Name: La detección de metaloproteinasas de la matriz funcional por Zymography (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprende a detectar metaloproteinasas de matriz funcionales mediante zimografía en geles de gelatina. Este protocolo permite cuantificar la actividad enzimática en sobrenadantes celulares y fluidos biológicos para estudios de remodelación tisular.

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Nos gustaría agradecer al Dr. S. Ressler (Departamento de Biología Molecular y Celular, Facultad de Medicina Baylor) por sugerir el uso de concentradores de proteínas para aumentar la concentración de MMP en los sobrenadantes de cultivo celular. Este proyecto fue apoyado por subvenciones del Fondo de la señora Clifford pastor White Investigación Graham Dotado y el NIH / NIAMS (AR059838) al CB. El contenido es responsabilidad exclusiva de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los NIH.

1. Cargar y ejecutar el Gel <ol><li> Todas las muestras deben prepararse adecuadamente para mantener la función de las enzimas y se utiliza inmediatamente después de la recolección o congelarse a -80 ° C. Las muestras no deben contener agentes reductores (por ejemplo, una β-mercaptoetanol) o ser hervida antes de cargar el gel. </li><li> Abrir la bolsa que contiene un gel interior de un cassette, el cassette de enjuague con agua destilada. <ul><li> Quitar la cinta protectora de la parte inferior de la cinta y el peine de la parte superior del gel. </li><li> Lave los pocillos tres veces con tampón de (diluida a 1X en agua destilada). </li><li> Colocar el gel en la Mini-célula, asegurando que el lado más pequeño de la cinta se enfrenta hacia el interior. Encaje en su sitio con la Cuña tensión Gel. El Mini-celular permite ejecutar uno o dos geles en paralelo. </li><li> Llene la parte superior (interior) de cámara con 1X tampón de pozos por encima del nivel, comprobar que no existen fugas. En caso de fugas, quitar el tampón y la posición del gel. </li><li> Llenar la cámara baja con amortiguador 1X en funcionamiento. </li></ul></li><li> Carga de 10 l de marcador molecular de la proteína en un pozo. <ul><li> Mezcle una cantidad igual de buffer de gel de carga y de la muestra y la carga en los pocillos del gel con carga de gel-tips (cambia entre cada muestra). Estos pozos se puede cargar con hasta 20 l totales. </li></ul></li><li> Coloque la tapa de la célula de Mini y conectar los cables de los electrodos a la fuente de alimentación. Interruptor de la fuente de alimentación y lo puso a correr a 125 V constantes durante 90 minutos. Compruebe la formación de pequeñas burbujas en el cable de la cámara baja, lo que indica la circulación actual. </li><li> Cuando se ejecuta el primer gel, monitorear el progreso de la migración cada 15 minutos, utilizando el azul de bromofenol incluido en el tampón de carga como un indicador. Deje correr el gel hasta que el colorante indicador alcanza el fondo del gel. </li></ol> 2. Renaturalización y desarrollo del Gel <ol><li> Para cada gel, preparar 100 ml de 1X buffer de renaturalización y 200 ml de tampón de desnaturalización, tanto en agua destilada. </li><li> Cuando el colorante azul de bromofenol seguimiento llega a la parte inferior del gel, cambiar la fuente de alimentación, abra la celda Mini-, y quitar el gel. Separar los dos lados de la cinta con el cuchillo en gel (o una espátula de pesaje). Corte una esquina para marcar la dirección del gel. </li><li> Retire con cuidado el gel de la bandeja y coloque en un envase de 100 ml de tampón de renaturalización. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. </li><li> Eliminar el buffer de renaturalización y añadir 100 ml de buffer en el desarrollo de gel. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. </li><li> Quitar el tampón en desarrollo y añadir 100 ml de solución tampón más desarrollo para el gel. Incubar toda la noche (16-18 horas) a 37 ° C. </li><li> Quitar el tampón en desarrollo y enjuáguese la boca tres veces (5 minutos cada uno) con agua destilada bajo agitación suave a temperatura ambiente. </li><li> Escanear el gel para guardar la posición exacta de las bandas de proteínas estándar, ya que serán menos visibles o no después de la tinción del gel. </li><li> Tinción del gel mediante la adición de 20 ml de SimplyBlue Safestain al gel. