Plato de microtitulación de formación de biopelículas de ensayo
30 de enero de 2011
El ensayo describe un método rápido para medir la formación de biopelículas a principios de bacterias y hongos. Este método utiliza una placa de microtitulación como sustrato para la formación de biopelículas microbianas, y el biofilm se visualiza utilizando la cepa de cristal violeta. El ensayo ofrece ya sea un ensayo cualitativo o cuantitativo de la formación de biofilm temprano.
El objetivo general de este procedimiento es establecer y estudiar biopelículas en una placa de microtitulación. Esto se logra primero agregando cultivo bacteriano a una placa de 96 pocillos. A continuación, el cultivo se incuba a la temperatura y tiempo adecuados, dependiendo del microbio, para teñir la biopelícula.
Se añade violeta de cristal a cada pocillo con bacterias, y luego se lavan las bacterias. Finalmente, se fotografían los pocillos y se cuantifican las bacterias. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la acumulación y formación de biopelículas a lo largo del tiempo mediante la medición del violeta de cristal.
La principal ventaja de este método es que permite a los investigadores evaluar rápidamente la formación de biopelículas en organismos bacterianos y fúngicos. También puede configurarse para realizar cribados genéticos de alto rendimiento o para identificar compuestos terapéuticos novedosos que inhiban la formación de biopelículas. Prepare un cultivo nocturno de cinco mililitros de la cepa silvestre de Pseudomonas, Aerogen o de una cepa mutante.
En medio LB, diluya 10 microlitros de cultivo en un mililitro de medio mínimo M 63 fresco, suplementado con magnesio, sulfato, glucosa y ácidos cassino. A continuación, usando una pipeta, transfiera 100 microlitros del cultivo diluido a pozos separados de una placa redonda de fondo de 96 pozos. Incube la placa a 37 grados Celsius durante cuatro a 24 horas para permitir el crecimiento de biopelículas.
Una vez que se hayan formado los biofilms, retire la placa del incubador y deseche los sobrenadantes del cultivo invirtiendo la placa y agitando para eliminar el líquido. Luego sumerja suavemente la placa en un recipiente pequeño con agua para eliminar cualquier célula no unida o componentes del medio que puedan causar tinción de fondo. Agite para eliminar el agua, seque la placa con un paño absorbente y repita el lavado.
Una vez que la placa esté limpia, agregue 125 microlitros por pocillo una solución de violeta de cristal al 0,1 %. Para teñir las células, incube la placa a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos.
Luego, lave la placa tres o cuatro veces como se demostró anteriormente. Secue vigorosamente la placa sobre una pila de toallas de papel para eliminar el exceso de líquido después del último lavado, coloque la placa boca abajo y déjela secar en esa posición durante algunas horas. Una vez que la placa esté seca, se pueden tomar fotografías de los pocillos con una cámara digital para evaluar la calidad de los biofilms.
Como se muestra aquí, las bacterias móviles como Pseudomonas aerogen a la izquierda y Pseudomonas fluorescence a la derecha tienden a formar biopelículas en la ubicación de la interfase aire-líquido durante el crecimiento de la biopelícula. En contraste, las bacterias Staphylococcus ora, que son no móviles, forman biopelículas en el fondo de los pocillos. Con el fin de cuantificar las biopelículas, primero agregue 125 microlitros de ácido acético al 30% a cada pocillo, incluyendo un pocillo en blanco que contenga solo ácido acético, e incube la placa a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos para permitir la solubilización del violeta de cristal retenido por las biopelículas.
A continuación, transfiera 125 microlitros de tinción solubilizada desde cada pocillo a una nueva placa microtituladora de 96 pocillos con fondo plano. Mediante un lector de placas, cuantifique la absorbancia de cada pocillo a una longitud de onda de 550 nanómetros. La concentración de violeta de cristal en cada pocillo es proporcional al número de células en el biofilm.
Este gráfico muestra una cuantificación de la formación y acumulación de biopelículas por Pseudomonas fluorescence a lo largo del tiempo durante la incubación a 37 grados Celsius. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un ensayo de biopelícula en placa de 96 pocillos, utilizado junto con otros métodos como la microscopía. Este ensayo puede contribuir significativamente a nuestra comprensión de la formación de biopelículas.
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Descripción general
Este ensayo describe un método rápido para medir la formación temprana de biopelículas en bacterias y hongos utilizando una placa de microtitulación. La biopelícula se visualiza mediante tinción con violeta de cristal, lo que permite un análisis tanto cualitativo como cuantitativo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Investigación de biopelículas
- Desarrollo de ensayos
Antecedentes
- Los biofilms son comunidades de microorganismos que se adhieren a superficies.
- Estudiar la formación de biofilms es crucial para comprender el comportamiento microbiano.
- El violeta de cristal es un colorante común utilizado para visualizar biofilms.
- Este método permite una evaluación rápida del desarrollo del biofilm.
Objetivo del estudio
- Establecer un ensayo confiable para la formación temprana de biopelículas.
