Dispositivo de microfluidos para volver a crear un microambiente tumoral In Vitro

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la fabricación y operación de un dispositivo microfluídico que recrea microambientes tumorales in vitro y que puede utilizarse para probar fármacos quimioterapéuticos. Este es el dispositivo microfluídico. Este dispositivo puede ser útil en las siguientes áreas: pruebas sencillas de fármacos quimioterapéuticos in vitro.

Proporciona resultados consistentes y precisos para la prueba de tejido tumoral tridimensional, y este dispositivo ofrece una representación muy precisa del tumor in vivo. Los tumores existen en microentornos tridimensionales, y la capacidad de realizar pruebas en uno de estos entornos es significativa. El primer paso del procedimiento consiste en ensamblar el dispositivo, lo cual implica la fabricación de un chip microfluídico mediante litografía suave, la perforación de orificios en las entradas y salidas, la unión a una lámina de vidrio y la conexión de tubos para la entrada y salida del flujo.

A continuación, se generan esteroides tumorales multicelulares uniformes para su uso en el dispositivo mediante el método de gota colgante. Luego, los esferoides se introducen en el dispositivo, seguidos de agentes de detección de apoptosis y fármacos quimioterapéuticos. Finalmente, se realiza microscopía de lapso de tiempo, seguida de la estimación matemática de los coeficientes de difusividad del fármaco para cuantificar la capacidad de penetración del agente quimioterapéutico.

Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran el crecimiento del tejido en la formación del dispositivo, la creación de microentornos heterogéneos dentro del tejido y la difusión del fármaco hacia el tejido mediante microscopía de fluorescencia con intervalos de tiempo. La penetración limitada de fármacos contra el cáncer en tumores sólidos es una causa importante de su fracaso. La mayoría de los modelos actuales de prueba de fármacos contra el cáncer no imitan la naturaleza tridimensional de los tumores sólidos.

Hemos desarrollado un dispositivo microfluídico compuesto por tejidos tumorales tridimensionales con perfusión continua. Este modelo representa con mayor precisión la administración de fármacos a tumores sólidos y su eliminación sistémica. Los esteroides tumorales multicelulares son un modelo bien establecido de tejidos tumorales tridimensionales.

En este procedimiento, se utiliza el método de la gota colgante para crear esteroides destinados al uso en el dispositivo microfluídico. Este método permite la formación de esteroides uniformes en un corto período de tiempo. La prueba de fármacos quimioterapéuticos in vitro en tejidos tridimensionales puede ayudar a seleccionar fármacos de manera más eficiente en comparación con monocapas de células.

Mezcle el PDMS y el agente de curado del elastómero de silicona en una proporción de nueve a uno en peso. Luego, vierta esta mezcla sobre el molde maestro para formar una capa de PDMS de cuatro milímetros de espesor. Para eliminar las burbujas de aire, cure a 60 grados Celsius durante cinco horas.

Despegue el PDMS curado del molde para obtener un sello con las características de flujo en el elastómero. Luego, utilizando un punzón de biopsia de un milímetro y medio montado en un taladro, presione para hacer orificios para las entradas y salidas. Retire cualquier residuo.

Sometan el lado de la característica del sello y una portaobjetos de vidrio limpio a plasma de oxígeno durante ocho minutos. En un grabador de plasma de oxígeno, pongan en contacto inmediato las superficies tratadas para formar un enlace entre ellas. Mantengan el ensamblaje a 60 grados Celsius sobre un calentador de portaobjetos durante al menos cinco horas.

Para reforzar la unión, conecte un tubo de PTFE con un diámetro interno de 0.032 pulgadas a las entradas y salidas del dispositivo microfluídico. Utilizando una interfaz de conectores macho de bloqueo tipo bayoneta unidos a conectores hembra de bloqueo tipo bayoneta con extremos ahusados, estos conectores específicos permiten que el tubo pase fácilmente sin romperse. Finalmente, arme el sistema de flujo utilizando válvulas de cierre y un conector en Y, y monte el dispositivo sobre el microscopio. Después de montar el dispositivo, conecte los tubos a las entradas y salidas correspondientes para completar la configuración del flujo.