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente bajo agitación suave. </li><li> Retire la SafeStain SimplyBlue y de la mancha de gel de 100 ml o más agua desionizada durante una hora a temperatura ambiente bajo agitación suave. </li><li> Para obtener mejores resultados, reemplace con agua fresca desionizada y se incuba durante una hora o más a temperatura ambiente bajo agitación suave. </li></ol> 3. Análisis de Datos <ol><li> Retire con cuidado el gel del agua y colóquelo en un protector de plástico. </li><li> Escanear el gel con una resolución de 300 ppp o más. Guardar la imagen en formato TIFF (Figura 1). </li><li> Medir intensidades de las bandas con ImageJ (u otro software similar). <ul><li> Abra el archivo TIFF en ImageJ (Figura 1). </li><li> Visualizar en blanco y negro seleccionando la opción "Imagen&gt;&gt; Tipo de 8 bits" (fig. 1B). </li><li> Use la herramienta de selección rectangular para delinear la primera banda, dibujando un rectángulo al menos dos veces más alta que ancha (esto es un requisito de software). </li><li> Presione "1" o seleccione "Analizar&gt; Geles&gt; Elige primero el carril" y la banda se indica. </li><li> Un rectángulo de nuevo aparecen, se mueven a la banda y seleccionar "Análisis&gt; Geles&gt; Seleccione carril que viene". Repita hasta que todas las bandas son seleccionados (fig. 1B). </li><li> Presione "3" o seleccione "Analizar&gt; Geles&gt; carriles Plot" para generar el gráfico de perfil para cada banda (fig. 1C). </li><li> Utilice la selección de línea recta (ya debe estar seleccionado automáticamente) para dibujar las líneas de base, de modo que el pico de interés es un área completamente cerrada. </li><li> Seleccione la herramienta varita mágica y haga clic en el interior de cada pico para seleccionarlo. </li><li> Seleccione "Analizar&gt; Geles&gt; picos Label" para obtener una tabla con el área de cada pico seleccionado. Estos datos se pueden representar como tales (Figura 1D) o puede ser normalizada con el valor de una banda elegida. Esta normalización es especialmente importante cuando se agruparon los valores de varios geles replicar para determinar la significación estadística de los resultados. </li></ul></li></ol> 4. Resultados representante Se muestra un gel con 11 pozos cargados con diferentes sobrenadantes de cultivo de células que contienen diferentes cantidades de MMP-2 (Figura 1). La observación directa de este gel muestran diferencias obvias en las concentraciones de MMP-2 entre algunos de los pozos. Por ejemplo, está claro que los pozos 4 y 5 contienen mucho más que la MMP-2 y # 11, o bien hasta 10 #. Para la cuantificación objetiva de las bandas que han utilizado la densitometría con el software ImageJ (Figura 1B-D), lo que confirma una diferencia de aproximadamente 4 veces en la MMP-2 entre las cantidades y # 11 y los pozos 4 y 5 y una diferencia de aproximadamente 2 veces en MMP-2 entre las cantidades y # 10 y # pozos 4 y 5. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Detección de MMP-2 por zymography gelatina. Una imagen, escaneada de un gel de gelatina. Números también se indican en la parte superior del gel. B, gel Igual que en una muestra en blanco y negro de la densitometría. Cada grupo fue seleccionado con un rectángulo en ImageJ. C, dos ejemplos de los perfiles de la densitometría para el gel mostrado en A y B (bandas # 4 y # 11). Una línea recta que se elaboró ​​en la base de cada pico para crear un área cerrada. D, Parcela de las áreas de pico para el gel mostrado en A y B antes (izquierda) y después (derecha) la normalización de la densidad de la banda # 1. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Esta cifra demuestra cómo zymography se puede utilizar como una técnica semi-cuantitativo. Hemos cargado diluciones seriadas (pasos de 1:01 diluciones) en 7 pozos consecutivos y se mide la densidad de banda para los pro-MMP-2 y MMP-2.

