Superficies micropatterned para estudiar las interacciones de ácido hialurónico con células de cáncer

La invasión y progresión del cáncer implican un fenotipo celular modal, que se encuentra bajo una regulación compleja por factores de crecimiento, citocinas y componentes de la matriz extracelular dentro del microambiente tumoral. El ácido hialurónico o HA es un componente estromal de la matriz extracelular que se sabe facilita la progresión tumoral al potenciar la invasión, el crecimiento y la angiogénesis mediante la interacción del HA con su receptor en la superficie celular. La interacción del CD44 induce eventos de señalización que promueven el crecimiento, la supervivencia y la migración de las células tumorales, aumentando así la diseminación metastásica para estudiar la adhesión, migración y crecimiento de células cancerosas sobre HA exógeno.

Se utiliza fotolitografía estándar para fabricar un sello elastomérico con microestructuras, el cual luego se emplea para crear un arreglo patroneado de moléculas de aminosilano sobre sustratos de vidrio. A continuación, se realiza una química de carbodiimida para unir covalentemente el ácido hialurónico (HA) al aminosilano patroneado. De este modo, se generan microestructuras de HA sobre las cuales se pueden sembrar células cancerosas en cultivo, y las interacciones de las células cancerosas con el ácido hialurónico exógeno pueden visualizarse mediante microscopía óptica, técnicas de imagen de alta resolución como microscopía electrónica de barrido o microscopía inmunofluorescente.

El método para crear superficies de hidroxiapatita con microestructuras que se presenta en este artículo de video puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del cáncer, como esclarecer aún más el papel del ácido hialurónico exógeno en la progresión del cáncer. Para fabricar un sello de polimetil siloxano o PDMS con microestructuras, que se utilizará para imprimir portaobjetos de vidrio con ha, comience por tomar una oblea de silicio nueva con pinzas.

Luego, sobre un fregadero de laboratorio. Utilice un frasco lavador para enjuagar la oblea con etanol y séquela con un chorro de aire. Apague las luces del cuarto.

Luego, utilizando pinzas, transfiera la oblea a un spin coater usando una cubierta de pipeta de transferencia, cubriendo al menos el 80 % de la superficie de la oblea con SU-2025, un resistente fotográfico negativo; aplique el recubrimiento por centrifugado durante 10 segundos a 600 RPM. A continuación, durante 30 segundos a 3000 RPM, transfiera la oblea recubierta con el resistente fotográfico a una placa calefactora y realice un prehorneado suave a 95 grados Celsius durante tres minutos. Luego, retírela de la placa calefactora y déjela enfriar durante un minuto.

Coloque una máscara prefabricada con el patrón deseado sobre la oblea recubierta con resist fotolitográfico y exponga a luz UV durante 20 segundos. A continuación, transfiera la oblea a una placa calefactora y realice un horneado fuerte a 110 grados Celsius durante seis minutos.

Encienda las luces y retire la oblea de la placa calefactora. En este momento, deberían ser visibles patrones distintos con una pipeta de transferencia. Enjuague cuidadosamente la oblea con el revelador de fotoresina SU eight después de tres enjuagues con la solución reveladora, y luego enjuague con etanol.

Si hay algún residuo blanco presente, repita el enjuague con la solución reveladora de fotoresistente o simplemente sumerja la oblea en la solución reveladora durante dos minutos y enjuague nuevamente con etanol, lave con agua y seque con un chorro de aire en una embarcación grande de suero.

Para eliminar cualquier burbuja de aire, coloque la oblea grabada en una placa de Petri del tamaño adecuado. Vierta suficiente solución de PDMS sobre ella para cubrir completamente la oblea con un espesor de aproximadamente un cuarto de pulgada. Si hay burbujas presentes en la superficie de la oblea, colóquela en un desecador al vacío hasta que desaparezcan.

Deje curar durante la noche a temperatura ambiente para formar un sello elastomérico complementario. Si el PDMS no ha curado completamente después de 12 horas, coloque la oblea en un horno a 60 grados Celsius durante 30 minutos. Retire cuidadosamente el PDMS de la oblea.

Luego, utilizando una cuchilla, corte el sello al tamaño deseado. Coloque el sello en un vaso de vidrio con etanol, preferiblemente dentro de un soporte de plástico, y sométalo a sonicación durante 15 minutos. Las obleas pueden usarse varias veces para crear nuevos sellos elastoméricos con el fin de inmovilizar covalentemente ha sobre superficies de vidrio en parches definidos.

Comience limpiando todas las laminillas que se vayan a utilizar en un limpiador de plasma según las instrucciones del texto adjunto. Después de limpiar las laminillas de vidrio, utilice pinzas para retirarlas del limpiador de plasma. Coloque las laminillas en una placa de Petri de plástico y déjelas apartadas para su uso posterior.

A continuación, prepare la solución de amino silano que se depositará sobre el portaobjetos de vidrio para unir el ácido hialurónico en un tubo cónico de poliestireno de 15 mililitros. Prepare una solución fresca al 3% volumen por volumen de trimetoxi-3-aminopropilo (A-P-T-M-S) en etanol al 95% volumen por volumen, hasta un volumen total de cinco mililitros. Deje que la solución reaccione durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Durante este período, el A-P-T-M-S se convierte por hidrólisis en un ciol. A continuación, tocando únicamente los lados, coloque el patrón del sello de PDMS hacia arriba en el portamuestras del espinador. Utilice una pipeta de transferencia para cubrir la superficie del patrón con A-P-T-M-S.

