La estimulación mecánica de células madre utilizando tensión uniaxial cíclica

Hola, soy Song Li. Soy profesor asociado en el Departamento de Bioingeniería en la UC, Berkeley. Y yo soy Kyle Kapinsky. Soy candidato a doctorado también en bioingeniería en la UC, Berkeley.

Hoy vamos a presentar un protocolo para la estimulación mecánica de células madre mediante deformación cíclica UNI axial. La investigación en nuestro laboratorio se centra en la ingeniería de células y tejidos, especialmente en el sistema cardiovascular. Estamos interesados en la biología mecánica de las células madre porque existen algunas aplicaciones potenciales.

Uno es que deseamos comprender el efecto de los factores mecánicos en el desarrollo, por ejemplo, en el desarrollo embrionario. Y dos, estamos interesados en controlar la diferenciación de células madre in vitro o en reacción intestinal. Y en tercer lugar, nos interesa saber cómo las células madre responden a los factores mecánicos cardiovasculares in vivo, por ejemplo, después del trasplante.

Para investigar todas estas cuestiones, contamos con un biorreactor de diseño personalizado en el cual podemos sembrar células sobre membranas elásticas y luego estirar estas membranas axialmente durante un período de tiempo definido, con una deformación y una velocidad de deformación también definidas. Ahora le guiaremos a través de todos los procesos que debe realizar para establecer este protocolo. Utilizando un jabón de laboratorio, cualquier detergente sirve, aplique jabón a ambos lados de la membrana y frótelos bien para eliminar cualquier partícula de suciedad presente en la membrana. Cualquier cosa que pudiera interferir con las células.

Y hago esto manualmente. Luego, una vez que considero que he limpiado bastante bien ambos lados, lo enjuago con agua una vez más. A partir de ahí, quiero asegurarme de que esté realmente estéril y de eliminar cualquier partícula microscópica.

Así que voy a tomar esta membrana y colocarla en un vaso de precipitados con alcohol al 70 %. Y simplemente deje que se sumerja completamente. A continuación, puede tomar todo el vaso de precipitados y colocarlo en un baño ultrasónico, dejándolo sonicar durante 10 minutos.

Ahora que tenemos la membrana con micropatrón en un recipiente cuadrado, queremos verificar para asegurarnos de que el lado con el patrón esté efectivamente orientado hacia nosotros. Así que voy a tomar un frasco con atomizador que contiene alcohol y rociaré ligeramente la cara superior de esta membrana. Ahora pueden ver cómo el líquido fluye hacia abajo y se observan esos surcos.

Entonces, eso verifica que el lado del patrón esté orientado hacia arriba y que esté en la orientación correcta. Ahora ya hemos realizado el paso de UV durante la noche y se pueden ver todas las cámaras, todos los marcos para las cámaras y las propias membranas dentro de la cabina, donde han permanecido durante toda la noche bajo irradiación de UV. Este es nuestro paso final de esterilización.

Ahora lo que quiero hacer es tratar con plasma todas las membranas; voy a sacar una o dos membranas a la vez, mantenerlas en sus placas estériles y transportarlas a la máquina de plasma. Ahora que la presión de vacío se ha liberado, puedo retirar la cámara. Y nuevamente, esto no es completamente estéril, pero la volveré a usar más tarde.

Así que trabaje relativamente rápido para que el plasma permanezca en su lugar; debe usar pinzas. Y nuevamente, esto es muy crítico: asegúrese de no dejar caer la membrana ni cambiar su orientación.

Entonces, en este momento, solo la superficie superior ha sido tratada con plasma y voy a colocarla nuevamente en mi placa relativamente estéril con la cara tratada con plasma hacia arriba, volver a colocar la tapa y luego transportarla a la cabina. Ahora que la membrana ha sido tratada con plasma, la voy a devolver a la cabina y tratarla con gelatina al 2% (peso por volumen).

Puede observarse que la solución sigue extendiéndose en línea con el patrón. Además, es muy hidrofílica, ya que ha sido tratada con plasma. Por lo tanto, la solución se extiende en lugar de acumularse; si accidentalmente invirtiera la membrana, la solución se acumularía inmediatamente y sabría que está trabajando sobre el lado incorrecto.