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Hemos demostrado cómo realizar el análisis zimográfico de MMP-2 en el sobrenadante de cultivo celular. La cantidad de muestra a la carga en un gel debe ser determinada empíricamente en función del origen y MMP de interés. Carga demasiado poco evitar su detección durante la carga en exceso puede conducir a la saturación, ya que es único sustrato tanto una proteasa pueden digerir en el área de la banda. Si es necesario, la muestra se puede diluir en agua desionizada antes de mezclarse con tampón de carga o el tiempo de desarrollo puede reducirse de la noche a 4 horas. También es posible concentrar las proteínas de una solución a base de concentradores (por ejemplo, catálogo Millipore # UFC803024). Si las bandas siguen siendo apenas visible, puede ser necesario el desarrollo de los geles durante un largo periodo de tiempo, incluso hasta 48 horas. En la preparación de las muestras de los sobrenadantes de cultivo de tejidos, cabe señalar que el suero fetal bovino (y otros sueros) contiene MMPs que pueden afectar los resultados. Por esta razón, recogemos todas nuestras sobrenadantes después de la cultura en el medio libre de suero. Los lavados se describe en los párrafos 2.9 y 2.10 del protocolo es necesario para eliminar el fondo de tinción de las bandas de digerir. Veces más tiempo de lavado se eliminan más de fondo, pero se atenúa también la coloración del sustrato a través del gel. Si ya los tiempos de lavado son necesarias, se recomienda escanear el gel a cada rato para seleccionar el escaneo con el mejor contraste. Esta técnica puede utilizarse para detectar otras MMP. Por ejemplo, la MMP-9 puede ser detectada en geles de gelatina, y también en menor medida MMP-1, MMP-8 y MMP-13 como la gelatina no es el sustrato preferido. MMP-1 y MMP-13 se detecta más fácilmente en zimografía colágeno, mientras que la caseína es el sustrato preferido para la MMP-11 y también permite la detección de MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-12, y MMP-13 9. MMP-7 (matrilisina) y colagenasas (MMP-1 y MMP-13) son difíciles de detectar cuando están presentes en bajas concentraciones en caseína o geles de gelatina. Además de la heparina a la muestra en el momento de carga de gel mejora significativamente el límite de detección de MMP-7. De MMP-1 y MMP-13, la heparina se debe agregar el gel después de la electroforesis ya está en marcha 12. Dado que las medidas de zymography actividad enzimática después de la desnaturalización y renaturalización de las enzimas, se medirá la actividad de todas las MMPs presente en la muestra. Esto incluye las enzimas, las enzimas pro-, y enzimas ligadas a los inhibidores endógenos (por ejemplo, TIMP-2). Sin embargo, es posible determinar el nivel de activación de MMP en la muestra mediante la comparación de la densidad de banda de la enzima activa y de la de la pro-enzima, que tendrá un peso molecular ligeramente superior. Zymography a menudo no es suficiente para identificar un MMP. Comparación del nivel de migración de un sistema de RPP con estándares de peso molecular conocido le ayuda en la identificación, pero hay que señalar que algunas de estas normas contienen un agente reductor y que cuando se usa bajo condiciones no reductoras pueden indicar diferentes pesos moleculares 9. Una opción es cargar una MMP recombinante soluble en el mismo gel, como las muestras de prueba. MMPs sin embargo puede estar asociada con otras proteínas, induciendo un cambio en el peso molecular aparente. Los inhibidores selectivos de MMP se pueden añadir al gel (o parte de un recorte en gel por la mitad) durante la incubación en buffer de desarrollo como herramientas farmacológicas para la identidad de la MMP de la técnica interest.A segundo (Western Blot, inmunocitoquímica, o ELISA) se recomienda ayudar en la identificación de la MMP de interés. Cabe señalar que los límites de detección por Western Blot son a menudo mucho más bajos que los de los geles de zimográfico, que puede conducir a resultados falsos negativos cuando se utiliza esta técnica.

