Dispositivo de microfluidos para volver a crear un microambiente tumoral In Vitro

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la fabricación y el funcionamiento de un dispositivo microfluídico que recrea microambientes tumorales in vitro y que puede utilizarse para probar fármacos quimioterapéuticos. Este es el dispositivo microfluídico. Este dispositivo puede ser útil en las siguientes áreas, pruebas fáciles para medicamentos quimioterapéuticos in vitro.

Proporciona resultados consistentes y precisos para analizar tejido tumoral tridimensional, y este dispositivo proporciona una representación muy precisa del tumor in vivo. Microambientes Los tumores existen en microambientes 3D y la capacidad de realizar pruebas en uno es significativa. El primer paso del procedimiento es ensamblar el dispositivo, que implica la fabricación de un chip microfluídico mediante litografía suave, perforar orificios en las entradas y salidas, unirlo a un portaobjetos de vidrio y conectar la tubería para la entrada y salida del flujo.

A continuación, se generan los esteroides tumorales multicelulares uniformes para su uso en el dispositivo mediante el método de gota colgante. A continuación, los esferoides se introducen en el dispositivo, seguido de la apoptosis, los agentes detectores y los fármacos quimioterapéuticos. Finalmente, se realiza microscopía de lapso de tiempo, seguida de la estimación matemática de los coeficientes de difusividad del fármaco para cuantificar la capacidad de penetración del agente quimioterapéutico.

En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el crecimiento del tejido en la formación de microambientes heterogéneos dentro del tejido y la difusión del fármaco en el tejido mediante el uso de microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo. La penetración limitada de los medicamentos contra el cáncer en los tumores sólidos es una causa importante de su fracaso. La mayoría de los modelos actuales de pruebas de medicamentos contra el cáncer no imitan la naturaleza tridimensional de los tumores sólidos.

Hemos desarrollado un dispositivo microfluídico que consiste en tejidos tumorales tridimensionales perfundidos continuamente. Este modelo representa con mayor precisión la administración de fármacos a los tumores sólidos y su eliminación sistémica. Los esteroides tumorales multicelulares son un modelo bien establecido de tejidos tumorales tridimensionales.

En este procedimiento, se utiliza el método de gota colgante para crear esteroides para su uso en el dispositivo microfluídico. Este método permite la formación de esteroides consistentes en un corto período de tiempo. Las pruebas de fármacos quimioterapéuticos in vitro en tejido tridimensional pueden ayudar a detectar fármacos de una manera más eficaz en comparación con las monocapas de células.

Mezcle el PDMS y el agente de curado del elastómero de silicona en una proporción de peso de nueve a uno. A continuación, vierta esta mezcla sobre el maestro para formar un deslumbramiento de cuatro milímetros de grosor. Para eliminar las burbujas de aire, cure a 60 grados centígrados durante cinco horas.

Pele el PDMS curado del molde para obtener un sello de características de flujo en el elastómero. Luego, usando un punzón de biopsia de un milímetro y medio montado en un taladro, presione los orificios de perforación para entradas y salidas. Saca cualquier residuo.

Someta el lado característico de la estampilla y un portaobjetos de vidrio limpio a plasma de oxígeno durante ocho minutos. En un grabador de plasma de oxígeno, ponga las superficies tratadas en contacto inmediatamente para formar una unión entre ellas. Mantenga el conjunto a 60 grados centígrados en un calentador de portaobjetos durante al menos cinco horas.

Para fortalecer la unión, conecte un tubo de PTFE de 0.032 pulgadas de diámetro interno a las entradas y salidas del dispositivo microfluídico. Utilizando una interfaz de conectores de bloqueo de señuelo macho unidos a conectores de bloqueo de señuelo hembra con púas, estos conectores específicos se utilizan para permitir pasar fácilmente a través de ellos sin romperse. Finalmente, configure el conjunto de flujo usando válvulas de cierre y un conector Y, monte el dispositivo en el microscopio Después de montar el dispositivo, conecte la tubería a las entradas y salidas adecuadas para completar la configuración del flujo.

