Name: Evaluación de respirometría la fosforilación oxidativa en saponina-permeabilized fibras cardíacas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-28T18:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Aprende a evaluar la fosforilación oxidativa mitocondrial en fibras cardíacas permeabilizadas con saponina mediante respirometría de alta resolución. Este protocolo permite medir con precisión la función mitocondrial in situ en tejido cardíaco de roedor.

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Este estudio fue financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud y Canadá Genoma. JS tiene premios salario apoyo de la Fundación del Patrimonio de Alberta para la Investigación Médica, Heart and Stroke Foundation de Canadá y la Asociación Canadiense de Diabetes. El laboratorio desea agradecer la asistencia técnica de los instrumentos de Oroboros durante la adquisición de la técnica de fibra de saponina-permeabilizadas.

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</ol>

La técnica de saponina-permeabilized fibras cardiacas ofrece un compromiso único entre in vitro e in vivo en la evaluación del consumo de oxígeno mitocondrial OXPHOS. Ventajas de esta técnica incluyen el aumento de relevancia fisiológica en comparación con las mitocondrias aisladas como la arquitectura celular se conserva. Mientras que la membrana plasmática se degrada, las estructuras intracelulares de membrana como la mitocondria 12, 14, 14 del retículo sarcoplásmico, miofilamentos y el ci...

<table><tbody><tr><td>Etanol al 100 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC600</td><td></td></tr><tr><td>Etanol al 70%</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC-1000</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&amp;#8242;sal monopotásica de difosfato dihidratada (ADP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina de suero bovino esencialmente libre de ácidos grasos&amp;#8211;gratuito</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-6003</td><td></td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&amp;#8242;-clorhidrato de 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Atractilosido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6882</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>Carbonyl cianuro p-(trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Citocromo c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Etanolamina-bis-(2-amino&amp;#8211;éter tilo)-N,N,N&amp;#8242;,&amp;#8242;ácido tetraacético (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Ácido glutámico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27647</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td></td><td>Ketaset</td></tr><tr><td>Ácido lactobiónico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>153516</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8729;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Ácido málico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,&amp;rsquo;Clorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (TMPD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3134</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>Fosfocreatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Cianuro de potasio</td><td>Fluka</td><td>60178</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato monobásico de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sódico</td><td>Ceva Sante Animale</td><td>1715 138</td><td>Conc. 54,7 mg/ml</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Ácido succínico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Bayer AG</td><td></td><td>Rompun</td></tr><tr><td>ddH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hielo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oroboros Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR international</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Tubos centrífugos de polipropileno de 15 ml</td><td>VWR international</td><td>89004-368</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de centrífuga de 50 ml de polipropileno</td><td>VWR international</td><td>89004-364</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas rectas para joyeros</td><td>George Tiemann &amp;y Cía.</td><td>160-50B</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de joyero curvas</td><td>George Tiemann &amp;y Cía.</td><td>160-57B</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas rectas</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-402</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de bisturí estéril</td><td>VWR international</td><td>BD371610</td><td></td></tr><tr><td>0.45-&amp;mu;m Filtros para jeringa</td><td>VWR international</td><td>CA28145-485</td><td></td></tr><tr><td>medidor de pH</td><td>VWR international</td><td>CA11388-308</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de vidrio</td><td>VWR international</td><td>89000-300</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular de poliestireno de 12 pocillos</td><td>VWR international</td><td>82050-926</td><td></td></tr><tr><td>Placa agitadora</td><td>VWR international</td><td>97042-594</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Microbars</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-511-67</td><td></td></tr><tr><td>Báscula</td><td>VWR international</td><td>CA11278-162</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;mu;l Hamilton Microjeringa</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-815-1</td><td></td></tr><tr><td>25&amp;mu;l Hamilton Microjeringa</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-7</td><td></td></tr><tr><td>50&amp;mu;jeringa microscópica l Hamilton</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-5</td><td></td></tr><tr><td>Botellas exprimibles Nalgene</td><td>Wilkem Scientific</td><td>LNA2407-1000</td><td></td></tr><tr><td>Platos pesadores de poliestireno</td><td>VWR international</td><td>89106-750</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de respirometría la fosforilación oxidativa en saponina-permeabilized fibras cardíacas

Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

Investigación de la función mitocondrial representa un parámetro importante de la fisiología cardiaca como las mitocondrias están implicadas en el metabolismo energético, el estrés oxidativo, la apoptosis, el envejecimiento, encefalomiopatías mitocondrial y la toxicidad del fármaco. Teniendo en cuenta esto, las tecnologías para medir la función mitocondrial cardiaco están en demanda. Una técnica que emplea un enfoque integral para medir la función mitocondrial es respirométrica fosforilación oxidativa (OXPHOS) análisis. El principio de la evaluación de la fosforilación oxidativa respirometría se centra en medir la concentración de oxígeno que utiliza un electrodo de Clark. A medida que el haz de fibras permeabilized consume el oxígeno, la concentración de oxígeno en la disminución de cámara cerrada. Utilizando sustrato seleccionado desacoplador inhibidor de los protocolos de valoración, los electrones se proporcionan a sitios específicos de la cadena de transporte de electrones, lo que permite la evaluación de la función mitocondrial. Técnicas de preparación antes del análisis de respirometría de la función mitocondrial, mecánicos y químicos se utilizan para permeabilizar el sarcolema de las fibras musculares. Permeabilización química emplea saponina para perforar de forma selectiva la membrana celular, manteniendo la arquitectura celular. Este documento describe minuciosamente los pasos a seguir en la preparación de saponina de piel fibras cardiacas para medir el consumo de oxígeno para evaluar la fosforilación oxidativa mitocondrial. Además, la solución de problemas asesoramiento, así como sustratos específicos, los inhibidores y desacopladores de que se puede utilizar para determinar el funcionamiento de las mitocondrias en sitios específicos de la cadena de transporte electrónico se proporcionan. Es importante destacar que el protocolo descrito puede aplicarse fácilmente en el tejido cardíaco y esquelético de varios modelos animales y muestras humanas.

Saponina permeabilized preparación de la fibra junto con el análisis de la fosforilación oxidativa respirométrica proporciona una evaluación integradora de la función mitocondrial. Respiración mitocondrial en los estados fisiológicos y patológicos pueden reflejar diferentes influencias regulatorias, incluidas las interacciones mitocondrial, la morfología y la bioquímica.

Evaluación de respirometría la fosforilación oxidativa en saponina-permeabilized fibras cardíacas

La investigación de la función mitocondrial representa un parámetro importante de la fisiología cardíaca, ya que las mitocondrias intervienen en el metabolismo energético, ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar fibras cardíacas permeabilizadas con Saponina para mediciones polagráficas. Esto se logra primero mediante la extirpación del corazón del ratón. El segundo paso del procedimiento consiste en preparar mecánicamente haces de fibras cardíacas que contengan un máximo de seis a ocho fibras conectadas de forma laxa.A continuación, los haces cardíacos se permeabilizan químicamente con esaponina. Luego, los haces cardíacos se lavan para eliminar toda la esaponina y cualquier metabolito residual. Finalmente, se pueden obtener resultados que proporcionan información sobre la fosforilación oxidativa mitocondrial mediante mediciones polarográficas.Hola, soy Curtis Huey del laboratorio de la doctora Jane Sheer en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Calgary. Hoy les mostraremos un procedimiento para preparar fibras cardíacas permeabilizadas con saponina. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para evaluar la fosforilación oxidativa mitocondrial in situ.Así que comencemos. Para iniciar este procedimiento, retire un corazón marino y colóquelo en una placa de Petri que contenga la solución RP sob

respirometric-oxidative-phosphorylation-assessment-saponin

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Investigación

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Biología

Se describen los métodos de biopsia de músculo vasto lateral, la preparación de las mitocondrias purificada, y perfilado respirométrico. El uso de volumen muscular pequeña hace que esta técnica adecuada para aplicaciones de investigación clínica.

Evaluación de Preparación y respirometría de mitocondrias aisladas de tejido músculo esquelético Obtenidos percutánea Biopsia con aguja

Los métodos presentados proporcionan instrucciones paso a paso para la realización de una colección de ensayos respirométricos basados en microplacas utilizando mitocondrias aisladas de cantidades mínimas de músculo esquelético de ratón. Estos ensayos son capaces de medir los cambios/adaptaciones mecanicistas en el consumo de oxígeno mitocondrial en un modelo animal comúnmente utilizado.