<table><tbody><tr><td>Aparato de electroforesis Xcell SureLock Mini-Cell con marca CE</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación (modelo 302)</td><td>VWR international</td><td>93000-744</td><td></td></tr><tr><td>Geles zimográficos de gelatina Novex al 10%, 1,0 mm, 12 pocillos</td><td>Invitrogen</td><td>EC61752BOX</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de carga para geles Blue Juice</td><td>Invitrogen</td><td>10816015</td><td></td></tr><tr><td>Puntas para carga de geles</td><td>VWR international</td><td>53509-015</td><td></td></tr><tr><td>Estandar de peso molecular de proteínas</td><td>Invitrogen</td><td>LC5800</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de corrida Novex Tris-Glicina-SDS</td><td>Invitrogen</td><td>LC2675</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de renaturalización zimográfico Novex</td><td>Invitrogen</td><td>LC2670</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de revelado zimográfico Novex</td><td>Invitrogen</td><td>LC2671</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Escaner Epson Perfection 4490 Photo</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij/</td><td>n/a</td><td>Escrito por W. Rasband, NIH/NIMH</td></tr></tbody></table>

la detección de metaloproteinasas de la matriz funcional por zymography

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Metaloproteinasas de matriz (MMP) son endopeptidasas que contienen zinc. Se degradan las proteínas de la escisión de los enlaces peptídicos. Más de una veintena de MMPs han sido identificados y se dividen en seis grupos según su estructura y especificidad de sustrato (colagenasas, gelatinasas, tipo de membrana [MT-MMP], estromelisinas, matrilysins, y otros). MMP juegan un papel crítico en la invasión celular, la degradación del cartílago, la remodelación de tejidos, la cicatrización de heridas, y la embriogénesis. Por lo tanto, participar en los procesos normales y en la patogénesis de muchas enfermedades, como la artritis reumatoide, cáncer o enfermedad pulmonar obstructiva crónica 1-6. Aquí, nos centraremos en la MMP-2 (gelatinasa A, colagenasa tipo IV), una MMP ampliamente expresada. Vamos a demostrar cómo detectar MMP-2 en los sobrenadantes de cultivo celular por zymography, uno de uso común, técnica simple, pero muy sensible describió por primera vez en 1980 por C. Heussen y EB 10.7 Dowdle. Esta técnica es semi-cuantitativo, por lo tanto, se puede utilizar para determinar los niveles de MMP en las muestras cuando las concentraciones conocidas de MMP recombinante se cargan en el mismo gel 11. Las soluciones que contienen MMPs (por ejemplo, sobrenadantes de cultivo celular, la orina o el suero) se cargan en un gel de poliacrilamida que contiene dodecil sulfato sódico (SDS, para linealizar las proteínas) y gelatina (sustrato de la MMP-2). El tampón de la muestra está diseñada para aumentar la viscosidad de la muestra (para facilitar la carga de gel), proporcionan un medio de seguimiento (azul de bromofenol, para controlar la migración de la muestra), proporcionan moléculas de desnaturalización (para linealizar las proteínas), y controlar el pH de la muestra. Las proteínas se dejan de migrar en una corriente eléctrica en un tampón de diseñado para proporcionar una tasa de migración constante. La distancia de la migración está inversamente correlacionado con el peso molecular de la proteína (proteínas pequeñas se mueven más rápido a través del gel de proteínas de gran tamaño y por lo tanto no migran más por el gel). Después de la migración, el gel se coloca en un buffer de renaturalización de las proteínas permiten a recuperar su estructura terciaria, es necesario para la actividad enzimática. El gel se coloca en un búfer de desarrollo diseñado para permitir la proteasa para digerir su sustrato. El tampón de desarrollo también contiene p-aminophenylmercuric acetato (APMA) para activar el no proteolíticas pro-MMP a MMP activas. El siguiente paso consiste en teñir el sustrato (la gelatina en nuestro ejemplo). Después de lavar el exceso de tinte el gel, las áreas de la digestión de la proteasa aparecen como bandas claras. La más clara de la banda, la mayor concentración de la proteasa que contiene. Intensidad de la banda de tinción puede ser determinada por densitometría, utilizando un software como ImageJ, que permite la comparación de la muestra.