Como se muestra en esta figura, esta configuración permite la facilidad y versatilidad de empaquetar un esferoide en el dispositivo o crear un flujo de medio a través del dispositivo para empacar. Abra la válvula de entrada de empaquetadura VPN y la válvula de salida de empaquetadura VP para extraer un tumor. Luego, la OID puede pasar a través de la entrada y fluir hacia la cámara de cultivo, donde el poste de esta cámara mantendrá el tumor en su lugar para fluir el medio.

Cierre las válvulas de empaquetadura y abra la válvula de entrada de flujo VF hacia adentro y la válvula de salida de flujo VF hacia afuera para iniciar la formación de PHE uniforme. Utilizando el método de gota colgante células de hielo de tripsina bajo una campana de cultivo. Tome las células de tripsina resultantes de la centrífuga.

Diluya la solución madre hasta la concentración deseada consultando la tabla uno. A continuación, retire la tapa de una placa de 48 pocillos y colóquela boca abajo. En una campana esterilizada, llene cada pocillo del plato con un mililitro de agua esterilizada.

Para mantener la humedad, coloque una gota de 20 microlitros de solución celular diluida en cada región circular de la cubierta. Con una micropipeta, invierta con cuidado la tapa y colóquela sobre la placa, asegurándose de que las gotas no toquen los bordes de los pocillos. Incubar la placa a 37 grados centígrados.

Consulte la tabla uno para conocer la duración de la incubación en función de la célula particular utilizada, se formará un esteroide en cada gota colgante. Comience esterilizando el dispositivo enjuagándolo con etanol al 70% a través de la entrada de flujo. A continuación, enjuague cada uno de los PBS, luego H-E-P-E-S medio de cultivo celular tamponado.

Deje la jeringa mediana conectada al tubo. A continuación, extraiga dos o tres esteroides en la jeringa de grifo. Para eliminar las burbujas de aire, coloque la jeringa en la entrada de empaquetadura del dispositivo.

Abra la válvula de entrada VPN y cierre, abra la válvula de salida VFN VP y cierre la VF. Sostenga la jeringa de empaquetadura en posición vertical con la aguja apuntando hacia abajo. Observe cómo el esteroide se deposita en el fondo de la jeringa en el conector de bloqueo del señuelo de la aguja.

Empuje el émbolo en la jeringa de empaquetadura y observe cómo el PHE entra en el tubo y fluye hacia el dispositivo porque solo la válvula de salida de la empaquetadura está abierta. Un esteroide entrará en la cámara del dispositivo y será retenido por postes en la parte posterior. Una vez dentro de la cámara, el esferoide S se adapta a la forma de la cámara y adquiere una geometría rectangular.

Cierre la válvula de entrada VPN y la válvula de salida VP monte la jeringa de flujo SF en la bomba de jeringa. Esta bomba es operada por una computadora que utiliza la válvula de entrada abierta de la bomba de jeringa pro VFN y la válvula de salida VF de salida. Comience el flujo de medio en el dispositivo a tres microlitros por minuto.

La incubación del esferoide durante 24 horas es seguida por la introducción de agentes detectores de apoptosis. Antes de introducir la apoptosis, los agentes detectores o terapéuticos, permita el equilibrio del esferoide durante un máximo de 24 horas para establecer gradientes de nutrientes y microambientes. A continuación, cierre la válvula VFN.

Detenga la bomba de jeringa. Retire la jeringa de la bomba y reemplácela con el medio que contiene la jeringa con 0.25 microlitros por mil de CASP rojo brillante activo Caspasa tres marcador. Lave el dispositivo con la solución enjuagando manualmente 0,7 mililitros a través del dispositivo.

A continuación, monte la jeringa en la bomba. Reinicie el flujo y abra la válvula VFN. Durante un período de cinco a ocho horas, la fase tres de cph activa del guante de barril rojo se difundirá en el tejido y emitirá un fluorescente más brillante en las regiones apoptóticas, el agente de detección de apoptosis a esta concentración se mantiene en todas las soluciones de flujo posteriores.

