Name: La estimulación mecánica de células madre utilizando tensión uniaxial cíclica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 25 min 12 s
Description: Aprende a estimular mecánicamente células madre mediante tensión uniaxial cíclica utilizando un biorreactor personalizado. Este protocolo permite investigar la biología mecánica celular con aplicaciones en ingeniería de tejidos.

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0 día - La esterilización antes del día de experimento <ol><li> Ponga los materiales en la tina de plástico y esterilizar con alcohol al 70% durante 2 horas: <ul><li> Cámaras </li><li> Tapas </li><li> Marcos (las 3 piezas) </li><li> Tornillos </li><li> Las juntas de goma </li><li> Fórceps </li><li> Tijeras </li><li> Llaves hexagonales </li></ul></li><li> Membranas limpia con agua y jabón Aquet destilada. </li><li> Sonicar membranas en alcohol al 70% durante 10 minutos. </li><li> Coloque las membranas de plástico limpia en platos cuadrados. Si se utiliza membranas de dibujos, asegúrese de que el lado estampado quede hacia arriba (alcohol spray en un lado de la membrana y velar por el líquido a correr por los surcos). </li><li> Deja membranas cubiertos en el 70% de alcohol durante 2 horas. </li><li> Guantes de paquete en papel de aluminio para autoclave mañana por la mañana. </li><li> Haga 2% (peso / volumen) solución de gelatina (2g/100mL) en agua destilada para el autoclave mañana. </li><li> Después de la esterilización de dos horas en el 70% de alcohol, coloque todos los materiales polímeros y las membranas (no autoclavable materiales) en la capilla de UV durante la noche: <ul><li> Cámaras </li><li> Tapas </li><li> Marcos (las 3 piezas) </li><li> Membranas </li></ul></li><li> Paquete de materiales sobrantes en una bolsa de autoclave: <ul><li> Tornillos </li><li> Las juntas de goma </li><li> Fórceps </li><li> Tijeras </li><li> Llaves hexagonales </li></ul></li></ol> Día 1 - La Asamblea de las cámaras se extienden <ol><li> Autoclave pinzas, tijeras, llaves hexagonales, tornillos, juntas, guantes, y la gelatina con autoclave pequeño 240 ° F durante 20 minutos en total </li><li> Quitar las membranas de los rayos UV y tratamiento con plasma de O 2 (lado del patrón hacia arriba) de aproximadamente 1 minuto. </li><li> En la campana TC, cubrir el área de modelado de las membranas de plasma tratado con gelatina. Escudo de 30 minutos bajo los rayos UV. </li><li> Lavar cada membrana con PBS 2X. Después del lavado segunda, dejar un poco de PBS en las membranas de mantener más deslizantes, para facilitar el montaje en las cámaras. (También debe utilizar este PBS para lubricar las juntas para facilitar el montaje). </li><li> Montar las membranas en las cámaras (use guantes de autoclave durante el montaje) <ol><li> Conecte las dos piezas principales de la estructura con un solo tornillo. </li><li> Da la vuelta al cuadro una y colocar una membrana en la parte superior para que las caras laterales recubiertos de gelatina hacia el bastidor (el área de modelado debe estar en el centro). </li><li> Asegurar la membrana al marco mediante una junta en cada lado. </li><li> Presione las juntas de, con suave, aunque la presión, a fin de no rasgar la membrana. </li></ol></li><li> Adjuntar marco se reunieron para T-bar. </li><li> Voltear el marco y el lugar dentro de la cámara al revés. Parte posterior del bastidor UV y de la membrana durante 30 minutos </li><li> Voltear el marco de nuevo, y el tornillo en las cámaras (sin cambio de cámara de control, pero para la cámara de estiramiento, la necesidad de utilizar dos tornillos para sujetar la pieza final de la trama en la parte inferior de la cámara, y la necesidad de quitar el tornillo que se la celebración de las dos piezas de la estructura en conjunto). Parte frontal UV durante 30 minutos. Asegúrese de que las membranas estén completamente secas antes de proceder al siguiente paso, o de lo contrario la solución de células pueden deslizarse durante la siembra. </li><li> Las células de las semillas. Área de 1 = Área placa de 3 membranas, por lo que el uso 1 / 3 de una placa confluente por membrana. Use 1 ml de solución de células por la membrana. No más que 1,5 ml, será difícil mantener la solución en. Poner la solución única celda en el área de modelado, y el uso de la pipeta para extender la solución de todo. Cubrir las cámaras y dejar que las células conectar durante 30 minutos RT en el capó. </li><li> Mover las cámaras a la incubadora y dejar que las células de conectar por 1 hora más. Tener mucho cuidado en movimiento de las cámaras para evitar que la solución de células resbale! Las células en la cámara se arruinará si la solución se cae en este momento. </li><li> Volver a la campana de la cámara y agregar 20 ml de medio. </li><li> Cámaras en lugar de alcohol limpia tina que se cubre con papel de aluminio (también rociados con alcohol). Mover las cámaras para estirar la incubadora (10% CO 2). </li><li> Cámaras de seguro en la máquina de estiramiento. Deje que las células más adjuntar toda la noche, y empezar a estirar al día siguiente. (Nota: la hora de poner cámaras en la máquina de estirar, recuerde que debe cerrar la máquina en la posición &quot;cero&quot; antes de colocar las cámaras, y luego ajuste la banda de goma alrededor de los engranajes No te olvides de desbloquear los engranajes antes de iniciar la máquina.). </li></ol>