Este protocolo describe un ensayo basado en actividades para la detección de metaloproteinasas de la matriz en sobrenadantes de cultivo o los fluidos corporales.

La detección de metaloproteinasas de la matriz funcional por Zymography

Las metaloproteinasas de matriz (MMP) son endopeptidasas que contienen zinc. Degradan proteínas mediante la escisión de enlaces peptídicos. Se han identificado más de veinte MMP...

El objetivo general de este procedimiento es detectar metaloproteinasas matriciales funcionales. Esto se logra primero preparando la muestra para zy mediante la adición de un tampón de carga libre de agentes reductores agility. Luego, se carga la muestra en un gel de gelatina ZY Graham y se deja correr hasta que el colorante marcador alcance el extremo del gel.Tras la electroforesis, el gel se renatura, se desarrolla, se tiñe y se desvía. El paso final del procedimiento consiste en escanear el gel para el análisis de datos. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran la actividad de la metaloproteasa de matriz en las muestras mediante el análisis de la densidad de las bandas.Hola, soy del laboratorio de la doctora Kristin Bitten en el Departamento de Fisiología Molecular y Biofísica del LER College of Medicine. Hoy les mostraremos un procedimiento para detectar metaloproteinasas de matriz mediante zimografía. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las metaloproteinasas de matriz secretadas por células primarias cultivadas.Así que comencemos con el estudio. Antes de iniciar este protocolo, prepare adecuadamente todas las metaloproteinasas de la matriz o MMP para mantener la función de las enzimas. Las muestras pueden usarse inmediatamente o almacenarse a menos 80 grados Celsius.Aquí, la MMP dos, también conocida como gelatinasa A o colagenasa tipo cuatro, se utiliza para demostrar la visualización de la actividad de las MP mediante sinografía. Una vez que las enzimas MMP hayan sido preparadas, obtenga un sobre de gel de gelatina al 10% que contenga un gel dentro de una cassette. Enjuague la cassette con agua desionizada.Retire la cinta protectora de la parte inferior del cassette y el peine de la parte superior del gel. Enjuague los pocillos tres veces con tampón de marcha de tris-glicina-SDS.Coloque el gel en un aparato de electroforesis en mini celda, asegurándose de que el lado más pequeño de la cinta quede orientado hacia el interior. Fije el gel en su lugar con la cuña de tensión del gel. Llene la cámara superior del aparato con tampón de corrida de tris-glicina-SDS por encima del nivel de los pocillos y verifique si hay fugas.Llene también la cámara inferior del equipo de electroforesis en gel con tampón de corrida. Luego cargue 10 microlitros de marcador molecular de proteínas. Mezcle una cantidad igual de la muestra con tampón de carga para gel, que no contiene agentes reductores.A diferencia de la electroforesis SDS-PAGE convencional, no hierva las muestras y cárguelas directamente en los pocillos del gel. Utilizando puntas para carga de geles, estos pocillos pueden contener hasta 20 microlitros de volumen. Coloque la tapa en la mini cámara y conecte los cables de los electrodos a la fuente de alimentación.Encienda la fuente de alimentación y configure el gel para que funcione a 125 voltios constantes durante 90 minutos. Verifique la formación de pequeñas burbujas en el alambre de la cámara inferior, lo que indica la circulación de corriente al ejecutar el primer gel. Monitoree el progreso de la migración cada 15 minutos utilizando el azul de bromofenol incluido en el tampón de carga como indicador para cada gel.Prepare 100 mililitros de tampón Rena 1x de xmo gramo y 200 mililitros de tampón de revelado de xmo gramo, ambos en agua desionizada. Cuando el colorante indicador azul de bromofenol alcance la parte inferior del gel, apague la fuente de alimentación. Abra la mini célula y retire el gel.Separar los dos lados del casete. Con un cuchillo de gel, cortar una esquina para marcar la dirección del gel. Retirar cuidadosamente el gel del casete y colocarlo en un recipiente con 100 mililitros de tampón Rena.Incube el gel durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación suave, retire el tampón Rena y añada 100 mililitros de tampón de revelado al gel. Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. Luego, retire el tampón de revelado y añada otros 100 mililitros de tampón de revelado fresco al gel.Incube el gel durante toda la noche a 37 grados Celsius. Tras la incubación nocturna, retire el tampón de revelado y lave el gel incubándolo con agua desionizada y una agitación suave. Repita este lavado dos veces durante cinco minutos a temperatura ambiente.Coloque el gel sobre un protector de hojas de plástico y elimine las burbujas. Luego, escanee el gel con un escáner fotográfico para guardar la posición exacta de las bandas del patrón de proteínas, ya que estas se volverán apenas visibles después de la tinción del gel.Tiña el gel añadiendo 20 mililitros de tinción segura simplemente azul al gel. Incube el gel durante una hora a temperatura ambiente. Con agitación suave, retire la tinción segura simplemente azul y mantenga el gel en 100 mililitros de agua desionizada a temperatura ambiente bajo agitación suave.Después de una hora, reemplace con agua desionizada fresca y continúe incubando el gel durante al menos una hora. Para analizar los datos utilizando citometría, primero retire cuidadosamente el gel del agua y colóquelo en una funda de plástico protectora. Utilizando un escáner de fotos, escanee el gel con una resolución de 300 puntos por pulgada o superior.Guarde la imagen en formato TIFF. Abra el archivo TIFF en Image J o en un software de cuantificación similar para medir las intensidades de las bandas. Visualice la imagen en blanco y negro seleccionando el tipo de imagen de ocho bits.Utilice la herramienta de selección rectangular para delinear la primera banda, dibujando un rectángulo que tenga al menos el doble de altura que de ancho. Seleccione analizar geles. Seleccione la primera calle, y la banda será seleccionada.Luego aparecerá un nuevo rectángulo. Muévalo hacia la siguiente banda y seleccione Analizar geles, seleccione la siguiente calle. Repita este proceso hasta que se hayan seleccionado todas las bandas.Seleccione analizar geles y trazar carriles para generar el gráfico de perfiles para cada banda. Utilice la selección de línea recta para dibujar las líneas base de modo que el pico de interés sea un área completamente cerrada. Seleccione la herramienta de varita mágica y haga clic dentro de cada pico para seleccionarlo.Seleccione analizar geles y etiquetar picos para obtener una tabla con el área de cada pico seleccionado. Estos datos pueden representarse tal cual o pueden normalizarse al valor de una banda elegida. Esta normalización es especialmente importante cuando se agrupan valores de varios geles replicados para determinar la significancia estadística de los resultados.Cada pocillo del gel mostrado aquí se cargó con un cultivo celular diferente. Los sobrenadantes contenían diferentes cantidades de MMP-2. La observación directa de este gel muestra diferencias evidentes en las concentraciones de MMP-2 entre algunos de los pocillos.Por ejemplo, es evidente que tanto el pozo cuatro como el cinco contienen mucha más MMP dos que los pozos 10 y 11 para la cuantificación objetiva de las bandas. Se utilizó citometría densa con el software Image J. Este software reveló una diferencia aproximada de cuatro veces en la MMP.Dos cantidades entre, bueno, los pocillos 11 y los pocillos cuatro y cinco. De manera similar, se observó una diferencia de dos veces en las cantidades de MMP-2 entre los pocillos 10 y los pocillos cuatro y cinco. Solo les estamos mostrando cómo detectar métricas funcionales.El metal persiste por xog. Cuando realice este procedimiento, es importante recordar no hervir su muestra. De lo contrario, no podrá ver ninguna banda en su gel.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con su experimento.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este artículo se describe el uso de pinzas magnéticas para estudiar el efecto de la fuerza en la proteólisis enzimática a nivel sola molécula de una manera altamente paralelizable.