Por lo tanto, asegúrese de que la solución se extienda uniformemente. Luego, una vez que haya hecho esto con todas sus membranas, simplemente cierre la campana y encienda la luz UV durante 30 minutos. En este punto, la membrana ha estado bajo luz UV con gelatina sobre la superficie durante media hora, y ese tiempo es suficiente para que la gelatina se absorba completamente en la superficie.

En este momento, quiero lavar la membrana dos veces con PBS estéril y normalmente coloco alrededor de 10 ml en un recipiente cuadrado, lavando suavemente con la mano de esta manera, tratando de evitar tocar la superficie de la membrana, y luego aspirar el PBS. Voy a repetir esto una vez más, y después de la segunda vez dejaré la membrana en PBS, lo cual ayuda a lubricarla y facilita su ensamblaje en la cámara. Si se deja la membrana seca, aumenta la probabilidad de que se rompa o se dañe de alguna manera.

Entonces, este es el segundo lavado. Nuevamente, aspire una vez para asegurarse de que toda la gelatina haya sido eliminada de la membrana. Luego, deje la membrana en aproximadamente 10 mililitros de PBS estéril.

Y si está trabajando con más de una membrana, repita este proceso para cada una. Después de eso, estará listo para el ensamblaje. Tome uno de los marcos, que en realidad consta de dos piezas, pero que por lo general vienen preensambladas.

Entonces, una pieza es la pieza en T aquí, y la otra pieza es parte del marco, que va a sostener la membrana misma. Así que hay una segunda pieza del marco que tiene este aspecto. Y se puede ver que tiene esta ranura en ella.

Es ahí donde se insertará la junta para mantener la membrana en su lugar. La segunda pieza tiene una segunda ranura para otra junta, de modo que sujetará ambos lados de la membrana. Tomando esta pieza, colóquela sobre el marco de esta manera, déle la vuelta al marco y tome uno de los tornillos para autoclave.

Inserte el tornillo en la parte superior; puede apretarlo un poco a mano primero y luego use una de las llaves hexagonales para apretarlo completamente. En este punto, tengo un marco ensamblado y la membrana irá en la cara inferior de este modo, como si mi mano fuera la membrana. Y eso significa que quiero el lado que está grabado o tratado con plasma y con gelatina.

Quiero que quede mirando hacia arriba de esta manera. Así que si por accidente lo giro y el lado con gelatina queda ahora hacia abajo, eso será un problema grave para el experimento. Por lo tanto, cuando lo arme, quiero que el lado con el patrón quede mirando hacia arriba de este modo, pero voy a armarlo boca abajo.

Así que cuando retire la membrana, asegúrese de que el lado del patrón quede hacia abajo. Tomando una membrana, y recuerde que en este momento el lado del patrón está hacia arriba. La saco del PBS y la coloco sobre el marco así.

Así que ambos lados están prácticamente iguales en este momento. Está permitido tocar los bordes de la membrana con los dedos, pero intente no tocar el lado opuesto. Ahora que la he girado de este modo, el lado con el patrón queda mirando hacia abajo, lo cual es lo que deseo para facilitar el montaje; tome dos juntas y colóquelas en el PBS.

Suelo moverla hacia adelante y hacia atrás. Mojé completamente la junta, lo que lubrica la junta de la misma manera que lubricé la membrana en PBS. Si utiliza juntas secas con una membrana seca, es mucho más probable que algo se enrolle.

Entonces, la forma en que comienzo esto es tirando un lado un poco más lejos que el otro lado, porque cuando inserte la junta, si inserto la junta en este lado, va a tirar la membrana en esta dirección, y luego este lado se vuelve un poco más corto. Así que comience con un extremo algo acortado aquí. Tome una junta, colóquela cruzada de modo que quede bastante pareja en ambos lados.

Y aplicando presión uniforme, presione hacia abajo, use sus pulgares o las puntas de sus pulgares, pero no sus uñas en este momento, ya que es más probable que corte accidentalmente la membrana y la rompa. Entonces, una vez que la he insertado, tomo realmente la parte posterior de la pinza y la uso para presionar hacia abajo. Y nuevamente, tenga cuidado de no presionar demasiado fuerte ni resbalar y tocar la membrana, porque podría cortarla o romperla accidentalmente en este punto, y tendría que obtener una membrana nueva y comenzar de nuevo.