Como se muestra en esta figura, esta configuración permite la facilidad y versatilidad de empaquetar un esferoide en el dispositivo o crear un flujo de medio a través del dispositivo para el empaquetado. Abra la válvula de entrada de empaquetado VPN y la válvula de salida de empaquetado VP para liberar el tumor. A continuación, el OID puede pasar a través de la entrada y fluir hacia la cámara de cultivo, donde el poste en esta cámara mantendrá al tumor en su lugar para permitir el flujo del medio.

Cierre las válvulas de empaque y abra la válvula de entrada de flujo VF in y la válvula de salida de flujo VF out para iniciar la formación de PHE uniforme. Utilizando el método de la gota colgante, retire las células con tripsina bajo una campana de cultivo. Tome las células con tripsina resultantes del centrífugo.

Diluya la solución stock a una concentración deseada consultando la tabla uno. A continuación, retire la tapa de una placa de 48 pocillos y colóquela boca abajo. En un flujo laminar esterilizado, agregue un mililitro de agua esterilizada a cada pocillo de la placa.

Para mantener la humedad, coloque una gota de 20 microlitros de solución diluida de células en cada región circular de la cubierta. Utilizando una micropipeta, invierta cuidadosamente la cubierta y colóquela sobre la placa, asegurándose de que las gotas no toquen los bordes de los pocillos. Incube la placa a 37 grados Celsius.

Consulte la tabla uno para conocer la duración de la incubación según el tipo de célula utilizado; un esteroide se formará en cada gota colgante. Comience por esterilizar el dispositivo lavándolo con etanol al 70 % a través de la entrada de flujo. A continuación, realice un lavado con PBS y luego con medio de cultivo celular tamponado con H-E-P-E-S.

Deje la jeringa mediana, conéctela al tubo. A continuación, aspire dos o tres esteroides en el punto de acceso de la jeringa. Para eliminar las burbujas de aire, conecte la jeringa a la entrada de embalaje del dispositivo.

Abra la válvula de entrada VPN y cierre VFN, abra la válvula de salida VP out y cierre VF out. Mantenga la jeringa de empaque en posición vertical con la aguja apuntando hacia abajo. Observe cómo el esteroide se sedimenta en el fondo de la jeringa, hacia el conector de bloqueo de cebo de la aguja.

Presione el émbolo de la jeringa de empaque y observe cómo el PHE entra en el tubo y fluye hacia el dispositivo, ya que solo la válvula de salida de empaque está abierta. Un esteroide entrará en la cámara del dispositivo y será retenido por los postes en la parte trasera. Una vez dentro de la cámara, el esferoide S se adapta a la forma de la cámara y adquiere una geometría rectangular.

Cierre la válvula de entrada VPN y la válvula de salida VP, y coloque la jeringa de flujo SF en la bomba de jeringa. Esta bomba es controlada por una computadora mediante Syringe Pump Pro; abra la válvula de entrada VFN y la válvula de salida VF. Inicie el flujo de medio hacia el dispositivo a tres microlitros por minuto.

La incubación de los esferoides durante 24 horas va seguida por la introducción de agentes detectores de apoptosis. Antes de introducir agentes detectores de apoptosis o agentes terapéuticos, permita que los esferoides alcancen el equilibrio durante hasta 24 horas para establecer gradientes de nutrientes y microentornos. Luego cierre la válvula VFN.

Detenga la bomba de jeringa. Retire la jeringa de la bomba y sustitúyala por la jeringa que contiene medio con 0,25 microlitros por mililitro de marcador activo de Caspasa tres CASP glow red. Lave el dispositivo con la solución, pasando manualmente 0,7 mililitros de ella a través del dispositivo.

Luego monte la jeringa en la bomba. Reinicie el flujo y abra la válvula VFN. Durante un período de cinco a ocho horas, la fase activa de cph roja del guante Cask se difundirá en el tejido y fluorescerá más intensamente en las regiones apoptóticas. El agente de detección de apoptosis se mantiene a esta concentración en todas las soluciones de flujo posteriores.

