Name: Evaluación de respirometría la fosforilación oxidativa en saponina-permeabilized fibras cardíacas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-28T18:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Aprende a evaluar la fosforilación oxidativa mitocondrial en fibras cardíacas permeabilizadas con saponina mediante respirometría de alta resolución. Este protocolo permite medir con precisión la función mitocondrial in situ en tejido cardíaco de roedor.

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Este estudio fue financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud y Canadá Genoma. JS tiene premios salario apoyo de la Fundación del Patrimonio de Alberta para la Investigación Médica, Heart and Stroke Foundation de Canadá y la Asociación Canadiense de Diabetes. El laboratorio desea agradecer la asistencia técnica de los instrumentos de Oroboros durante la adquisición de la técnica de fibra de saponina-permeabilizadas.

<ol><li>Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilized+cell+and+skinned+fiber+techniques+in+studies+of+mitochondrial+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo.</a> Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).</li>
<li>Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S. Mitochondria in the cold. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Life+in+the+Cold%22">Life in the Cold</a>. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 431-442 (2000).</li>
<li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+solubilities+of+media+used+in+electrochemical+respiration+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Oxygen solubilities of media used in electrochemical respiration measurements.</a> Anal Biochem. 319, 105-113 (2003).</li>
<li>Visscher, G. D. e, Rooker, S., Jorens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pentobarbital+fails+to+reduce+cerebral+oxygen+consumption+early+after+non-hemorrhagic+closed+head+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Pentobarbital fails to reduce cerebral oxygen consumption early after non-hemorrhagic closed head injury in rats.</a> J Neurotrauma. 22, 793-806 (2005).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+conformance+of+cellular+respiration.+A+perspective+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxygen conformance of cellular respiration. A perspective of mitochondrial physiology.</a> Adv Exp Med Biol. 543, 39-55 (2003).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle%3A+new+perspectives+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology.</a> Int J Biochem Cell Biol. 41, 1837-1845 Forthcoming.</li>
<li>Sena, S., Hu, P., Zhang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin+signaling+accelerates+cardiac+mitochondrial+dysfunction+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction.</a> J Mol Cell Cardiol. 46, 910-918 (2009).</li>
<li>Boudina, S., Sena, S., O'Neill, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+mitochondrial+oxidative+capacity+and+increased+mitochondrial+uncoupling+impair+myocardial+energetics+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity.</a> Circulation. 112, 2686-2695 (2005).</li>
<li>Lenaz, G., Genova, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+organization+of+mitochondrial+respiratory+complexes%3A+a+new+understanding+of+an+old+subject%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject.</a> Antioxid Redox Signal. 12, 961-1008 Forthcoming.</li>
<li>Lemieux, H., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in the human heart.</a> J Bioenerg Biomembr. 41, 99-106 (2009).</li>
<li>O, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retarded+diffusion+of+ADP+in+cardiomyocytes%3A+possible+role+of+mitochondrial+outer+membrane+and+creatine+kinase+in+cellular+regulation+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Retarded diffusion of ADP in cardiomyocytes: possible role of mitochondrial outer membrane and creatine kinase in cellular regulation of oxidative phosphorylation.</a> Biochim Biophys Acta. 1144, 134-148 (1993).</li>
<li>Endo, M., Kitazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-C+coupling+studies+in+skinned+cardiac+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Aspects+of+Cardiac+Muscle%22%5BJournal%5D)">E-C coupling studies in skinned cardiac fibers.</a> Biophysical Aspects of Cardiac Muscle. Morad, M. , Academic. New York. 307-327 (1978).</li>
<li>Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+parameters+in+cardiac+tissue%3A+a+novel+method+of+assessment+by+using+saponin-skinned+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers.</a> Biochim Biophys Acta. 892, 191-196 (1987).</li>
<li>Bangham, A. D., Horne, R. W., Glauert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+saponin+on+biological+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Action of saponin on biological cell membranes.</a> Nature. , 196-952 (1962).</li>
<li>Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Lipids of mitochondria.</a> Biochim Biophys Acta. 822, 1-42 (1985).</li>
<li>Milner, D. J., Mavroidis, M., Weisleder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desmin+cytoskeleton+linked+to+muscle+mitochondrial+distribution+and+respiratory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function.</a> J Cell Biol. 150, 1283-1298 (2000).</li>
<li>Skladal, D., Sperl, W., Schranzhofer, R. Preservation of mitochondrial functions in human skeletal muscle during storage in high energy preservation solution (HEPS). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkladal%2C+D+%22What+is+Controlling+Life%3F%22">What is Controlling Life?</a>. Skladal, E., Gellerich, F., Wyss, M. , Univ. Press. Vol 3. Modern Trends in BioThermoKinetics 268-271 (1994).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+saponin-permeabilized+muscle+fibers+for+the+diagnosis+of+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases.</a> Biofactors. 7, 221-223 (1998).</li>
<li>Gnaiger, E. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Drug-Induced+Mitochondrial+Dysfunction%22">Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction</a>. Dykens, J., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. 327-352 (2008).</li>
</ol>