<ol><li>Banes, A. J., Gilbert, J., Taylor, D., Monbureau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vacuum-operated+stress-providing+instrument+that+applies+static+or+variable+duration+cyclic+tension+or+compression+to+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro.</a> J Cell Sci. 75, 35-42 (1985).</li>
<li>Park, J. S., Chu, J. S., Cheng, C., Chen, F., Chen, D., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+equiaxial+and+uniaxial+strain+on+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells.</a> Biotechnol. Bioeng. 88, 359-368 (2004).</li>
<li>Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+mechanosensing+by+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 16095-16100 (2006).</li>
</ol>

Banes et al. informó por primera vez el uso de un sistema de estimulación mecánica de las células in vitro mediante el uso de un sustrato de elastómero flexible para proporcionar la fuerza mecánica a las células 1. Desde entonces, muchas variaciones en este diseño han sido concebidos y utilizados. Varios sistemas de estiramiento mecánico están disponibles comercialmente bajo el nombre de &quot;Flexercell&quot; (FlexCell International Corp.), mientras que algunos laboratorios utilizan costumbre-construido dispositivos. En este pro...

Notas sobre los medios de comunicación: Estos experimentos se extienden uniaxial son propensos a la contaminación debido a la complejidad de la configuración del biorreactor. Para combatir esto, hemos tratado de diferentes combinaciones de antibióticos y antifúngicos. El fungizone 1% suele ser necesario, junto con una combinación de antibióticos. O bien utilizar una combinación de penicilina / estreptomicina, o utilizar una combinación de kanamicina y gentamicina (pero no tratar de usar una combinación / cóctel de tres o más antibióticos juntos, ya que puede dar lugar a bacterias resistentes a los mutantes, y también puede ser perjudicial para las células) .

la estimulación mecánica de células madre utilizando tensión uniaxial cíclica

Mechanical Stimulation of Stem Cells Using Cyclic Uniaxial Strain

El papel de las fuerzas mecánicas en el desarrollo y mantenimiento de los tejidos biológicos está bien documentado, entre ellos varios fenómenos mecánicos regulados, como la remodelación ósea, la hipertrofia muscular, y la plasticidad de células musculares lisas. Sin embargo, las fuerzas implicadas son a menudo extremadamente complejos y difíciles de supervisar y controlar en vivo. Para investigar mejor los efectos de las fuerzas mecánicas de las células, hemos desarrollado un método in vitro para la aplicación de tensión uniaxial de tracción cíclica de las células adherentes cultivadas en membranas elásticas. Este método utiliza un biorreactor de diseño personalizado con un motor de leva-rotor del sistema para aplicar la fuerza deseada. Aquí se presenta un protocolo de vídeo paso a paso que muestra cómo ensamblar los distintos componentes de cada una &quot;cámara de estiramiento&quot;, incluyendo, en este caso, una membrana de silicona con la topografía micropatterned para orientar a las células con la dirección de la cepa. También se describen los procedimientos para la esterilización de las cámaras, la siembra de las células en la membrana, con retención de la cámara en el biorreactor, y el ajuste de los parámetros mecánicos (es decir, la magnitud y la velocidad de deformación). Los procedimientos descritos en este protocolo particular son específicos para la siembra de células madre mesenquimales humanas en las membranas de silicona con 10 canales de micras de ancho orientada paralela a la dirección de la tensión. Sin embargo, los métodos y materiales que se presentan en este sistema son lo suficientemente flexibles para dar cabida a una serie de variaciones sobre este tema: la velocidad de deformación, magnitud, duración, tipo de célula, la topografía de membrana, la membrana de recubrimiento, etc todo se puede adaptar a la aplicación deseada o resultado. Este es un método robusto para la investigación de los efectos de la deformación por tracción uniaxial aplicada a las células in vitro.