Así que ahora un lado ya está insertado, pero el otro lado aún está suelto. Entonces, déjelo al revés, tome la otra junta, asegúrese de que esté mojada y colóquela encima tal como antes. Luego, normalmente uso la pinza para agarrar realmente esa membrana y estirarla un poco, porque si está demasiado suelta, habrá mucha holgura en la membrana y será imposible ver las células.

Así que desea que esté tenso, pero no excesivamente estirado de forma que quede alargado. Si está previamente estirado, afectará al experimento porque la membrana ya estará tensa y podría romperla; agregará un poco de tensión al presionar la junta hacia abajo. En este momento se ve bastante tensa.

Quizás esté un poco flojo en un lado, pero lo arreglaré en un momento. Y nuevamente, aplicando una presión bastante uniforme, simplemente presione con las puntas de los pulgares o las yemas de los dedos. Y en este punto puede ver que un lado está bastante tenso.

Es recto desde un extremo hasta el otro lado. Hay un poco de holgura en la membrana justo allí, y se enrolla ligeramente. Entonces, lo que voy a hacer es presionar este lado completamente hacia adentro, tal como antes, hacerlo lentamente y de manera uniforme a lo largo de toda la junta.

Y puede observarse que esto eliminó la mayor parte de la holgura. Acabamos de finalizar la exposición de 30 minutos a UV de los lados traseros de los marcos y las membranas, y ahora queremos dar la vuelta a todas las membranas para que puedan irradiarse con UV por el lado frontal, de modo que todo quede completamente estéril. En este momento, también vamos a designar ciertas cámaras como de estiramiento o de control.

Como puede ver, en realidad ya he etiquetado mis cámaras: control de estiramiento, control de estiramiento. Y las cámaras de estiramiento requieren un tornillo adicional. Por eso he colocado el tornillo extra para la cámara de estiramiento encima de la parte inferior de la tapa aquí.

Así que tome simplemente el marco y voltéelo. Y si es una cámara de estiramiento, significa que necesito cambiar algunos de los tornillos. Si es una cámara de control, todo permanece igual.

Y cuando esta barra se mueve hacia adelante y hacia atrás, la membrana en sí no se estira, solo se desplaza junto con la barra. Si quiero que la membrana se estire, necesito fijar la segunda parte del marco en este extremo al fondo de la cámara para que permanezca estacionaria. Luego, cuando la barra se mueva únicamente en esta parte del marco, esta se moverá hacia adelante y hacia atrás.

Para hacerlo, tome el tornillo adicional y colóquelo en el orificio para tornillo de esta pieza del marco. Utilice la llave hexagonal y apriete el tornillo. No apriete en exceso porque estas cámaras de polisulfona son un poco frágiles, así que no querrá agrietar una cámara; apriete lo suficiente para que esa pieza del marco no se mueva.

Luego, una vez que tenga el primer tornillo puesto, puede desatornillar este tornillo, que mantenía unidas las dos piezas del marco, y tenga cuidado de no dejar caer el tornillo sobre la membrana, ya que podría dañar parte de la gelatina que sembró allí. Entonces, una vez que lo tenga bastante suelto, saque la llave Allen, tome el tornillo con las pinzas y colóquelo en el segundo orificio para el tornillo. A continuación, use nuevamente la llave Allen y apriete el segundo tornillo.

Entonces, una vez que esa pieza del marco está asegurada con los dos tornillos, ahora tengo una cámara preparada para estiramiento. De modo que cuando esta barra se mueve hacia adelante y hacia atrás mediante la máquina de estiramiento, se puede observar que la membrana misma se estira realmente. Y me gusta hacer esto varias veces para asegurarme de que no haya ningún problema con mi membrana.

Si por alguna razón hay una grieta y luego la membrana se rompe, ahora lo sabré antes de que comience el experimento y podré colocar una membrana diferente. Así que mueve esto hacia un costado, toma la siguiente y, en este caso, está etiquetada como una cámara de control. Por lo tanto, todo lo que debo hacer con la cámara de control es darle la vuelta.

Ahora, cuando se coloca en la máquina, se moverá de un lado a otro sin estirarse. Luego, repita el proceso para todas las cámaras y membranas que tenga. Cada una ya sea control de estiramiento, cierre luego la campana e irradie con luz UV las caras superiores de las membranas durante 30 minutos.

