Name: Dispositivo de microfluidos para volver a crear un microambiente tumoral In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 18 s
Description: Aprende a fabricar un dispositivo microfluídico para recrear microambientes tumorales in vitro y evaluar la difusión de fármacos quimioterapéuticos como doxorrubicina. Este método mejora el cribado de medicamentos contra el cáncer.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud de subvención # 1R01CA120825-01A1, la investigación en colaboración Biomédica (CBR) Programa de la Universidad de Massachusetts Amherst, y la Beca J. Isenberg para Bhushan Toley. Agradecemos la valiosa contribución de James Schafer, el camarógrafo, narrador y editor de este video.

1. Fabricación de los dispositivos La réplica de características de microfluidos en materiales elastoméricos se basó en el método descrito por Duffy et al. 1 <ol><li> Elastómero Mix (polidimetilsiloxano; PDMS) y agente de curado del Kit de elastómero de silicona (Dow Corning, Midland, MI) en una proporción en peso 9:1 y se vierte sobre el maestro para formar una capa de 4 mm de espesor. Degas para eliminar burbujas de aire y curar la mezcla a 60 ° C durante 5 horas. Pelar PDMS curado del molde para obtener un sello de características de flujo en el elastómero. </li><li> Haga agujeros para las entradas y salidas de 1,5 mm usando un punzón de biopsia (Miltex, York, PA) montado en una prensa de taladro. Sacar los residuos. </li><li> Se somete el lado de características del sello y de un portaobjetos de vidrio limpio para plasma de oxígeno durante 8 minutos en un grabador de plasma de oxígeno. Traiga las superficies tratadas en contacto inmediatamente para formar un enlace entre ellos. Mantener el conjunto a 60 º C en un portaobjetos caliente durante al menos 5 horass para fortalecer el vínculo. </li><li> Conectar 0,032 "ID tubos de PTFE (Cole Parmer, Vernon Hills, IL) a las entradas y salidas mediante una interfaz de cierre luer macho conectores conectados al púas conectores luer hembra de bloqueo (Qosina, Edgewood, NY). </li><li> Instale el ensamblaje de flujo utilizando válvulas de cierre y un conector (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA; Figura 1). Montar el dispositivo en el microscopio. Coloque jeringas para mangueras mediante 20G 1,5 "agujas (BD Bioscience, Rockville, MD). </li></ol> 2. Formación de esferoides uniformes Esferoides fueron formados por el método de la gota colgante 2,3. <ol><li> Tripsinizar las células bajo una campana de cultivo celular estéril. </li><li> Centrifugar las células tratadas con tripsina a 2000 rpm durante 5 minutos y se resuspenden en medio fresco ml 6. Diluir la solución madre a una concentración final deseada (Tabla 1). </li><li> Retire la tapa de una placa de 48 pocillos y colocarlo boca abajo en el sterilized capucha. Regiones circulares correspondientes a cada pocillo son evidentes en la cubierta. Llenar cada pocillo de la placa con 1 ml de agua esterilizada para mantener la humedad. Poner una gota de 20 ml de la solución diluida de células en cada región circular con una micropipeta. Invierta cuidadosamente la tapa y colóquela sobre la placa bien, asegurando que las gotas no toque los bordes de los pozos. </li><li> Incubar la placa de pocillos a 37 º C durante un número especificado de días (Tabla 1). Un esferoide se formará en cada gota colgante. </li></ol> 3. Introducción de esferoides en el dispositivo Consulte la Figura 1 y la Tabla 2 de esta sección. <ol><li> Esterilizar el dispositivo por el lavado con 70% de etanol introducido a través de la entrada de flujo. Posteriormente, lavar con PBS seguido de tampón HEPES medio de cultivo celular. Deja F la jeringa medio S conectado a la tubería. </li><li> Empate 2-3 esferoides en P S jeringa, presione la jeringa para eliminar las burbujas de aire, yadjuntar a la entrada de embalaje del dispositivo. </li><li> Abra la válvula de entrada V Pin y cerca Fin V. Abra la válvula de salida Pout V y cerca Fout V. Mantenga la jeringa envasado vertical con la aguja apuntando hacia abajo; ver como esferoides depositan en el fondo de la jeringa en el conector de cierre luer de la aguja. Empujar el émbolo de la jeringa de embalaje y esferoides reloj entrar en el tubo y el flujo en el dispositivo. Debido a que sólo la válvula de salida del embalaje es abierto, un esferoide entrará en la cámara del dispositivo y ser retenido por los puestos en