La técnica de saponina-permeabilized fibras cardiacas ofrece un compromiso único entre in vitro e in vivo en la evaluación del consumo de oxígeno mitocondrial OXPHOS. Ventajas de esta técnica incluyen el aumento de relevancia fisiológica en comparación con las mitocondrias aisladas como la arquitectura celular se conserva. Mientras que la membrana plasmática se degrada, las estructuras intracelulares de membrana como la mitocondria 12, 14, 14 del retículo sarcoplásmico, miofilamentos y el ci...

<table><tbody><tr><td>Etanol al 100 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC600</td><td></td></tr><tr><td>Etanol al 70%</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC-1000</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&amp;#8242;sal monopotásica de difosfato dihidratada (ADP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina de suero bovino esencialmente libre de ácidos grasos&amp;#8211;gratuito</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-6003</td><td></td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&amp;#8242;-clorhidrato de 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Atractilosido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6882</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>Carbonyl cianuro p-(trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Citocromo c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Etanolamina-bis-(2-amino&amp;#8211;éter tilo)-N,N,N&amp;#8242;,&amp;#8242;ácido tetraacético (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Ácido glutámico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27647</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td></td><td>Ketaset</td></tr><tr><td>Ácido lactobiónico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>153516</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8729;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Ácido málico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,&amp;rsquo;Clorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (TMPD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3134</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>Fosfocreatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Cianuro de potasio</td><td>Fluka</td><td>60178</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato monobásico de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sódico</td><td>Ceva Sante Animale</td><td>1715 138</td><td>Conc. 54,7 mg/ml</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Ácido succínico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Bayer AG</td><td></td><td>Rompun</td></tr><tr><td>ddH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hielo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oroboros Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR international</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Tubos centrífugos de polipropileno de 15 ml</td><td>VWR international</td><td>89004-368</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de centrífuga de 50 ml de polipropileno</td><td>VWR international</td><td>89004-364</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas rectas para joyeros</td><td>George Tiemann &amp;y Cía.</td><td>160-50B</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de joyero curvas</td><td>George Tiemann &amp;y Cía.</td><td>160-57B</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas rectas</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-402</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de bisturí estéril</td><td>VWR international</td><td>BD371610</td><td></td></tr><tr><td>0.45-&amp;mu;m Filtros para jeringa</td><td>VWR international</td><td>CA28145-485</td><td></td></tr><tr><td>medidor de pH</td><td>VWR international</td><td>CA11388-308</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de vidrio</td><td>VWR international</td><td>89000-300</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular de poliestireno de 12 pocillos</td><td>VWR international</td><td>82050-926</td><td></td></tr><tr><td>Placa agitadora</td><td>VWR international</td><td>97042-594</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Microbars</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-511-67</td><td></td></tr><tr><td>Báscula</td><td>VWR international</td><td>CA11278-162</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;mu;l Hamilton Microjeringa</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-815-1</td><td></td></tr><tr><td>25&amp;mu;l Hamilton Microjeringa</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-7</td><td></td></tr><tr><td>50&amp;mu;jeringa microscópica l Hamilton</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-5</td><td></td></tr><tr><td>Botellas exprimibles Nalgene</td><td>Wilkem Scientific</td><td>LNA2407-1000</td><td></td></tr><tr><td>Platos pesadores de poliestireno</td><td>VWR international</td><td>89106-750</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de respirometría la fosforilación oxidativa en saponina-permeabilized fibras cardíacas

Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

Investigación de la función mitocondrial representa un parámetro importante de la fisiología cardiaca como las mitocondrias están implicadas en el metabolismo energético, el estrés oxidativo, la apoptosis, el envejecimiento, encefalomiopatías mitocondrial y la toxicidad del fármaco. Teniendo en cuenta esto, las tecnologías para medir la función mitocondrial cardiaco están en demanda. Una técnica que emplea un enfoque integral para medir la función mitocondrial es respirométrica fosforilación oxidativa (OXPHOS) análisis. El principio de la evaluación de la fosforilación oxidativa respirometría se centra en medir la concentración de oxígeno que utiliza un electrodo de Clark. A medida que el haz de fibras permeabilized consume el oxígeno, la concentración de oxígeno en la disminución de cámara cerrada. Utilizando sustrato seleccionado desacoplador inhibidor de los protocolos de valoración, los electrones se proporcionan a sitios específicos de la cadena de transporte de electrones, lo que permite la evaluación de la función mitocondrial. Técnicas de preparación antes del análisis de respirometría de la función mitocondrial, mecánicos y químicos se utilizan para permeabilizar el sarcolema de las fibras musculares. Permeabilización química emplea saponina para perforar de forma selectiva la membrana celular, manteniendo la arquitectura celular. Este documento describe minuciosamente los pasos a seguir en la preparación de saponina de piel fibras cardiacas para medir el consumo de oxígeno para evaluar la fosforilación oxidativa mitocondrial. Además, la solución de problemas asesoramiento, así como sustratos específicos, los inhibidores y desacopladores de que se puede utilizar para determinar el funcionamiento de las mitocondrias en sitios específicos de la cadena de transporte electrónico se proporcionan. Es importante destacar que el protocolo descrito puede aplicarse fácilmente en el tejido cardíaco y esquelético de varios modelos animales y muestras humanas.

Saponina permeabilized preparación de la fibra junto con el análisis de la fosforilación oxidativa respirométrica proporciona una evaluación integradora de la función mitocondrial. Respiración mitocondrial en los estados fisiológicos y patológicos pueden reflejar diferentes influencias regulatorias, incluidas las interacciones mitocondrial, la morfología y la bioquímica.

Evaluación de respirometría la fosforilación oxidativa en saponina-permeabilized fibras cardíacas