Así que acabamos de exponer a UV todas las cámaras y las caras superiores de los marcos en las membranas durante 30 minutos. Ahora todo está esterilizado y ensamblado, y estamos listos para sembrar las células. En este caso, estoy sembrando células madre mesenquimales y las estoy tomando de placas de 10 centímetros.

Entonces, para cada membrana, especialmente si estoy utilizando una membrana con patrón como en este caso, se puede sembrar aproximadamente en la zona cuadrada donde se encuentra el patrón. Deseo sembrar solo en esa área con patrón. Si se utiliza una membrana sin patrón, aún así se debe sembrar en una zona aproximadamente igual, para evitar que el líquido quede demasiado cerca de los bordes.

Si el líquido está demasiado cerca de los bordes, puede derramarse y entonces sus células morirán antes de que realmente logre sembrarlas. Y en el área donde está sembrando, desea colocar la cantidad adecuada de células. Por lo tanto, cuando realizo el experimento, quiero que esa área esté bastante confluyente.

Entonces, si uso una placa de 10 centímetros, quiero aproximadamente un tercio de una placa confluente en esa área. Y en este caso, para células madre mesénquimas, eso equivale a unas 250.000 células. Esto variará dependiendo del tipo de célula que utilice.

Así que ya he separado mis células de la placa y las he resuspendido en la cantidad adecuada de volumen. Y quiero colocar un mililitro de solución celular sobre cada membrana. En este caso, tengo aproximadamente 250.000 células madre mesenquimales por mililitro de solución.

Así que uso un P 1000, asegurándome de que la solución esté bien mezclada. Entonces aspiro y expulso varias veces y tomo un mililitro en la pipeta, y quiero asegurarme de sembrar solo en esa zona. Por lo tanto, siembro muy lentamente y utilizo pequeñas gotas sobre esa área patroneada.

Y en realidad puede observarse que, debido a que esto es un patrón, se forman pequeñas elipses en esta dirección, ya que en realidad están detectando esos surcos. Por lo tanto, no son círculos completos. En este caso, tienen una forma más bien ovalada.

Luego observo alrededor de esta zona, pero sin acercarme demasiado a los bordes todavía. No quiero avanzar demasiado y quedarme sin solución en mi pipeta. A continuación, uso la pipeta para distribuir la solución cerca de los bordes, tratando de no sobrepasarlos.

No quiero ninguna célula en el área no pasada, y es un poco difícil alcanzar el borde que está más cerca de usted. Por lo tanto, normalmente giro cuidadosamente esto alrededor y alcanzo ese último borde. Y esto debería distribuir las células de manera bastante uniforme.

Ahora todos están sentados. Pero debes tener cuidado de no derramar ninguna de las células. Así que ten cuidado de no pasar tu mano por encima y tampoco moverla demasiado rápido.

Luego lo aparto nuevamente. Quiero cubrirlo y simplemente levantar las células sembradas en la parte superior. Para cubrirlo, se utiliza esta tapa, que en realidad tiene dos orificios diferentes.

Hay un orificio más profundo en este lado y uno más superficial en este lado que permite la entrada de gases. Debe asegurarse de que el orificio más profundo quede alineado con esta parte en T aquí. De lo contrario, quedará demasiado apretado si usa el orificio más superficial.

Así, al colocarlo de esta manera, se cubrirá toda la cámara. Luego, debe repetir el proceso con todas las cámaras restantes y dejarlo en la cabina de flujo laminar durante 30 minutos para que las células se asienten en el fondo y comiencen a adherirse a las membranas. Después de eso, vamos a sujetar todas las cámaras con cinta y transferirlas a la cabina de flujo laminar o al incubador para que permanezcan durante otra hora y se adhieran completamente a las membranas.

Vale, acabamos de terminar de dejar las células sobre las membranas durante media hora. Ahora quiero exponer las células a 37 grados y 5 %CO₂, que es lo que hay dentro del incubador. Por lo tanto, necesito transferirlas de la cabina al incubador.

Y para hacer esto, solo debe asegurarse de ser extremadamente cuidadoso y no inclinar las cámaras en ninguna dirección, ya que de lo contrario la solución celular podría deslizarse. Básicamente, tendría que comenzar de nuevo. Ahora que las células han estado en la cámara dentro del incubador durante una hora, las células están firmemente adheridas a la superficie.