la parte de atrás (Fig. 2). </li><li> Cerrar la válvula de entrada y de salida V Pin Pout válvula V. Montar la jeringa F S en una bomba de jeringa. Abra la válvula y la válvula de aleta V V Fout. Flujo del medio en el dispositivo en 3 l / min. </li></ol> 4. Introducción de Agente de Detección de Apoptosis (CaspGLOW) Después de la colocación de cámaras de esferoides, para permitir el equilibrio up a 24 horas para establecer gradientes de nutrientes y los microambientes, antes de la introducción de la apoptosis o la detección de agentes terapéuticos. Debido a que los tejidos en las cámaras están en contacto con las paredes impenetrables de arriba y abajo, no hay gradientes de nutrientes a lo largo del espesor (0,15 mm) del tejido. Después de 24 horas de incubación, todas las capas de células a lo largo del espesor del tejido son por lo tanto equivalentes y la heterogeneidad es sólo en una dirección lejos del canal de flujo. <ol><li> Apague V Fin, parar la bomba de jeringa, retire la jeringa F S de la bomba y reemplazarlo con una jeringa que tiene un medio que contenía 0,25 l / ml de CaspGLOW Red activa la caspasa-3 marcador (Red-DEVD-FMK; Biovision, Mountain View, CA). </li><li> Enjuagar manualmente 0,7 ml de esta solución a través del dispositivo para asegurar el desplazamiento de más medio. Montar la jeringa en la bomba, a restablecer el flujo, y Fin de V abierta. Durante un período de 5-8 horas, la apoptosis detectar difunde agente en tél tejido y emite fluorescencia más brillante en regiones apoptóticas. Agente apoptosis detectar en esta concentración se mantiene en todas las soluciones de flujo subsiguiente en el dispositivo. </li></ol> Nota: <ol class="lroman"><li> Heterogeneidad del tejido puede ser confirmado mediante la obtención de perfiles lineales de intensidad de fluorescencia como se describe en la Sección 6. Los perfiles deben mostrar gradientes espaciales de la apoptosis, lo que confirma que el tejido es heterogénea con respecto a la viabilidad celular. </li><li> CaspGLOW verde activa la caspasa-3 marcador (Fluoresceína-DEVD-FMK; Biovision) también se puede utilizar para detectar la apoptosis. Este marcador contiene el fluoróforo fluoresceína verde en lugar de la rodamina fluorocromo rojo. </li></ol> 5. Introducción de agente terapéutico <ol><li> Siga el procedimiento de los pasos 4.1-4.2 para introducir 10 mM clorhidrato de doxorrubicina (DOX, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), que contiene el reactivo apoptosis. </li><li> Continuar flujo de la therapesolución de agente UTIC por un período fijo de tiempo. Cierre la válvula de aleta V y apague la bomba de jeringa. Reemplazar la jeringa tratamiento con una jeringa medio fresco que contiene el reactivo apoptosis. Permitir el flujo de medio fresco durante 24 -36 horas, mientras que supervisar continuamente el tejido bajo un microscopio. </li></ol> 6. Time-lapse microscopía y estimación de los coeficientes de difusividad de drogas Para la obtención de los datos de fluorescencia más limpias, adquirir todas las imágenes del microscopio, centrándose en las capas inferiores de los tejidos. Debido a que no hay gradientes de nutrientes en la dirección vertical (véase la Sección 4), las capas inferiores de células son buenos representantes de todas las demás capas anteriores. <ol><li> El proceso de adquisición fue automatizado mediante un script personalizado en IPLab (BD Bioscience, Rockville, MD). Adquirir imágenes de transmisión de luz y la fluorescencia de la esferoide embalado con un aumento de 10 veces cada 30 minutos (Fig. 3A). Acquire una imagen de la fluorescencia de fondo antes de la introducción de Dox. Para acomodar el gran tamaño de la cámara (1000 micras x 300 micras), adquieren dos imágenes contiguas y azulejos y baldosas juntos 4. </li><li> Para la estimación matemática de coeficientes de difusividad de drogas, el primer paso es para generar perfiles de intensidad promediados lineales de Dox fluorescencia usando ImageJ. Seleccione una región rectangular de interés (ROI) que abarca el tejido en la cámara. Utilice el comando Perfil Parcela para generar un perfil de intensidades promedio como una función de la distancia desde el canal de flujo. Repita el procedimiento para hasta 3 puntos de tiempo diferentes. </li><li> Obtener una imagen de fondo de fluorescencia antes de la introducción de Dox para medir la autofluorescencia del tejido. Restar la intensidad