelest Inc.</td><td>SIM6492.7</td><td></td></tr><tr><td>1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hidroxisuccinimida (NHS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>Ácido hialurónico marcado con fluoresceína (FL-HA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1177</td><td>Reconstituir con 10 ml de agua desionizada</td></tr><tr><td>Células de carcinoma de mama MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Células de carcinoma de colon LS174t</td><td>ATCC</td><td>Cl-188</td><td></td></tr></tbody></table>

superficies micropatterned para estudiar las interacciones de ácido hialurónico con células de cáncer

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Invasión y progresión del cáncer consiste en un fenotipo de células móviles, que se encuentra bajo una regulación compleja de factores de crecimiento / citocinas y componentes de la matriz extracelular (ECM) en el microambiente del tumor. El ácido hialurónico (HA) es un componente del estroma ECM que se conoce para facilitar la progresión del tumor por la invasión de la mejora, el crecimiento y la angiogénesis 1. Interacción de HA con su superficie celular CD44 receptor induce eventos de señalización que promueven el crecimiento celular del tumor, la supervivencia y la migración, aumentando así la diseminación metastásica 2-3. HA es un glicosaminoglicano aniónicos, nonsulfated compuesto por unidades repetidas de ácido D-glucurónico y DN-acetilglucosamina. Debido a la presencia de grupos carboxilo e hidroxilo en las unidades de disacárido repetir, HA nativo es en gran parte hidrofílica y es susceptible de modificaciones químicas que introducen grupos sulfato para la inmovilización de photoreative 4-5. Los estudios anteriores referentes a la inmovilización de HA en las superficies de utilizar el comportamiento bioresistant de HA y sus derivados sulfatados para controlar la adhesión celular en las superficies de 6-7. En estos estudios de forma preferente la adhesión celular se produce en las regiones no-HA patrón. Para el análisis de las interacciones celulares con HA exógeno, se han desarrollado patrones superficies funcionales que permiten un estudio controlable y de alta resolución de visualización de las interacciones de célula de cáncer con HA. Hemos utilizado la impresión microcontacto (UCP) para definir regiones discretas patrón de HA en la superficie de vidrio. A &quot;tethering&quot; enfoque que se aplica la química que une carbodiimida para inmovilizar HA fue utilizada 8. Las superficies de cristal se microcontacto impresa con una aminosilano y reaccionó con una solución de HA de las relaciones optimizada de la EDC y NHS para permitir la inmovilización en matrices de estampado HA. La incorporación de la química carbodiimida con MCP permitió la inmovilización de HA de regiones definidas, la creación de superficies aptas para aplicaciones in vitro. Tanto las células de cáncer de colon y las células de cáncer de mama implícitamente interactuado con la superficie de HA micropatterned. Adhesión de las células cancerosas se produjo dentro de las 24 horas, con la proliferación de las 48 horas. HA utilizando superficies micropatterned, hemos demostrado que la adherencia de las células cancerosas se produce a través del receptor CD44 HA. Por otra parte, HA superficies modeladas eran compatibles con microscopía electrónica de barrido (SEM) y de imágenes permitió a alta resolución de las protuberancias del cáncer de células adhesivo y la difusión en los patrones de HA para analizar la motilidad de las células cancerosas en HA exógeno.

Un nuevo enfoque que permite el análisis de la alta resolución de las interacciones de célula de cáncer con exógena de ácido hialurónico (HA) se describe. Superficies modeladas se fabrican mediante la combinación de la química y la impresión por microcontacto carbodiimida.

Superficies micropatterned para estudiar las interacciones de ácido hialurónico con células de cáncer

La invasión y progresión del cáncer implican un fenotipo celular móvil, el cual está sujeto a una regulación compleja por parte de factores de crecimiento/citocinas y la matriz extracelular...