En este momento, he sacado nuevamente la cámara del incubador y la he colocado cuidadosamente de vuelta en la campana, transportándola con mucha precaución, tal como antes. Así evitará derramar cualquier medio sobre la membrana en este punto. Es necesario añadir 20 mL de medio a la cámara de estiramiento.

Y en este caso, utilizo una combinación especial de medio porque es ligeramente propenso a la contaminación; está perfectamente diseñado para evitar la contaminación. Estoy utilizando DM más 10 % de FBS más 1 % de penicilina, estreptomicina, y luego un 1 % adicional de fungizona solo para evitar hongos. Tomando 20 ml de medio, voy a agregarlos cuidadosamente a la cámara de estiramiento.

Podemos observar que el medio no se ha salido de la membrana en sí y se ha agregado al extremo de la cámara aquí, de modo que el medio pase primero por debajo de la membrana y luego por encima de ella. Hágalo lentamente para no perturbar completamente las células. Luego, cúbrala nuevamente y puede colocar firmemente esa tapa en su lugar.

Y en este punto ya no tiene que preocuparse por alterar las células ni por permitir que se desprendan de la membrana. Por lo tanto, puede manipularla con un poco menos de cuidado. Debe elegir la cantidad adecuada de tensión.

Y el funcionamiento de esta máquina consiste en una rueda giratoria a la que va unida una palanca, y esta palanca puede variar su longitud según el inserto de la pieza prefabricada que se coloque en el centro de la rueda. De modo que, cuando gira, la palanca se mueve hacia adelante y hacia atrás, lo que a su vez desplaza esta plataforma de forma alternativa. Y las cámaras están conectadas a ella.

Por lo tanto, ellos a su vez también se mueven de un lado a otro. Entonces, si deseo aplicar una deformación del 5 %, tengo una pieza prefabricada que indica un cinco, y está diseñada con una longitud específica precalculada para hacer que el brazo alcance la posición correcta. Así que inserto esa pieza en el centro de la rueda, luego fijo el brazo, me aseguro de que esté firmemente colocado y lo aprieto utilizando la llave hexagonal para obtener el cierre final.

Entonces, una vez que todo esté colocado, se encuentra en la posición cero y todo está fijado. Ahora estamos listos para colocar las cámaras. Estas son las cámaras que acabo de transportar.

Tienen las células en la parte superior, colóquenlas cuidadosamente en una posición única y asegúrense de que la barra encaje en su lugar. Deben asegurarse de que se empuje en esta dirección para que quede bloqueada en su posición cero. No la empujen completamente hacia atrás, o podrían pre-estirar la membrana.

Luego, fíjelo en su lugar con este sujetador aquí para que no se mueva. A continuación, accione el interruptor para ponerlo en marcha. Puede observarse un pequeño salto al principio.

A veces eso sucede, se atasca, pero luego generalmente comienza a avanzar bastante fluidamente. Y ahora todas las barras se mueven de un lado a otro a 60 ciclos por segundo. Entonces, aquí abajo indica 600.

En realidad, debería ser 60,0. Y puede cambiar la frecuencia si así lo desea. Entonces, una vez que las células hayan sido sometidas a estrés mecánico en su sistema, normalmente lo hacemos durante aproximadamente dos a cinco días, pero puede hacerlo por un período más corto o más largo si lo desea.

Una vez que haya terminado y tenga algún tipo de punto final definido, puede retirar las cámaras y luego utilizar las células de esas membranas para investigar diferentes aspectos. Por lo tanto, lo que normalmente hacemos es una variedad de técnicas, incluyendo electroforesis en gel 2D y microarreglos. También buscamos la expresión génica mediante PCR o la expresión proteica mediante inmunotransferencia (western blotting).

Además de simplemente lisisar las células, también puedes teñirlas directamente sobre la membrana buscando, por ejemplo, inmunofluorescencia de proteínas específicas, o incluso puedes liberar las células de la membrana, teñirlas y pasarlas a través de un equipo de citometría. Por lo tanto, existen muchas cosas diferentes que puedes hacer, muchas cosas distintas que puedes analizar. Y por supuesto, también hay diferentes variaciones del equipo si deseas utilizar tipos distintos de membranas con microdiseños o simplemente materiales diferentes, recubrimientos distintos, todo tipo de modificaciones que puedes realizar en este sistema.