media de fluorescencia de fondo de los perfiles de intensidad obtenidos y normalizar cada perfil por la intensidad máxima correspondiente para obtener <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq0.jpg" alt="c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="c"> (X, t) (Fig. 3B). </li><li> El siguiente paso es evaluar la eficacia coeficiente de difusión D de Dox dentro del tejido tumoral. Dox difusión puede ser representado por la siguiente ecuación 5 <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq1.jpg" alt="Ecuación 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Ecuación 1"> donde erfc es la función de error complementaria, x es la distancia en el tejido desde el canal, y t es el tiempo después de la introducción de Dox (véase la fig. 3). Utilice el siguiente esquema iterativo en cada punto de tiempo considerado: <ul><li> Adivina un valor para D </li><li> Calcular lado derecho de la ecuación en cada ubicación x </li><li> Calcular la suma de los errores cuadráticos (residual) entre las dos partes </li><li> Modificar D para minimizar el residual </li></ul></li><li> Promedio de los valores óptimos de D obtenidos en cada punto de tiempo para estimar el coeficiente medio de difusión efectivo de Dox en el tejido. </li></ol> 7. Los resultados representativos: &lt;clase p = "jove_content"&gt; Los dispositivos de microfluidos proporcionado 1mm x 0,3 mm x 0,15 mm ópticamente cámaras accesibles de cultivo para el crecimiento de tejido del tumor en tres dimensiones. Esferoides multicelulares tumorales fueron trasladados a estas cámaras y fueron retenidos por dos puestos de filtro en la parte posterior. El método de la gota colgante permite rápida formación de esferoides de tamaño uniforme y la forma de varias líneas celulares. Esferoides fueron cultivadas con éxito en el dispositivo durante un máximo de 3 días. El crecimiento en las cámaras se asoció con una modificación reproducible de microambientes dentro de esferoides. La apoptosis se produjo menos en las células en la proximidad del canal de flujo y mayor más profundamente en el tejido. El dispositivo se utilizó para estimar el coeficiente de difusión de la doxorrubicina en el tejido tumoral. El valor obtenido de 8,75 x 10 -7 cm -1 2 s de acuerdo con el valor de 9,1 x 10 -7 cm 2 s -1 informó anteriormente 6 en cáncer de mama humano. <table border="1"><tbody><tr><td> Línea celular </td><td> Requiere concentración celular </td><td> Tiempo de incubación </td></tr><tr><td> LS174T </td><td> 300 células / l </td><td> 2-3 días </td></tr><tr><td> T47D </td><td> 750 células / l </td><td> 3-4 días </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> 150 células / l </td><td> 5-6 días </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Parámetros para Spheroids gota colgante <table border="1"><tbody><tr><td> Parte </td><td> Descripción </td></tr><tr><td> S F </td><td> Flujo Jeringa </td></tr><tr><td> S P </td><td> Embalaje Jeringa </td></tr><tr><td> V Fin </td><td> Flujo de la válvula de entrada </td></tr><tr><td> V Pin </td><td> Embalaje válvula de entrada </td></tr><tr><td> V Fout </td><td> Flujo de salida de la válvula </td></tr><tr><td> V Pout </td><td> Embalaje válvula de salida </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Las jeringas y válvulas en configuración de flujo <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Esquema de la configuración de flujo de aleta V y V Fout:. Entrada de flujo y válvulas de salida; V Pin y Pout V: Embalaje de entrada y válvulas de salida, S y F S P: Flujo y jeringas de embalaje. La jeringa de preparación y envasado de entrada y válvulas de salida se utilizan cuando un esferoide se vuela en la cámara. La jeringa y el flujo de entrada de flujo y válvulas de salida se utilizan para fluir medio posteriormente. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Esquema de un esferoide atrapado en una cámara en el dispositivo. Un esferoide se hace fluir en la cámara en el dispositivo y está bloqueado por dos pos filtrots en la parte posterior de la cámara. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Doxorrubicina difusión en el tejido tumoral en el dispositivo. A. Fusionada imagen transmitida luz fluorescente y rojo de tejido, que muestra la ubicación y concentración de doxorrubicina (en rojo). La barra de escala representa a 250 micras. B. Normalizado perfil de intensidad de fluorescencia lineal de doxorubicina.