La invasión y progresión del cáncer implican un fenotipo celular modal, que se encuentra bajo una regulación compleja por factores de crecimiento, citocinas y componentes de la matriz extracelular dentro del microambiente tumoral. El ácido hialurónico o HA es un componente estromal de la matriz extracelular que se sabe facilita la progresión tumoral al potenciar la invasión, el crecimiento y la angiogénesis mediante la interacción del HA con su receptor en la superficie celular. La interacción del CD44 induce eventos de señalización que promueven el crecimiento, la supervivencia y la migración de las células tumorales, aumentando así la diseminación metastásica para estudiar la adhesión, migración y crecimiento de células cancerosas sobre HA exógeno.Se utiliza fotolitografía estándar para fabricar un sello elastomérico con microestructuras, el cual luego se emplea para crear un arreglo patroneado de moléculas de aminosilano sobre sustratos de vidrio. A continuación, se realiza una química de carbodiimida para unir covalentemente el ácido hialurónico (HA) al aminosilano patroneado. De este modo, se generan microestructuras de HA sobre las cuales se pueden sembrar células cancerosas en cultivo, y las interacciones de las células cancerosas con el ácido hialurónico exógeno pueden visualizarse mediante microscopía óptica, técnicas de imagen de alta resolución como microscopía electrónica de barrido o microscopía inmunofluorescente.El método para crear superficies de hidroxiapatita con microestructuras que se presenta en este artículo de video puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del cáncer, como esclarecer aún más el papel del ácido hialurónico exógeno en la progresión del cáncer. Para fabricar un sello de polimetil siloxano o PDMS con microestructuras, que se utilizará para imprimir portaobjetos de vidrio con ha, comience por tomar una oblea de silicio nueva con pinzas.Luego, sobre un fregadero de laboratorio. Utilice un frasco lavador para enjuagar la oblea con etanol y séquela con un chorro de aire. Apague las luces del cuarto.Luego, utilizando pinzas, transfiera la oblea a un spin coater usando una cubierta de pipeta de transferencia, cubriendo al menos el 80 % de la superficie de la oblea con SU-2025, un resistente fotográfico negativo; aplique el recubrimiento por centrifugado durante 10 segundos a 600 RPM. A continuación, durante 30 segundos a 3000 RPM, transfiera la oblea recubierta con el resistente fotográfico a una placa calefactora y realice un prehorneado suave a 95 grados Celsius durante tres minutos. Luego, retírela de la placa calefactora y déjela enfriar durante un minuto.Coloque una máscara prefabricada con el patrón deseado sobre la oblea recubierta con resist fotolitográfico y exponga a luz UV durante 20 segundos. A continuación, transfiera la oblea a una placa calefactora y realice un horneado fuerte a 110 grados Celsius durante seis minutos.Encienda las luces y retire la oblea de la placa calefactora. En este momento, deberían ser visibles patrones distintos con una pipeta de transferencia. Enjuague cuidadosamente la oblea con el revelador de fotoresina SU eight después de tres enjuagues con la solución reveladora, y luego enjuague con etanol.Si hay algún residuo blanco presente, repita el enjuague con la solución reveladora de fotoresistente o simplemente sumerja la oblea en la solución reveladora durante dos minutos y enjuague nuevamente con etanol, lave con agua y seque con un chorro de aire en una embarcación grande de suero.Para eliminar cualquier burbuja de aire, coloque la oblea grabada en una placa de Petri del tamaño adecuado. Vierta suficiente solución de PDMS sobre ella para cubrir