Luego, aplique por centrifugado la superficie del sello con A-P-T-M-S a 3.500 RPM durante 30 segundos. Después de retirar el sello de PDMS del centrífugo, inviértalo de modo que el lado del patrón quede mirando hacia abajo, coloque un extremo del sello de PDMS en el centro del portaobjetos de vidrio y presione suavemente para que todo el sello entre en contacto con el portaobjetos durante un minuto. A continuación, retire cuidadosamente el sello de PDMS y deje reposar el portaobjetos de vidrio con el patrón de A-P-T-M-S a temperatura ambiente.

Después de 30 minutos, enjuague la superficie del patrón con etanol y seque con un chorro de aire ultrasónico. Someta el sello de PDMS a ultrasonido durante 15 minutos para eliminar cualquier exceso de A-P-T-M-S. Luego coloque los portaobjetos sobre una placa calefactora durante una hora a 115 grados Celsius para calentar las superficies y eliminar el exceso de agua.

Lave con etanol y seque con aire utilizando pinzas. Transfiera la placa con el patrón a una placa de Petri de vidrio. Utilice una pipeta de transferencia para cubrir completamente la placa de vidrio con una solución recién preparada de polietilenglicol o solución de peg cline, que servirá como una región no adhesiva que rodea los patrones.

Tras una incubación de 45 minutos a 75 grados Celsius, deseche la solución excedente de salina PEG. Luego, sosteniendo la portaobjetos con pinzas, enjuague la superficie de las portaobjetos grabadas con tolueno y posteriormente con agua, y seque con un chorro de aire. Coloque las portaobjetos en una caja para portaobjetos humectada.

Luego coloque la caja en un gabinete de seguridad biológica y encienda la lámpara UV durante una hora para realizar la irradiación germicida. Continúe trabajando en el gabinete de seguridad biológica a partir de este momento. Para mantener la esterilidad fuera del flujo laminar, prepare una solución acuosa estéril de HA de un mililitro que consista en 10 milimolar.

Un milimolar de etil tres tres dimetil amino propil carbodiimida o EDC y 50 microgramos por mililitro de hidroxi CIN. La EDC marcada con fluoresceína estéril es un agente de reticulación de longitud cero que reacciona con los grupos carboxilo del HA para formar intermediarios reactivos con aminas. Dado que este intermediario es susceptible a la hidrólisis, se añade NHS para aumentar la eficiencia de la reacción del carbodiimida.

A continuación, aplique alícuotas de 200 microlitros de solución estéril de HA sobre el vidrio grabado hasta cubrir el área patroneada. Cierre la caja de portaobjetos para proteger los portaobjetos de la luz. Los sustratos patroneados deben dejarse bajo la campana sin perturbar durante 16 a 24 horas mientras la solución de HA interactúa con el A-P-T-M-S micrograbado, formándose un enlace estable MI entre el intermedio de HA y la amina primaria del A-P-T-M-S.

Al día siguiente, utilice una pipeta Pasteur APA para aspirar la solución de HA. Lave las laminillas con PBS y luego cubra la superficie con BSA al 1 % en PBS durante una hora. La superficie ya está lista para el cultivo celular.

Coloque las superficies micropatrón de HA en una placa de Petri estéril para cultivar sobre superficies micropatrón de HA. Siembre suspensiones de células individuales de células cancerosas con densidades entre 0,4 y una vez 10 a la sexta células cancerosas por 18,75 centímetros cuadrados de superficie de vidrio en un mililitro de medio celular, cubriendo cuidadosamente la superficie del portaobjetos; coloque luego las células en una incubadora humedecida a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Tenga cuidado de que el medio no se derrame; la adhesión celular debe ocurrir dentro de las 24 horas y puede observarse utilizando un microscopio óptico invertido.

Las superficies de cultivo celular pueden mantenerse hasta cinco días. En condiciones estándar de incubadora, cambie el medio cada dos días. La morfología y el crecimiento celular pueden observarse utilizando un microscopio óptico invertido.

Luego se pueden aplicar ensayos celulares adicionales para analizar las respuestas a la superficie de HA en el ejemplo mostrado aquí. Superficie de patrón de HA visualizada mediante microscopio fluorescente y una imagen. El análisis de la intensidad de fluorescencia J demuestra la desmovilización del patrón de ha.

Las superficies con patrones microestructurados de HA permiten el estudio de las interacciones de las células cancerosas con HA exógeno. Aquí se muestra la adhesión de células cancerosas sobre superficies con micropatrones de HA. Tanto las células de carcinoma de colon como de mama se adhirieron preferentemente a los parches de HA tras 24 horas de cultivo. Mediante imágenes de alta resolución obtenidas por microscopía electrónica de barrido se pueden analizar las interacciones de las células cultivadas con superficies inmovilizadas de HA.

En este micrografía electrónica de barrido se observa la interacción de células de cáncer de colon con HA; en la derecha se muestra una mayor magnificación. Aquí se muestran células de cáncer de mama cultivadas sobre superficies de HA; nuevamente, en la derecha se muestra una mayor magnificación. Este análisis demuestra claramente la presencia de protrusiones adhesivas que favorecen la diseminación de las células cancerosas sobre patrones microscópicos de HA.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar servicios de micropatrones de HA y aplicarlos para estudiar la respuesta de las células cancerosas.