La investigación de la función mitocondrial representa un parámetro importante de la fisiología cardíaca, ya que las mitocondrias intervienen en el metabolismo energético, ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar fibras cardíacas permeabilizadas con Saponina para mediciones polagráficas. Esto se logra primero mediante la extirpación del corazón del ratón. El segundo paso del procedimiento consiste en preparar mecánicamente haces de fibras cardíacas que contengan un máximo de seis a ocho fibras conectadas de forma laxa.A continuación, los haces cardíacos se permeabilizan químicamente con esaponina. Luego, los haces cardíacos se lavan para eliminar toda la esaponina y cualquier metabolito residual. Finalmente, se pueden obtener resultados que proporcionan información sobre la fosforilación oxidativa mitocondrial mediante mediciones polarográficas.Hola, soy Curtis Huey del laboratorio de la doctora Jane Sheer en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Calgary. Hoy les mostraremos un procedimiento para preparar fibras cardíacas permeabilizadas con saponina. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para evaluar la fosforilación oxidativa mitocondrial in situ.Así que comencemos. Para iniciar este procedimiento, retire un corazón marino y colóquelo en una placa de Petri que contenga la solución RP sobre hielo. Utilizando un microscopio de disección, retire cuidadosamente cualquier tejido conectivo y grasa.Corte el corazón por la mitad a lo largo del tabique y extraiga de 10 a 25 miligramos, en peso húmedo, de tejido mediante cortes realizados desde la superficie del endocardio del ventrículo izquierdo. Asegúrese de que la incisión siga la orientación de las fibras para minimizar el daño mecánico al miocardio. Coloque la muestra subdividida en un plato de Petri separado que contenga la solución RP sobre hielo.Corte el corazón en tiras longitudinales siguiendo la orientación de las fibras, con un diámetro de uno a 1,5 milímetros. Acorte las tiras con un escalpelo a una longitud entre dos y cuatro milímetros, teniendo extrema precaución y utilizando pinzas finas y afiladas. Separe mecánicamente los haces de fibras.Los haces de fibras finales deben contener un máximo de seis a ocho fibras conectadas por pequeñas áreas de contacto y con un peso entre uno y tres miligramos de peso húmedo. Visualmente, el tejido cardíaco debe cambiar del color rojo original a un tono rosa pálido. Comience la preparación de los haces de fibras cardíacas colocando una placa de 12 pocillos sobre hielo.Lave los pocillos con solución RP para minimizar la contaminación por calcio. Añada tres mililitros de solución RP fría con hielo que contenga 50 microgramos por mililitro de esaponina a uno de los pocillos. A continuación, transfiera los haces de fibras preparados mecánicamente al pocillo.Incube los haces de fibras durante 20 minutos con agitación suave sobre hielo. Enjuague un nuevo pocillo con la solución mirror five; pipete 10 mililitros de mirror five frío al hielo en el nuevo pocillo. Transfiera los haces cardíacos al pocillo e incúbelos durante 10 minutos con agitación suave sobre hielo.Tras la incubación, repita el espejo cinco. Lave dos o tres veces con espejo cinco fresco. Transfiera los haces cardíacos a 10 mililitros de espejo cinco frío con hielo cada vez.Los pasos repetitivos de lavado tienen como objetivo asegurar la eliminación de la saponina A-T-P-A-D-P y cualquier sustrato residual de los haces de fibras inmediatamente antes del análisis respiratorio. Obtenga el peso húmedo de los haces de fibras individuales secándolos sobre una superficie absorbente con pinzas, manteniendo la fibra en contacto con la superficie durante cinco segundos o hasta que toda la humedad sea absorbida. Utilizando otra superficie absorbente, elimine el exceso de líquido de las pinzas.Arranque la escala y coloque el haz de fibras sobre una placa de plástico para la medición de masa. Transfiera el haz de fibras cardíacas a un nuevo pocillo con solución fría cercana a cinco. El haz de fibras ya está listo para la evaluación del consumo de oxígeno.Las siguientes titulaciones de validación se realizan con un gráfico de inyección de titulación en dos cámaras XI. Estos experimentos pueden realizarse como un protocolo individual o incluirse en un protocolo de titulación, dependiendo del objetivo experimental y diagnóstico de los estudios de respirometría. El ERO GRA 2K utilizado aquí puede medir la concentración de oxígeno.El dispositivo está conectado a una computadora equipada con el software DAT, lo que permite que los cambios en la concentración de oxígeno se registren como mediciones en tiempo real del consumo de oxígeno durante toda la duración del experimento. Antes de colocar las fibras cardíacas en los compartimentos del XI injerto, añada 2,1 mililitros de mirror five al alojamiento de los compartimentos, que contiene los sensores polariográficos de oxígeno o POS. Cuando los compartimentos estén cerrados, habrá dos mililitros de mirror five presentes en el compartimento del XI injerto.Permita tiempo suficiente para la saturación con aire y la equilibración del espejo cinco a 37 grados Celsius. Una vez equilibrado, coloque las muestras de fibra cardíaca en el espejo cinco contenido en las cámaras de injerto XI agitadas por poli yodo. Barras de agitación recubiertas de fluoruro.Aumente la concentración de oxígeno en las cámaras