La doxorrubicina se introduce de cinco a ocho horas después de la introducción de los agentes detectores de apoptosis. Este tratamiento se elimina del sistema mediante enjuague. Para agregar agentes quimioterapéuticos, siga el procedimiento de detección de apoptosis para introducir clorhidrato de doxorrubicina 10 micromolares.

A continuación, sustituya la jeringa de tratamiento por la jeringa de 0,7 mililitros de medio. Continúe el flujo del agente terapéutico durante un período de tiempo fijo. A continuación, cierre la válvula VFN y apague la bomba de jeringa.

Retire la jeringa de tratamiento de la bomba de jeringa y reemplácela con la jeringa con 0,7 mililitros de medio. Permita el flujo de medio fresco durante 24 a 36 horas mientras monitorea continuamente el tejido bajo un microscopio. Todo el proceso de adquisición para la microscopía de lapso de tiempo se automatizó utilizando un script personalizado en el laboratorio de IP, adquiera imágenes de luz transmitida y fluorescencia del PAX Foid con un aumento de 10x cada 30 minutos Para la estimación matemática de los coeficientes de difusividad de los fármacos, el primer paso es generar perfiles de intensidad lineal promedio de la fluorescencia de los documentos utilizando la imagen J. Seleccione una región rectangular de intereses, o el ROI que abarca el tejido en la cámara.

Utilice el comando trazar perfil para generar un perfil de intensidades medias en función de la distancia desde el canal de flujo. Repita hasta tres puntos de tiempo diferentes. A continuación, reste la intensidad media de fluorescencia de fondo de los perfiles de intensidad obtenidos y normalice cada perfil utilizando la intensidad máxima correspondiente para obtener C en función de X y T. Donde C es la concentración normalizada de doxorrubicina, el valor de C varía entre cero y uno.

El siguiente paso es evaluar el coeficiente de difusión efectiva de los docs dentro de los docs de tejido tumoral. La difusión se puede representar mediante la siguiente ecuación, donde ERFC es la función de error complementaria. X es la distancia al tejido desde el canal, y T es el tiempo después de la introducción de doxorrubicina.

Utilice el siguiente esquema iterativo en cada punto de tiempo considerado. Adivina un valor para D.Calcular el lado derecho de la ecuación en cada ubicación. X. Calcule la suma de los errores al cuadrado entre los dos lados, modifique D para minimizar el promedio residual.

Los valores óptimos de D obtenidos en cada momento permiten estimar el coeficiente de difusión efectiva media de la doxorrubicina en el tejido. Los dispositivos microfluídicos proporcionaron cámaras de cultivo ópticamente accesibles de un milímetro por 0,3 milímetros por 0,15 milímetros para el crecimiento de tejido tumoral tridimensional. El método de la gota colgante permitió la formación rápida de PHE tumoral de tamaño y forma consistentes a partir de varias líneas celulares.

Las PHE crecieron con éxito en el dispositivo durante un máximo de tres días. El crecimiento en las cámaras se asoció con la modificación reproducible de los microambientes. Dentro de la phe, la apoptosis ocurrió menos en las células cercanas al canal de flujo y más y más adentro del tejido.

El dispositivo se utilizó para estimar el coeficiente de difusión de la doxorrubicina y el tejido tumoral. El valor contaminado experimentalmente coincidió con el valor reportado previamente en el cáncer de mama humano al intentar este procedimiento. Es importante tener mucho cuidado de mantener la esterilidad al introducir PHE en el dispositivo, ya que debe realizarse fuera del cultivo celular.

La capucha rocía generosamente las jeringas y los extremos de los tubos con etanol para garantizar la esterilidad. Después de ver este video, debe comprender el papel de la penetración limitada de los medicamentos en los tumores. Hemos demostrado una técnica para imitar la administración y el aclaramiento sistémico de fármacos en tejidos tumorales tridimensionales y cuantificar su penetración.

La eliminación de los fármacos poco penetrantes agilizará significativamente el proceso de desarrollo de fármacos contra el cáncer.