<ol><li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Prototyping+of+Microfluidic+Systems+in+Poly%28dimethylsiloxane%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane).</a> Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).</li>
<li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol. Bioeng. 83, 173-180 (2003).</li>
<li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods. Mol. Med. 140, 141-151 (2007).</li>
<li>Kasinskas, R. W., Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+specifically+chemotax+and+proliferate+in+heterogeneous+tumor+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium specifically chemotax and proliferate in heterogeneous tumor tissue in vitro.</a> Biotechnol. Bioeng. 94, 710-721 (2006).</li>
<li>Walsh, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipurpose+microfluidic+device+designed+to+mimic+microenvironment+gradients+and+develop+targeted+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">A multipurpose microfluidic device designed to mimic microenvironment gradients and develop targeted cancer therapeutics.</a> Lab. Chip. 9, 545-554 (2009).</li>
<li>Lankelma, J., Fernandez Luque, R., Dekker, H., Schinkel, W., Pinedo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mathematical+model+of+drug+transport+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">A mathematical model of drug transport in human breast cancer.</a> Microvasc. Res. 59, 149-161 (2000).</li>
<li>Less, J. R., Skalak, T. C., Sevick, E. M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+architecture+in+a+mammary+carcinoma%3A+branching+patterns+and+vessel+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular architecture in a mammary carcinoma: branching patterns and vessel dimensions.</a> Cancer. Res. 51, 265-273 (1991).</li>
<li>Brown, J. M., Giaccia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+physiology+of+solid+tumors%3A+opportunities+%28and+problems%29+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy.</a> Cancer. Res. 58, 1408-1416 (1998).</li>
<li>Thomlinson, R. H., Gray, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histological+structure+of+some+human+lung+cancers+and+the+possible+implications+for+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy.</a> Br. J. Cancer. 9, 539-549 (1955).</li>
<li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La vascularización de los tumores son escasas y mal desarrollados 7,8. Hay regiones situadas lejos (&gt; 100 mm) de los vasos sanguíneos que son inaccesibles para los nutrientes y medicamentos suministrados aunque la vasculatura 9. El microambiente heterogénea resultante contribuye a la eficacia limitada de muchos agentes quimioterapéuticos 10. El dispositivo microfluídico desarrollado aquí recrea un microambiente tumoral heterogénea que se caracteriza por la proliferación, las células q...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre de reactivo </th><th> Empresa </th><th> El número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Kit de silicona elastómero </td><td> Ellsworth Adhesives </td><td> 184 Sil Elast Kit </td><td></td></tr><tr><td> Miltex biopsia en sacabocados </td><td> MedexSupply </td><td> MTX-33-31AA </td><td> 1,5 mm </td></tr><tr><td> PTFE tubería </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.417-31 </td><td> 0,032 &quot;ID </td></tr><tr><td> Hombre luer lock </td><td> Qosina </td><td> 65111 </td><td></td></tr><tr><td> Púas conector hembra luer lock </td><td> Qosina </td><td> 11556 </td><td></td></tr><tr><td> Válvula de cierre </td><td> Idex Salud y Ciencia </td><td> P-721 </td><td></td></tr><tr><td> Y-conector </td><td> Idex Salud y Ciencia </td><td> P-513 </td><td></td></tr><tr><td> 20G 1,5 &quot;agujas </td><td> BD Bioscience </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW fluoresceína </td><td> Biovision </td><td> K183-25 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW Red </td><td> Biovision </td><td> K193-25 </td><td></td></tr><tr><td> Clorhidrato de doxorubicina </td><td> Sigma </td><td> 44583 </td><td></td></tr><tr><td> LS174T </td><td> ATCC </td><td> CCL-188 </td><td> Carcinoma de colon humano línea celular </td></tr><tr><td> T47D </td><td> ATCC </td><td> HTB-133 </td><td> Carcinoma ductal Humanos línea celular </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> ATCC </td><td> HTB-26 </td><td> Adenocarcinoma mamario humano línea celular </td></tr></tbody></table>

dispositivo de microfluidos para volver a crear un microambiente tumoral<em&gt; in vitro</em

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Hemos desarrollado un dispositivo de microfluidos que imita la entrega y el aclaramiento sistémico de fármacos para heterogéneos tejidos tridimensionales tumorales in vitro. Nutrientes suministrados por la vasculatura no llegan a todas las partes de los tumores, dando lugar a microambientes heterogéneo que consiste en tipos de células viables, quiescentes y necróticas. Muchos fármacos de cáncer no logran penetrar con eficacia y tratar todos los tipos de células, debido a esta heterogeneidad. Las monocapas de células de cáncer no imitan esta heterogeneidad, por lo que es difícil de probar fármacos contra el cáncer con un adecuado modelo in vitro. Nuestros dispositivos de microfluidos se fabricaron fuera de PDMS mediante litografía blanda. Esferoides multicelulares tumorales, formadas por el método de la gota colgante, se insertaron y constreñido en cámaras rectangulares en el dispositivo y se mantiene con perfusión del medio continuo en un lado. La forma rectangular de cámaras en el dispositivo creado gradientes lineales dentro del tejido. Manchas fluorescentes se utilizan para cuantificar ªe variabilidad en la apoptosis en el tejido. Los tumores en el dispositivo fueron tratados con el fármaco quimioterapéutico doxorrubicina fluorescente, el tiempo transcurrido microscopía se utilizó para controlar su difusión en el tejido, y el coeficiente de difusión efectiva se estimó. El método de la gota colgante permite rápida formación de esferoides uniformes a partir de varias líneas celulares de cáncer. El dispositivo de activar el crecimiento de esferoides de hasta 3 días. Las células en la proximidad del medio que fluye fueron mínimamente apoptótica y los alejados del canal eran más apoptótica, con lo que precisa que imitan las regiones de los tumores adyacentes a los vasos sanguíneos. El valor estimado del coeficiente de difusión doxorrubicina mostró de acuerdo con un valor previamente en el cáncer de mama humano. Debido a que la penetración y la retención de las drogas en los tumores sólidos afecta a su eficacia, creemos que este dispositivo es una herramienta importante en la comprensión del comportamiento de los medicamentos y el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer.

Se presenta el procedimiento para la fabricación y el funcionamiento de un dispositivo de microfluidos que recrea heterogéneos microambientes tumorales<em&gt; In vitro</em&gt;. La variabilidad en la apoptosis en el tejido tumoral se cuantificó utilizando tinciones fluorescentes y el coeficiente de difusión eficaz del fármaco quimioterapéutico doxorrubicina en el tejido tumoral se evaluó.