completamente la oblea con un espesor de aproximadamente un cuarto de pulgada. Si hay burbujas presentes en la superficie de la oblea, colóquela en un desecador al vacío hasta que desaparezcan.Deje curar durante la noche a temperatura ambiente para formar un sello elastomérico complementario. Si el PDMS no ha curado completamente después de 12 horas, coloque la oblea en un horno a 60 grados Celsius durante 30 minutos. Retire cuidadosamente el PDMS de la oblea.Luego, utilizando una cuchilla, corte el sello al tamaño deseado. Coloque el sello en un vaso de vidrio con etanol, preferiblemente dentro de un soporte de plástico, y sométalo a sonicación durante 15 minutos. Las obleas pueden usarse varias veces para crear nuevos sellos elastoméricos con el fin de inmovilizar covalentemente ha sobre superficies de vidrio en parches definidos.Comience limpiando todas las laminillas que se vayan a utilizar en un limpiador de plasma según las instrucciones del texto adjunto. Después de limpiar las laminillas de vidrio, utilice pinzas para retirarlas del limpiador de plasma. Coloque las laminillas en una placa de Petri de plástico y déjelas apartadas para su uso posterior.A continuación, prepare la solución de amino silano que se depositará sobre el portaobjetos de vidrio para unir el ácido hialurónico en un tubo cónico de poliestireno de 15 mililitros. Prepare una solución fresca al 3% volumen por volumen de trimetoxi-3-aminopropilo (A-P-T-M-S) en etanol al 95% volumen por volumen, hasta un volumen total de cinco mililitros. Deje que la solución reaccione durante cinco minutos a temperatura ambiente.Durante este período, el A-P-T-M-S se convierte por hidrólisis en un ciol. A continuación, tocando únicamente los lados, coloque el patrón del sello de PDMS hacia arriba en el portamuestras del espinador. Utilice una pipeta de transferencia para cubrir la superficie del patrón con A-P-T-M-S.Luego, aplique por centrifugado la superficie del sello con A-P-T-M-S a 3.500 RPM durante 30 segundos. Después de retirar el sello de PDMS del centrífugo, inviértalo de modo que el lado del patrón quede mirando hacia abajo, coloque un extremo del sello de PDMS en el centro del portaobjetos de vidrio y presione suavemente para que todo el sello entre en contacto con el portaobjetos durante un minuto. A continuación, retire cuidadosamente el sello de PDMS y deje reposar el portaobjetos de vidrio con el patrón de A-P-T-M-S a temperatura ambiente.Después de 30 minutos, enjuague la superficie del patrón con etanol y seque con un chorro de aire ultrasónico. Someta el sello de PDMS a ultrasonido durante 15 minutos para eliminar cualquier exceso de A-P-T-M-S. Luego coloque los portaobjetos sobre una placa calefactora durante una hora a 115 grados Celsius para calentar las superficies y eliminar el exceso de agua.Lave con etanol y seque con aire utilizando pinzas. Transfiera la placa con el patrón a una placa de Petri de vidrio. Utilice una pipeta de transferencia para cubrir completamente la placa de vidrio con una solución recién preparada de polietilenglicol o solución de peg cline, que servirá como una región no adhesiva que rodea los patrones.Tras una incubación de 45 minutos a 75 grados Celsius, deseche la solución excedente de salina PEG. Luego, sosteniendo la portaobjetos con pinzas, enjuague la superficie de las portaobjetos grabadas con tolueno y posteriormente con agua, y seque con un chorro de aire. Coloque las portaobjetos en una caja para portaobjetos humectada.Luego coloque la caja en un gabinete de seguridad biológica y encienda la lámpara UV durante una hora para realizar la irradiación germicida. Continúe trabajando en el gabinete de seguridad