Se introduce doxorrubicina entre cinco y ocho horas después de la introducción de los agentes de detección de apoptosis. Este tratamiento se elimina del sistema mediante lavado. Para añadir agentes quimioterapéuticos, siga el procedimiento para la detección de apoptosis a fin de introducir doxorrubicina clorhidrato a 10 micromolares.

Luego, sustituya la jeringa de tratamiento por la jeringa con 0,7 mililitros de medio. Continúe el flujo del agente terapéutico durante un período de tiempo fijo. A continuación, cierre la válvula VFN y apague la bomba de jeringa.

Retire la jeringa de tratamiento de la bomba de jeringa y sustitúyala por la jeringa con 0,7 mililitros de medio. Permita el flujo de medio fresco durante 24 a 36 horas mientras monitorea continuamente el tejido bajo un microscopio. Todo el proceso de adquisición para la microscopía de lapso de tiempo se automatizó utilizando un script personalizado en IP Lab, adquiriendo imágenes de luz transmitida y de fluorescencia del PAX Foid a 10x de magnificación cada 30 minutos. Para la estimación matemática de los coeficientes de difusividad del fármaco, el primer paso consiste en generar perfiles de intensidad lineal promedio de la fluorescencia de Docs utilizando ImageJ. Seleccione una región rectangular de interés, o ROI, que abarque el tejido en la cámara.

Utilice el comando perfil de trazado para generar un perfil de intensidades promedio en función de la distancia desde el canal de flujo. Repita este procedimiento para hasta tres puntos de tiempo diferentes. A continuación, reste la intensidad promedio de fluorescencia de fondo de los perfiles de intensidad obtenidos y normalice cada perfil utilizando la intensidad máxima correspondiente para obtener C como función de X y T. Donde C es la concentración normalizada de doxorrubicina, el valor de C varía entre cero y uno.

El siguiente paso consiste en evaluar el coeficiente de difusión efectivo de docs en el tejido tumoral docs. La difusión puede representarse mediante la siguiente ecuación, donde ERFC es la función de error complementaria. X es la distancia dentro del tejido desde el canal, y T es el tiempo transcurrido tras la introducción de doxorubicina.

Utilice el siguiente esquema iterativo en cada punto temporal considerado. Adivine un valor para D. Calcule el lado derecho de la ecuación en cada ubicación. X. Calcule la suma de los errores al cuadrado entre ambos lados, y modifique D para minimizar el promedio del residuo.

Los valores óptimos de D obtenidos en cada punto temporal para estimar el coeficiente de difusión efectivo promedio de doxorrubicina en el tejido. Los dispositivos microfluídicos proporcionaron cámaras de cultivo ópticamente accesibles de un milímetro por 0,3 milímetros por 0,15 milímetros para el crecimiento de tejido tumoral tridimensional. El método de la gota colgante permitió la rápida formación de PEH tumorales de tamaño y forma consistentes a partir de varias líneas celulares.

Las EHP se cultivaron con éxito en el dispositivo durante hasta tres días. El crecimiento en las cámaras estuvo asociado con la modificación reproducible de microentornos. Dentro de las EHP, la apoptosis ocurrió menos en las células cercanas al canal de flujo y fue mayor y más profunda en el tejido.

El dispositivo se utilizó para estimar el coeficiente de difusión de la doxorubicina y el tejido tumoral. El valor obtenido experimentalmente coincidió con el valor reportado previamente en cáncer de mama humano. Al realizar este procedimiento, es fundamental tener una extrema precaución en mantener la esterilidad al hacer fluir el PHE hacia el dispositivo, ya que debe realizarse fuera del cultivo celular.

Rocíe generosamente con etanol las jeringas del capuchón y los extremos de los tubos para garantizar la esterilidad. Después de ver este video, debería comprender el papel de la penetración limitada de los fármacos en los tumores. Hemos demostrado una técnica para imitar la administración y la eliminación sistémica de fármacos en tejidos tumorales tridimensionales y cuantificar su penetración.

La eliminación de fármacos con baja penetración simplificará significativamente el proceso de desarrollo de fármacos contra el cáncer.