Dispositivo de microfluidos para volver a crear un microambiente tumoral<em&gt; In Vitro</em

Hemos desarrollado un dispositivo microfluídico que imita la administración y el aclaramiento sistémico de fármacos hacia tejidos tumorales tridimensionales heterogéneos en ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la fabricación y el funcionamiento de un dispositivo microfluídico que recrea microambientes tumorales in vitro y que puede utilizarse para probar fármacos quimioterapéuticos. Este es el dispositivo microfluídico. Este dispositivo puede ser útil en las siguientes áreas: pruebas sencillas de fármacos quimioterapéuticos in vitro.Proporciona resultados consistentes y precisos para la prueba de tejido tumoral tridimensional, y este dispositivo ofrece una representación muy precisa del tumor in vivo. Los tumores existen en microentornos tridimensionales, y la capacidad de realizar pruebas en uno de estos entornos es significativa. El primer paso del procedimiento consiste en ensamblar el dispositivo, lo que implica la fabricación de un chip microfluídico mediante litografía suave, la perforación de orificios en las entradas y salidas, la unión a una portaobjetos de vidrio y la conexión de tubos para la entrada y salida del flujo.A continuación, se generan esteroides tumorales multicelulares uniformes para su uso en el dispositivo mediante el método de gota colgante. Luego, los esferoides se introducen en el dispositivo, seguidos de agentes detectores de apoptosis y fármacos quimioterapéuticos. Finalmente, se realiza microscopía de lapso de tiempo, seguida de la estimación matemática de los coeficientes de difusividad del fármaco para cuantificar la capacidad de penetración del agente quimioterapéutico.Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran el crecimiento del tejido en la formación del dispositivo, la creación de microentornos heterogéneos dentro del tejido y la difusión del fármaco hacia el tejido mediante microscopía de fluorescencia con intervalos de tiempo. La penetración limitada de fármacos contra el cáncer en tumores sólidos es una causa importante de su fracaso. La mayoría de los modelos actuales de prueba de fármacos contra el cáncer no imitan la naturaleza tridimensional de los tumores sólidos.Hemos desarrollado un dispositivo microfluídico que consiste en tejidos tumorales tridimensionales con perfusión continua. Este modelo representa con mayor precisión la administración de fármacos a tumores sólidos y su eliminación sistémica. Los esteroides tumorales multicelulares son un modelo bien establecido de tejidos tumorales tridimensionales.En este procedimiento, se utiliza el método de la gota colgante para crear esferoides destinados al uso en el dispositivo microfluídico. Este método permite la formación de esferoides homogéneos en un breve período de tiempo. Evaluar fármacos quimioterapéuticos in vitro en tejidos tridimensionales puede ayudar a seleccionar fármacos de manera más eficiente en comparación con monocapas de células.Mezcle el PDMS y el agente de curado del elastómero de silicona en una proporción de nueve a uno en peso. Luego, vierta esta mezcla sobre el molde maestro para formar una capa de PDMS de cuatro milímetros de espesor. Para eliminar las burbujas de aire, cure a 60 grados Celsius durante cinco horas.Despegue el PDMS curado del molde para obtener un sello con las características de flujo en el elastómero. Luego, utilizando un punzón de biopsia de un milímetro y medio montado en un taladro, presione para hacer orificios para las entradas y salidas. Retire cualquier residuo.Someta el lado de la estampa con la característica y una portaobjetos de vidrio limpia a plasma de oxígeno durante ocho minutos. En un grabador por plasma de oxígeno, ponga en contacto inmediato las superficies tratadas para formar un enlace entre ellas. Mantenga el conjunto a 60 grados Celsius sobre un calentador de portaobjetos durante al menos cinco horas.Para reforzar la unión, conecte un tubo de PTFE con un diámetro interno de 0.032 pulgadas a las entradas y salidas del dispositivo microfluídico. Utilizando una interfaz de conectores macho de bloqueo tipo bayoneta unidos a conectores hembra de bloqueo tipo bayoneta con extremos ahusados, estos conectores específicos permiten que