Uso de mitocondrias aisladas a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para alta microplacas rendimiento Mediciones respiratorias

El siguiente protocolo describe la preparación y utilización de tampones para la medición cuantitativa de las tasas de oxidación de glucosa y ácidos grasos en el corazón de rata en funcionamiento aislado. También se discuten los métodos utilizados para el análisis de muestras y la interpretación de datos.

Los métodos para la determinación de las tasas de glucosa y la oxidación de ácidos grasos en el corazón de rata aislado de Trabajo

De alta resolución de respirometría se utiliza para determinar el consumo de oxígeno mitocondrial. Se trata de una técnica sencilla para determinar los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial '(I-IV) la frecuencia respiratoria, la capacidad del sistema de transporte de electrones mitocondrial máxima, y ​​la integridad de la membrana mitocondrial externa.

-Alta resolución respirometría para evaluar la función mitocondrial en células intactas y permeabilizadas

Este protocolo describe calorespirometry, la medición directa y simultánea de disipación de calor y la respiración, lo que proporciona un enfoque no invasivo para evaluar el metabolismo energético. Esta técnica se utiliza para evaluar la contribución de las vías aeróbicas y anaeróbicas para utilización de la energía mediante el control del flujo total de energía celular.

Calorespirometry: Es un enfoque potente y no invasivo para investigar el metabolismo energético celular

La evaluación de la fosforilación oxidativa utilizando respirómetros de alta resolución se ha convertido en una parte integral del análisis funcional de las mitocondrias y el metabolismo energético celular. Aquí, presentamos protocolos para el análisis del metabolismo energético celular utilizando respirómetros de alta resolución basados en cámaras y microplacas y discutimos los beneficios clave de cada dispositivo.

Respirometría de alta resolución para evaluar la bioenergética en células y tejidos utilizando respirómetros basados en cámaras y placas

Aquí, describimos un método detallado para el aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón y el posterior análisis de la respiración por tasa de consumo de oxígeno (OCR) utilizando ensayos respirométricos basados en microplacas. Esta tubería se puede aplicar para estudiar los efectos de múltiples intervenciones ambientales o genéticas en el metabolismo mitocondrial.

Aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón para ensayos respirométricos

La respirometría de alta resolución acoplada a sensores de fluorescencia determina el consumo de oxígeno mitocondrial y la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). El presente protocolo describe una técnica para evaluar la frecuencia respiratoria mitocondrial y la producción de ROS en el nervio ciático permeabilizado.

Evaluación de la función mitocondrial en el nervio ciático mediante respirometría de alta resolución

Los caballos tienen una capacidad excepcional de ejercicio aeróbico, lo que hace que el músculo esquelético equino sea un tejido importante tanto para el estudio de la fisiología del ejercicio equino como para la fisiología mitocondrial de los mamíferos. Este artículo describe técnicas para la evaluación integral de la función mitocondrial en el músculo esquelético equino.

Fluoro-respirometría de alta resolución del músculo esquelético equino

El análisis de la función mitocondrial de los espermatozoides mediante respirometría de alta resolución permite medir el consumo de oxígeno de los espermatozoides que se mueven libremente en un sistema de cámara cerrada. La técnica se puede aplicar para medir la respiración en los espermatozoides humanos, lo que proporciona información sobre las características mitocondriales y la integridad de los espermatozoides.

Respirometría de alta resolución para evaluar la función mitocondrial en espermatozoides humanos

Aquí, describimos un método integral para medir la fosforilación oxidativa mitocondrial en fibras de músculo esquelético permeabilizadas frescas a partir de músculo humano o de ratón. Este método permite la cuantificación en tiempo real de la respiración mitocondrial y la evaluación de la preferencia de combustible y la flexibilidad metabólica, al tiempo que preserva las redes mitocondriales existentes y la integridad de la membrana.

Medición de la respiración mitocondrial en fibras musculares esqueléticas humanas y de ratón mediante respirometría de alta resolución

Aprende a evaluar la fosforilación oxidativa mitocondrial en fibras cardíacas permeabilizadas con saponina mediante respirometría de alta resolución. Este protocolo permite medir con precisión la función mitocondrial in situ en tejido cardíaco de roedor.

Evaluación de respirometría la fosforilación oxidativa en saponina-permeabilized fibras cardíacas

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