GRAT a entre 250 y 550 micromolar mediante una jeringa llena de oxígeno. Espere de cinco a 10 minutos para que la concentración de oxígeno se estabilice, utilizando una jeringa Hamilton de 10 microlitros. Añada 10 microlitros de glutamato 2 molar a la cámara para obtener una concentración final de 10 milimolar.Luego, utilice una jeringa Hamilton separada para agregar cinco microlitros de malato 800 milimolar para obtener una concentración final de dos milimolar en la cámara. Esta titulación se utiliza para determinar la respiración basal sostenida por el complejo uno. El flujo de oxígeno debe estabilizarse dentro de aproximadamente cinco minutos después de la titulación, lo que permite la determinación del consumo de oxígeno en el estado dos, que es el consumo de oxígeno.En ausencia de ADP tras dos a cinco minutos de consumo estable de oxígeno, utilice una micropipeta Hamilton de 25 microlitros para añadir 20 microlitros de ADP 500 milimolar para obtener una concentración final saturante de cinco milimolar. Esta concentración se utiliza para alcanzar una saturación mayor al 90 %, lo que permite determinar el estado máximo. Tres. La respiración mitocondrial a través del complejo I permite de dos a cinco minutos adicionales de consumo estable de oxígeno.Luego, utilice una microjeringa Hamilton de 10 microlitros para agregar cinco microlitros de citocromo C 4 milimolar para obtener una concentración final de 10 micromolar. La concentración de oxígeno en este punto se utiliza para realizar un análisis de control de calidad de la integridad de la membrana mitocondrial externa. Después de otros dos a cinco minutos de consumo estable de oxígeno, agregue un microlitro de ACIN 4 miligramos por mililitro para inhibir la sintasa de ATP.Este paso de titulación se utiliza para validar la integridad de la membrana mitocondrial interna. Después de la evaluación del oxphos mediante el método repi métrico, retire la muestra para la determinación del peso seco o de un marcador mitocondrial. A continuación, retire el espejo cinco de las cámaras de vidrio del XI Grat.Lave las cámaras al menos tres veces con agua destilada. Posteriormente, lave las cámaras al menos tres veces más con etanol al 100%. Para eliminar inhibidores solubles en etanol, como la oligomicina.A continuación, realice dos lavados adicionales con etanol al 70%. Luego, agregue etanol al 70% y deje que remoje las cámaras de injerto XI durante 30 minutos para esterilizarlas. Finalmente, lave las cámaras que contienen el POS al menos cinco veces con agua doblemente destilada. El consumo de oxígeno en fibras cardíacas adecuadamente preparadas se evalúa mediante el protocolo de control de calidad, tal como se muestra; la relación de control respiratorio, o RCR, representa el acoplamiento entre el consumo de oxígeno y la fosforilación oxidativa en preparaciones de fibras permeabilizadas.La RCR es la tasa de respiración en el estado tres en relación con el estado dos, o alternativamente, el estado tres sobre el estado cuatro; preparaciones cardíacas bien acopladas y permeabilizadas arrojan una RCR entre tres y seis. La titulación del citocromo C se utiliza como validación de una preparación adecuada del tejido. El citocromo C es una proteína localizada en el espacio intermembranal de la membrana interna mitocondrial.Cuando la membrana externa de las mitocondrias está intacta, el citocromo C endógeno permanece en el espacio intermembranal y la titulación de citocromo C exógeno tiene un efecto despreciable sobre la respiración. Por el contrario, si la membrana externa de las mitocondrias está dañada, el citocromo C endógeno puede liberarse del espacio intermembranal e inhibirá la respiración hasta la adición de citocromo C exógeno, lo que permite evaluar la influencia de factores patológicos o estrés experimentales sobre la integridad de la membrana externa mitocondrial. La adición de CIN se utiliza para evaluar alteraciones en la respiración de fuga, que es el consumo de oxígeno que no contribuye a la fosforilación. Las fibras con control de fosforilación o de tipo salvaje deberían ser sensibles a la adición de CIN y experimentar una reducción significativa en el flujo de oxígeno.Un RCR bajo y una sensibilidad reducida a la oligomicina, lo que resulta en un flujo de oxígeno relativamente elevado, indica daño en la membrana mitocondrial interna durante la preparación. La falta de respuesta a las titulaciones de inhibición por sustrato, inhibidores y desacopladores, como se observa aquí, podría indicar períodos prolongados de incubación de los haces de fibras desprovistas y sasin en soluciones RP y mirror five. Los esfuerzos posteriores deben minimizar los períodos entre el sacrificio del animal y las mediciones del consumo de oxígeno.Acabamos de mostrarle cómo preparar haces de fibras cardíacas para mediciones poligráficas. Es importante recordar que al realizar este procedimiento debe tenerse extremo cuidado durante la separación mecánica de las fibras cardíacas. Eso es todo.Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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El siguiente protocolo describe la preparación y utilización de tampones para la medición cuantitativa de las tasas de oxidación de glucosa y ácidos grasos en el corazón de rata en funcionamiento aislado. También se discuten los métodos utilizados para el análisis de muestras y la interpretación de datos.

