Cribado de bacterias marinas para el aislamiento de cepas degradantes de contaminantes

Toma una muestra de agua de mar que contiene microbios diversos, incluyendo bacterias que degradan contaminantes ambientales.

Diluye en serie la muestra para reducir la densidad microbiana y colócala en un medio nutritivo.

Después de la incubación, selecciona colonias morfológicamente distintas, que aún pueden albergar tipos bacterianos genética y metabólicamente diversos.

Estrena cada colonia seleccionada para dispersar las células individuales e incubarlas.

Cada célula forma una colonia, que representa un aislado bacteriano genéticamente puro con un perfil metabólico distinto.

Inocúla cada aislado en un medio de crecimiento e incuba para aumentar la biomasa.

Centrifuga el cultivo, desecha el sobrenadante y lávate con un tampón para eliminar el medio residual.

Resuspende las células en el tampón e inocúlalas en un medio de selección que contenga EE2, un contaminante ambiental.

Como única fuente de carbono en el medio, EE2 selecciona bacterias que pueden metabolizarlo para obtener energía y crecimiento.

La turbidez en el medio indica crecimiento bacteriano, confirmando el aislamiento del aislado bacteriano degradante de contaminantes.

Para seleccionar bacterias, primero se realizan diluciones en serie hasta 10 a los negativos nueve en solución estéril salina para muestras de coral y hasta 10 a los negativos seis para muestras de agua. La pipeta diluye cinco veces antes de descartar la punta.

Luego, vórtice cada uno. Haz un vórtice de las muestras durante cinco segundos cada vez antes de realizar la siguiente dilución en serie. Pipetear 100 microlitros de cada dilución en placas de Petri que contengan 3% de cloruro de sodio para el caldo de lisogénica, medio de agar y emplatarlas.

Incuba las placas durante uno a tres días a la temperatura objetivo, por ejemplo 26 grados Celsius. Revisa las matrículas una vez al día. Selecciona y aísla las colonias que presentan morfologías de crecimiento distintas en nuevas placas utilizando la técnica de placas de estría.

Repite este paso tantas veces como sea necesario para que crezcan colonias puras en las placas. Guarda los aislados a cuatro grados Celsius o en glicerol como se describe en el manuscrito. Para realizar la prueba de capacidad de degradación EE2, extrae una sola colonia de las placas frescas e inocúla en dos mililitros de medio LB estéril en un tubo.

Si es un stock de glicerol, toma 10 microlitros de stock bacteriano de glicerol y haz una franja sobre placas de agar LB. Incuba a 24 a 28 grados Celsius durante la noche para que crezcan colonias individuales. Colocar el tubo que contiene LB de medio inclinado bajo agitación constante a 150 veces g a 24 a 28 grados Celsius durante la noche.

Tras el crecimiento bacteriano, haz pellets a las células centrifugándolas a 8.000 veces g durante ocho minutos a temperatura ambiente. Descarta el sobrenadante. Para lavar el caldo de LB restante, añade dos mililitros de agua salina para resuspender las células.

Repite el lavado dos veces para asegurarte de que no quedan rastros de carbono. Inocular las células lavadas y resuspendidas en un medio de cultivo Bushnell Haas mínimo que contenga EE2 como única fuente de carbono. Evaluar el crecimiento bacteriano por densidad óptica a 600 nanómetros y nuestras unidades de formación de colonias en medio de agar LB tras 16 a 72 horas de incubación.