el tubo pase fácilmente sin romperse. Finalmente, arme el sistema de flujo utilizando válvulas de cierre y un conector en Y, y monte el dispositivo en el microscopio. Después de montar el dispositivo, conecte los tubos a las entradas y salidas correspondientes para completar la configuración del flujo.Como se muestra en esta figura, esta configuración permite la facilidad y versatilidad de empaquetar un esferoide en el dispositivo o crear un flujo de medio a través del dispositivo para el empaquetado. Abra la válvula de entrada de empaquetado VPN y la válvula de salida de empaquetado VP para extraer un tumor. A continuación, el OID puede pasar a través de la entrada y fluir hacia la cámara de cultivo, donde el poste en esta cámara mantendrá el tumor en su lugar para permitir el flujo del medio.Cierre las válvulas de empaque y abra la válvula de entrada de flujo VF in y la válvula de salida de flujo VF out para iniciar la formación de PHE uniforme. Utilizando el método de la gota colgante, retire las células con tripsina bajo una campana de cultivo. Tome las células con tripsina resultantes del centrífugo.Diluya la solución stock a una concentración deseada consultando la tabla uno. A continuación, retire la tapa de una placa de 48 pocillos y colóquela boca abajo. En una cabina esterilizada, agregue un mililitro de agua esterilizada a cada pocillo de la placa.Para mantener la humedad, coloque una gota de 20 microlitros de solución diluida de células en cada región circular de la cubierta. Utilizando una micropipeta, invierta cuidadosamente la cubierta y colóquela sobre la placa, asegurándose de que las gotas no toquen los bordes de los pocillos. Incube la placa a 37 grados Celsius.Consulte la tabla uno para conocer la duración de la incubación según el tipo de célula utilizado; un esteroide se formará en cada gota colgante. Comience por esterilizar el dispositivo lavándolo con etanol al 70 % a través de la entrada de flujo. A continuación, realice un lavado con PBS y luego con medio de cultivo celular tamponado con H-E-P-E-S.Deje la jeringa con medio, conéctela al tubo. A continuación, aspire dos o tres esteroides en el punto de acceso de la jeringa. Para eliminar las burbujas de aire, conecte la jeringa a la entrada de embalaje del dispositivo.Abrir la válvula de entrada VPN y cerrar VFN; abrir la válvula de salida VP out y cerrar VF out. Mantener la jeringa de empaque en posición vertical con la aguja apuntando hacia abajo. Observar cómo el esteroide se sedimenta en el fondo de la jeringa, hacia el conector tipo luer lock de la aguja.Presione el émbolo de la jeringa de empaque y observe cómo el PHE entra en el tubo y fluye hacia el dispositivo, ya que solo la válvula de salida de empaque está abierta. Un esteroide entrará en la cámara del dispositivo y será retenido por los postes en la parte trasera. Una vez dentro de la cámara, el esferoide S se adapta a la forma de la cámara y adquiere una geometría rectangular.Cierre la válvula de entrada VPN y la válvula de salida VP, coloque la jeringa de flujo SF en la bomba de jeringa. Esta bomba es controlada por una computadora mediante Syringe Pump Pro; abra la válvula de entrada VFN y la válvula de salida VF. Inicie el flujo de medio hacia el dispositivo a tres microlitros por minuto.La incubación de los esferoides durante 24 horas va seguida de la introducción de agentes detectores de apoptosis. Antes de introducir agentes detectores de apoptosis o agentes terapéuticos, permita que los esferoides alcancen el equilibrio durante hasta 24 horas para establecer gradientes de nutrientes y microentornos. Luego cierre la válvula VFN.Detenga la bomba de jeringa. Retire la jeringa de la bomba y sustitúyala por la jeringa que contiene medio con 0,25 microlitros por mililitro de marcador activo de caspasa tres CASP glow red. Lave el dispositivo con la solución, pasando manualmente 0,7 mililitros de ella a través del dispositivo.Luego monte la jeringa en la bomba. Reinicie el flujo y abra la válvula VFN. Durante un período de cinco a ocho horas, la fase activa de guante rojo CPH de la etapa tres difundirá en el tejido y fluorescerá más intensamente en las regiones apoptóticas. El agente de detección de apoptosis se mantiene a esta concentración en todas las soluciones de