biológica a partir de este momento. Para mantener la esterilidad fuera del flujo laminar, prepare una solución acuosa estéril de HA de un mililitro que consista en 10 milimolar.Un milimolar de etil tres tres dimetil amino propil carbodiimida o EDC y 50 microgramos por mililitro de hidroxi CIN. La EDC marcada con fluoresceína estéril es un agente de reticulación de longitud cero que reacciona con los grupos carboxilo del HA para formar intermediarios reactivos con aminas. Dado que este intermediario es susceptible a la hidrólisis, se añade NHS para aumentar la eficiencia de la reacción del carbodiimida.A continuación, aplique alícuotas de 200 microlitros de solución estéril de HA sobre el vidrio grabado hasta cubrir el área patroneada. Cierre la caja de portaobjetos para proteger los portaobjetos de la luz. Los sustratos patroneados deben dejarse bajo la campana sin perturbar durante 16 a 24 horas mientras la solución de HA interactúa con el A-P-T-M-S micrograbado, formándose un enlace estable MI entre el intermedio de HA y la amina primaria del A-P-T-M-S.Al día siguiente, utilice una pipeta Pasteur APA para aspirar la solución de HA. Lave las laminillas con PBS y luego cubra la superficie con BSA al 1 % en PBS durante una hora. La superficie ya está lista para el cultivo celular.Coloque las superficies micropatrón de HA en una placa de Petri estéril para cultivar sobre superficies micropatrón de HA. Siembre suspensiones de células individuales de células cancerosas con densidades entre 0,4 y una vez 10 a la sexta células cancerosas por 18,75 centímetros cuadrados de superficie de vidrio en un mililitro de medio celular, cubriendo cuidadosamente la superficie del portaobjetos; coloque luego las células en una incubadora humedecida a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Tenga cuidado de que el medio no se derrame; la adhesión celular debe ocurrir dentro de las 24 horas y puede observarse utilizando un microscopio óptico invertido.Las superficies de cultivo celular pueden mantenerse hasta cinco días. En condiciones estándar de incubadora, cambie el medio cada dos días. La morfología y el crecimiento celular pueden observarse utilizando un microscopio óptico invertido.Luego se pueden aplicar ensayos celulares adicionales para analizar las respuestas a la superficie de HA en el ejemplo mostrado aquí. Superficie de patrón de HA visualizada mediante microscopio fluorescente y una imagen. El análisis de la intensidad de fluorescencia J demuestra la desmovilización del patrón de ha.Las superficies con patrones microestructurados de HA permiten el estudio de las interacciones de las células cancerosas con HA exógeno. Aquí se muestra la adhesión de células cancerosas sobre superficies con micropatrones de HA. Tanto las células de carcinoma de colon como de mama se adhirieron preferentemente a los parches de HA tras 24 horas de cultivo. Mediante imágenes de alta resolución obtenidas por microscopía electrónica de barrido se pueden analizar las interacciones de las células cultivadas con superficies inmovilizadas de HA.En este micrografía electrónica de barrido se observa la interacción de células de cáncer de colon con HA; en la derecha se muestra una mayor magnificación. Aquí se muestran células de cáncer de mama cultivadas sobre superficies de HA; nuevamente, en la derecha se muestra una mayor magnificación. Este análisis demuestra claramente la presencia de protrusiones adhesivas que favorecen la diseminación de las células cancerosas sobre patrones microscópicos de HA.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar servicios de micropatrones de HA y aplicarlos para estudiar la respuesta de las células cancerosas.