Los métodos para la determinación de las tasas de glucosa y la oxidación de ácidos grasos en el corazón de rata aislado de Trabajo

Este trabajo demuestra la viabilidad de una técnica de espectroscopia de resonancia magnética de fósforo-31 (31PMRS) in vivo para cuantificar la capacidad de fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS) en el músculo esquelético humano.

El fósforo-31 espectroscopía de resonancia magnética: una herramienta para medir En Vivo Capacidad de la fosforilación oxidativa mitocondrial en el músculo esquelético humano

De alta resolución de respirometría se utiliza para determinar el consumo de oxígeno mitocondrial. Se trata de una técnica sencilla para determinar los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial '(I-IV) la frecuencia respiratoria, la capacidad del sistema de transporte de electrones mitocondrial máxima, y ​​la integridad de la membrana mitocondrial externa.

-Alta resolución respirometría para evaluar la función mitocondrial en células intactas y permeabilizadas

Este protocolo describe calorespirometry, la medición directa y simultánea de disipación de calor y la respiración, lo que proporciona un enfoque no invasivo para evaluar el metabolismo energético. Esta técnica se utiliza para evaluar la contribución de las vías aeróbicas y anaeróbicas para utilización de la energía mediante el control del flujo total de energía celular.

Calorespirometry: Es un enfoque potente y no invasivo para investigar el metabolismo energético celular

Aquí introducimos un método para utilizar un catéter óptico intra-ventrículo en corazones perfundidos para realizar espectroscopia de absorbancia a través de la pared del corazón. Los datos obtenidos proporcionan información sólida sobre la tensión de oxígeno tisular, así como la utilización del sustrato y el potencial de la membrana simultáneamente con medidas de rendimiento cardíaco en esta preparación omnipresente.

Catéter de luz intracardiaca para monitorear el metabolismo celular utilizando espectroscopia de absorbancia transmural de corazones de mamíferos perfundidos

La evaluación de la fosforilación oxidativa utilizando respirómetros de alta resolución se ha convertido en una parte integral del análisis funcional de las mitocondrias y el metabolismo energético celular. Aquí, presentamos protocolos para el análisis del metabolismo energético celular utilizando respirómetros de alta resolución basados en cámaras y microplacas y discutimos los beneficios clave de cada dispositivo.

Respirometría de alta resolución para evaluar la bioenergética en células y tejidos utilizando respirómetros basados en cámaras y placas

La respirometría de alta resolución acoplada a sensores de fluorescencia determina el consumo de oxígeno mitocondrial y la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). El presente protocolo describe una técnica para evaluar la frecuencia respiratoria mitocondrial y la producción de ROS en el nervio ciático permeabilizado.

Evaluación de la función mitocondrial en el nervio ciático mediante respirometría de alta resolución

Los caballos tienen una capacidad excepcional de ejercicio aeróbico, lo que hace que el músculo esquelético equino sea un tejido importante tanto para el estudio de la fisiología del ejercicio equino como para la fisiología mitocondrial de los mamíferos. Este artículo describe técnicas para la evaluación integral de la función mitocondrial en el músculo esquelético equino.

Fluoro-respirometría de alta resolución del músculo esquelético equino

El análisis de la función mitocondrial de los espermatozoides mediante respirometría de alta resolución permite medir el consumo de oxígeno de los espermatozoides que se mueven libremente en un sistema de cámara cerrada. La técnica se puede aplicar para medir la respiración en los espermatozoides humanos, lo que proporciona información sobre las características mitocondriales y la integridad de los espermatozoides.

Respirometría de alta resolución para evaluar la función mitocondrial en espermatozoides humanos

Aquí, describimos un método integral para medir la fosforilación oxidativa mitocondrial en fibras de músculo esquelético permeabilizadas frescas a partir de músculo humano o de ratón. Este método permite la cuantificación en tiempo real de la respiración mitocondrial y la evaluación de la preferencia de combustible y la flexibilidad metabólica, al tiempo que preserva las redes mitocondriales existentes y la integridad de la membrana.

Medición de la respiración mitocondrial en fibras musculares esqueléticas humanas y de ratón mediante respirometría de alta resolución

En este artículo, describimos un protocolo detallado para cuantificar la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de acidificación extracelular de los ventrículos de pez cebra adultos ex vivo, con el fin de caracterizar su capacidad metabólica oxidativa y glicolítica.

Evaluación de la actividad metabólica de ventrículos de pez cebra regenerador ex vivo mediante un ensayo de flujo extracelular

Aprende a evaluar la fosforilación oxidativa mitocondrial en fibras cardíacas permeabilizadas con saponina mediante respirometría de alta resolución. Este protocolo permite medir con precisión la función mitocondrial in situ en tejido cardíaco de roedor.

Evaluación de respirometría la fosforilación oxidativa en saponina-permeabilized fibras cardíacas

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