En general, se entiende que las fuerzas mecánicas en el cuerpo puede influir en la diferenciación y proliferación celular. Aquí se presenta un protocolo de vídeo que demuestra el uso de un biorreactor a medida para la entrega de tensión uniaxial de tracción cíclica a las células madre cultivadas en substratos flexibles micropatterned.

La estimulación mecánica de células madre utilizando tensión uniaxial cíclica

El papel de las fuerzas mecánicas en el desarrollo y mantenimiento de los tejidos biológicos está bien documentado, lo que incluye diversos procesos regulados mecánicamente...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La biosíntesis de la matriz extracelular cartilaginosa por los condrocitos pueden ser afectados por la aplicación de estímulos mecánicos. Este método describe la técnica de aplicación de dinámicas tensiones compresivas a los condrocitos encapsulados en construcciones en 3D y la evaluación de los cambios inducidos en el metabolismo de los condrocitos.

La estimulación mecánica de condrocitos-agarosa hidrogeles

Este manuscrito presenta una técnica para aplicar o liberar las fuerzas sobre las células o los tejidos adherentes utilizando estiramiento unidireccional.

El estiramiento células micropatterned en una membrana de PDMS

Se presenta en este artículo una plataforma novela de estiramiento que se puede utilizar para investigar las respuestas de células individuales a complejo deformación mecánica biaxial anisotrópico y cuantificar las propiedades mecánicas de los tejidos biológicos.

Una Plataforma Novela Estiramiento para Aplicaciones en Celular y Tisular Mecanobiología

Se desarrolló un novedoso protocolo de imagen utilizando un actuador mecánico accionado por motor personalizado para permitir la medición de las respuestas en tiempo real a la tensión mecánica en células vivas. Relevante para la mecanobiología, el sistema puede aplicar deformaciones de hasta el 20% al tiempo que permite obtener imágenes casi en tiempo real con microscopía confocal o de fuerza atómica.

Imágenes de células vivas durante el estiramiento mecánico

Este artículo presenta un enfoque simple para proporcionar cepas estática gradiente discontinua en un hidrogel celular cargado concéntrico regular alineación de celda para ingeniería de tejidos.

Gradiente de tensión Chip para estimulantes comportamientos celulares en hidrogel cargadas de celulares

Aquí presentamos un protocolo para la formación de una población celular mediante estímulos eléctricos y mecánicos, emulando la fisiología cardiaca. Esta estimulación electromecánica realza el potencial cardiomiogenético de las células tratadas y es una estrategia prometedora para la terapia celular más, modelado de la enfermedad y drogas.

Simultánea estimulación eléctrica y mecánica para mejorar el potencial de las células cardiomiogenético

Un sistema de biorreactor de estimulación mecánica uniaxial tridimensional es un biorreactor ideal para la diferenciación tenogénica específica de las células madre derivadas del tendón y la formación de neo tendones.

Aplicación de un sistema de biorreactor de estimulación mecánica uniaxial tridimensional para inducir la diferenciación tenogénica de células madre derivadas del tendón

Este artículo describe un procedimiento para producir iTenocitos mediante la generación de células estromales mesenquimales derivadas de iPSC con sobreexpresión combinada de Scleraxis utilizando un vector lentiviral y estiramiento uniaxial a través de un biorreactor 2D.

Generación de iTenocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas a través de la sobreexpresión combinada de escleraxis y la tensión uniaxial 2D

Aquí presentamos un dispositivo novedoso que aplica formas de onda de deformación isotrópicas y uniaxiales a las células, al tiempo que apoya el cultivo en sustratos con rigidez sintonizable y matrices proteicas personalizables. Esta plataforma sencilla y económica permite a los investigadores investigar cómo las señales mecánicas regulan la función celular tanto en estudios fundamentales como en contextos relevantes para enfermedades.

Una plataforma novedosa para el estiramiento e imagen celular in vitro

Este protocolo detalles de la derivación de células madre hematopoyéticas trasplantables a partir de células madre embrionarias de ratón (ESC) y su posterior inyección en ratones receptores irradiados letalmente. En pocas palabras, el CES se diferencian como cuerpos embrioides, que luego se infectan con HOXB4 retrovirales y co-cultivadas con células del estroma y OP9 citocinas hematopoyéticas.

Derivación de células madre hematopoyéticas de células madre embrionarias murinas

Aprende a estimular mecánicamente células madre mediante tensión uniaxial cíclica utilizando un biorreactor personalizado. Este protocolo permite investigar la biología mecánica celular con aplicaciones en ingeniería de tejidos.

La estimulación mecánica de células madre utilizando tensión uniaxial cíclica

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