- Cuantificar la acumulación de biopelículas a lo largo del tiempo.
- Facilitar el estudio de las interacciones microbianas en biopelículas.
Métodos Utilizados
- Añada cultivo bacteriano a una placa de microtitulación de 96 pocillos.
- Incube el cultivo a la temperatura y tiempo adecuados.
- Añada violeta de cristal para teñir la biopelícula.
- Lave los pocillos y tome fotografías para cuantificar la formación de biopelícula.
Resultados principales
- Los resultados muestran la acumulación de biopelículas a lo largo del tiempo.
- Se pueden obtener datos cuantitativos a partir de las mediciones de violeta de cristal.
- El ensayo proporciona una visualización clara de la formación de biopelículas.
Conclusiones
- Este método es eficaz para estudiar la formación temprana de biopelículas.
- Puede aplicarse a diversas especies bacterianas y fúngicas.
- El ensayo mejora la comprensión de la dinámica microbiana de las biopelículas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El ensayo de formación de biopelículas en placa de microtitulación permite una evaluación rápida y de alto rendimiento del desarrollo temprano de biopelículas, apoyando la validación de dianas en el descubrimiento de agentes antimicrobianos. Al cuantificar la acumulación de biopelícula mediante tinción con violeta de cristal, el método proporciona datos cuantitativos reproducibles que ayudan a reducir los riesgos asociados con candidatos terapéuticos dirigidos a la adhesión microbiana y la persistencia. Este enfoque escalable es aplicable en sistemas bacterianos y fúngicos, facilitando la selección en etapas iniciales de compuestos que modulan la biopelícula.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la identificación de genes y factores necesarios para la iniciación del biofilm, como adhesinas, pili y vías de di-GMP cíclico.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de dianas mediante análisis de pérdida de función en cepas microbianas bajo condiciones estandarizadas.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al distinguir compuestos que inhiben la formación temprana de biofilms de aquellos sin efecto.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas microbianos validados para el cribado de compuestos posteriores mediante el establecimiento de métricas reproducibles de formación de biopelículas.
- Valor operativo: Aborda la estandarización del ensayo mediante pasos estandarizados de incubación, tinción y cuantificación utilizando el formato de placa de 96 pocillos.
- Escalabilidad: Destaca la preparación para cribado y la reutilización de la plataforma en cribados genéticos y bibliotecas de compuestos en múltiples cepas microbianas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia traslacional: Relaciona los datos de formación temprana de biopelículas con perfiles fenotípicos de resistencia, apoyando la reducción mecanicista de riesgos en fármacos antimicrobianos.
- Continuidad preclínica: Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la vinculación de la inhibición de biopelículas in vitro con la tolerancia a antibióticos y efectores inmunitarios.
- Alineación de biomarcadores: Facilita el desarrollo de biomarcadores traslacionales mediante salidas cuantificables que se correlacionan con fenotipos de tolerancia asociados a biopelículas.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El ensayo se integra en el continuo de descubrimiento desde la identificación del blanco hasta la optimización del fármaco inicial, particularmente para programas antiinfecciosos dirigidos a la resistencia mediada por biopelículas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis sobre las vías de adhesión microbiana y formación de biopelículas mediante perturbaciones genéticas y químicas.
- Selección: Describe la preparación del ensayo mediante la formación estandarizada de biopelículas y la cuantificación con violeta de cristal, lo que permite una evaluación confiable de compuestos.
- Análisis: Destaca mediciones cuantitativas de absorbancia a 550 nm que permiten comparar la biomasa de biopelículas entre diferentes condiciones y cepas.
- Investigación Traducional: Conecta datos iniciales de inhibición de biopelículas con relevancia preclínica mediante la modelización de mecanismos de tolerancia observados en infecciones crónicas.
- Reutilización Empresarial: Establece el método como una plataforma de selección reutilizable para programas antimicrobianos, antifúngicos y antibiopelículas en múltiples modelos de patógenos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos mediante la reducción medible de la formación de biopelículas tras intervenciones genéticas o farmacológicas.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad en formatos de 96 pocillos para aplicaciones de alto rendimiento.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción en la identificación de compuestos líderes al reducir los falsos positivos mediante la cuantificación ortogonal de biopelículas.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo de compuestos basada en la inhibición dependiente de la dosis de la formación temprana de biopelículas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia microbiológica en técnicas estériles, preparación de cultivos y manejo de biopelículas.
- Depende del acceso a lectores de placas capaces de medir absorbancia a 550 nm y placas microtituladoras estándar de 96 pocillos.
- Necesita una estandarización entre equipos de los tiempos de incubación, pasos de lavado y protocolos de tinción para minimizar la variabilidad entre pocillos.
- Implica consideraciones de adaptación al extenderse a organismos no modelo o hongos con propiedades de adhesión diferentes.
- Incluye limitaciones prácticas, como la imposibilidad de modelar la arquitectura de biopelículas maduras o fenotipos dependientes del flujo, tal como se indica en la fuente.