flujo posteriores.Se introduce doxorrubicina entre cinco y ocho horas después de la introducción de los agentes de detección de apoptosis. Este tratamiento se elimina del sistema mediante lavado. Para añadir agentes quimioterapéuticos, siga el procedimiento para la detección de apoptosis con el fin de introducir doxorrubicina hidrocloruro a 10 micromolares.Luego, reemplace la jeringa de tratamiento con la jeringa que contiene 0,7 mililitros de medio. Continúe el flujo del agente terapéutico durante un período de tiempo fijo. A continuación, cierre la válvula VFN y apague la bomba de jeringa.Retire la jeringa de tratamiento de la bomba de jeringa y sustitúyala por la jeringa con 0,7 mililitros de medio. Permita el flujo de medio fresco durante 24 a 36 horas mientras monitorea continuamente el tejido bajo un microscopio. Todo el proceso de adquisición para la microscopía de lapso de tiempo se automatizó utilizando un script personalizado en IP Lab, adquiriendo imágenes de luz transmitida y de fluorescencia del PAX Foid a 10x de magnificación cada 30 minutos. Para la estimación matemática de los coeficientes de difusividad del fármaco, el primer paso consiste en generar perfiles de intensidad lineal promedio de la fluorescencia de Docs utilizando ImageJ. Seleccione una región rectangular de interés, o ROI, que abarque el tejido en la cámara.Utilice el comando perfil de trazado para generar un perfil de intensidades promedio en función de la distancia desde el canal de flujo. Repita este procedimiento para hasta tres puntos de tiempo diferentes. A continuación, reste la intensidad promedio de fluorescencia de fondo de los perfiles de intensidad obtenidos y normalice cada perfil utilizando la intensidad máxima correspondiente para obtener C como función de X y T. Donde C es la concentración normalizada de doxorrubicina, el valor de C varía entre cero y uno.El siguiente paso consiste en evaluar el coeficiente de difusión efectivo de docs en el tejido tumoral docs. La difusión puede representarse mediante la siguiente ecuación, donde ERFC es la función de error complementaria. X es la distancia dentro del tejido desde el canal, y T es el tiempo transcurrido tras la introducción de doxorubicina.Utilice el siguiente esquema iterativo en cada punto temporal considerado. Adivine un valor para D. Calcule el lado derecho de la ecuación en cada ubicación. X. Calcule la suma de los errores al cuadrado entre ambos lados, y modifique D para minimizar el promedio del residuo.Los valores óptimos de D obtenidos en cada punto temporal para estimar el coeficiente de difusión efectivo promedio de doxorrubicina en el tejido. Los dispositivos microfluídicos proporcionaron cámaras de cultivo ópticamente accesibles de un milímetro por 0,3 milímetros por 0,15 milímetros para el crecimiento de tejido tumoral tridimensional. El método de gota colgante permitió la rápida formación de esferoides tumorales de tamaño y forma consistentes a partir de varias líneas celulares.Las EHP se cultivaron con éxito en el dispositivo durante hasta tres días. El crecimiento en las cámaras se asoció con la modificación reproducible de microentornos. Dentro de las EHP, la apoptosis ocurrió menos en las células cercanas al canal de flujo y fue mayor y más profunda en el tejido.El dispositivo se utilizó para estimar el coeficiente de difusión de doxorubicina y tejido tumoral. El valor obtenido experimentalmente coincidió con el valor reportado previamente en cáncer de mama humano. Al realizar este procedimiento, es importante tener especial cuidado en mantener la esterilidad al hacer fluir PHE dentro del dispositivo, ya que debe realizarse fuera del cultivo celular.Rocíe generosamente con etanol las jeringas del capuchón y los extremos de los tubos para garantizar la esterilidad. Después de ver este video, debería tener una comprensión del papel que juega la penetración limitada de los fármacos en los tumores. Hemos demostrado una técnica para imitar la administración y la eliminación sistémica de fármacos en tejidos tumorales tridimensionales y cuantificar su penetración.La eliminación de fármacos con baja penetración simplificará significativamente el proceso de desarrollo de fármacos contra el cáncer.

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