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Bioengineering

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Micropatrones adhesivo que normalizar la arquitectura celular se puede utilizar para aumentar la sensibilidad en la detección de los efectos de drogas, mejorar la reproducibilidad y simplificar la adquisición automática de imágenes y análisis. Dicha tecnología se beneficiarán de drogas / siRNA ensayos de selección, efectuado en soportes convencionales de cultivo de células y por lo tanto sufren de exceso de célula a célula variabilidad.

Una mejor visualización y análisis cuantitativo de los efectos de drogas Uso de células micropatterned

Se presenta un protocolo para funcionalizar vidrio con parches de proteínas nanométricas rodeadas por una bicapa lipídica fluida. Estos sustratos son compatibles con el microscopio óptico avanzado y se espera que sirva como plataforma para los estudios de adhesión celular y la migración.

Arrays Ligando Nano-racimo en un Apoyado bicapa lipídica

Un método para obtener nanopatrones desigual basado en el dendrímero que permiten el control de escala nanométrica de local arginina-glicina-aspártico (RGD) superficie densidad del ácido es descrito y aplicado para el estudio de la diferenciación celular de adherencia y condrogénica.

Basado en el dendrímero nanopatrones desigual para adherencia de superficie de Control local: un método para dirigir la diferenciación condrogénica

Este estudio demuestra la utilidad y la facilidad de la medida de extensión cuantitativa membrana de la célula y su correlación con la capacidad adhesiva de las células. Como un ejemplo, aquí mostramos esa proteína Dickkopf-relacionada 3 (DKK3) promueve la formación mayor lobopodia y adhesividad celular adrenocortical carcinoma de células en vitro.

Caracterización de extensiones de la membrana de la célula y estudiar sus funciones en la dinámica de adherencia celular cáncer

Aquí presentamos un protocolo para área amplia exploración sonda Nanolitografía habilitado por el alineamiento iterativo de arreglos de discos de punta de prueba, así como la utilización de patrones litográficos para estudios de interacción de la superficie de la célula.

Área análisis sonda Nanolitografía facilitado por alineación automática y su aplicación a la fabricación de sustrato para estudios del cultivo celular

Aquí, presentamos un protocolo para el cultivo tridimensional de células de glioblastoma derivados del paciente dentro de biomateriales ortogonalmente ajustables diseñados para imitar la matriz del cerebro. Este enfoque proporciona una en vitro, plataforma experimental que mantiene muchas características de en vivo células de glioblastoma normalmente perdidas en cultura.

Ácido hialurónico basado en hidrogeles de 3 dimensiones cultura de células de Glioblastoma derivados del paciente

Una placa de imagen basado en el HMCA se presenta para el funcionamiento de ensayo de invasión. Esta placa facilita la formación de esferoides tumorales (3D) tridimensional y la medición de la invasión de células de cáncer en la matriz extracelular (ECM). La cuantificación del ensayo de invasión se logra por análisis semiautomático.

Análisis de invasión de células de cáncer y uso de hidrogel Micro-cámara matriz (HMCA) de detección de drogas anti-metastásico-basado en placas

El componente de complemento C1q es una molécula proinflamatoria altamente expresada en el microambiente tisular que puede interactuar con la matriz extracelular. Aquí, describimos un método para probar cómo C1q unido al ácido hialurónico afecta la adhesión celular.

Evaluación de la interacción entre el complemento proteína C1q y el ácido hialurónico en la promoción de la adhesión celular

La litografía UV cercana y la microscopía de fuerza de tracción se combinan para medir las fuerzas celulares en hidrogeles con micropatrones. La liberación dirigida inducida por la luz de células individuales permite un alto número de mediciones en la misma muestra.

Control de la adhesión celular mediante técnicas de patrón de hidrogel para aplicaciones en microscopía de fuerza de tracción

Describimos mejoras en un método estándar para medir las fuerzas de tracción celular, basado en la impresión de microcontacto con un solo paso de patrón sustractivo de matrices de puntos de proteínas de matriz extracelular en hidrogeles blandos. Este método permite una fabricación más simple y consistente de patrones de islas, esencial para controlar la forma del grupo celular.

Generación de patrones para microscopía de tracción de micropatrones

Presentamos un método para replicar el microambiente tumoral de glioma en el frente invasivo que incorpora flujo de líquido intersticial. Este modelo es un hidrogel de hialuronano-colágeno I en un inserto de cultivo de tejidos donde se puede aplicar un cabezal de presión de fluido. La invasión se puede cuantificar y las células se pueden aislar o lisar.

Un modelo fotopolimerizable de ácido hialurónico-colágeno del microambiente de glioma invasivo con flujo intersticial

Aprende a crear superficies micropatterned con ácido hialurónico para estudiar la adhesión y migración de células de cáncer. Este método utiliza fotolitografía estándar y química de carbodiimida para visualizar interacciones celulares.

Superficies micropatterned para estudiar las interacciones de ácido hialurónico con células de cáncer

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