Multiplexado de una sola molécula de mediciones de la Fuerza proteólisis utilizando pinzas magnéticas

En este video, realizamos zimografía, una técnica electroforética, para analizar la actividad proteolítica dentro de muestras biológicas.

Zimografía de péptidos fluorescentes: una técnica modificada para detectar la actividad de la proteasa utilizando sustratos fluorogénicos en geles de zimograma

Este video muestra la técnica de electroforesis en gel de zimografía para evaluar la actividad de las metaloproteinasas de la matriz (MMPs) presentes en el sobrenadante de cultivo celular. Las MMP activas degradan el sustrato específico de MMP incrustado en un gel de poliacrilamida, que aparece como bandas transparentes sobre un fondo teñido oscuro después de la tinción.

Electroforesis en gel de zimografía: una técnica electroforética para detectar metaloproteinasas de matriz mediante la evaluación de la actividad enzimática

Medición de la masa exacta representa un paso importante en la investigación de las proteínas. Matrix asistida por láser de desorción / ionización (MALDI) espectrometría de masas (MS) se puede utilizar para tal determinación y su ventaja fundamental es la tolerancia a las sales, detergentes y los contaminantes. Aquí se ilustra un enfoque accesible para el análisis de proteínas más grandes de 100 kDa por MALDI-MS.

Matrix asistida por láser de desorción / ionización tiempo de vuelo (MALDI-TOF) espectrometría de masas Análisis de las proteínas intactas de más de 100 kDa

Este protocolo describe cómo preparar una matriz mixta 2D, que consta de gelatina y colágeno I, y un colágeno 3D para estudiar invadosomas lineales. Estos protocolos permiten el estudio de la formación invadosoma lineal, la actividad de degradación de la matriz, y la capacidad de invasión de células primarias y líneas celulares de cáncer.

Matrices 2D y 3D para estudiar la formación y la actividad invadosoma lineal

Aquí, presentamos un protocolo para determinar la especificidad de la proteasa en el tejido de ratón crudo usando MALDI-TOF espectrometría de extractos.

Los extractos de la determinación de la especificidad de la proteasa en el tejido de ratón por espectrometría de masas MALDI-TOF: manipulando PH para causar cambios de la especificidad

Aquí, presentamos un protocolo detallado para una técnica de zymographic modificada en la que se utilizan péptidos fluorescentes como el substrato degradable en lugar de proteínas nativas. Electroforesis de muestras biológicas en isoenzimáticos péptido fluorescente permite la detección de una gama más amplia de las proteasas que las anteriores técnicas de zymographic.

Detección de actividad de la proteasa por Zymography péptido fluorescente

Aquí, se presenta un protocolo para encapsular y cultivo de células en hidrogeles de poly(ethylene glycol) (PEG), funcionalizados con un fluorógenos matriz metaloproteinasa (MMP)-péptido degradable. MMP celular y actividad metabólica se miden directamente las culturas de hidrogel utilizando un lector de microplacas estándar.

Medición de metaloproteinasa de la matriz celular Global y actividad metabólica en hidrogeles 3D

La purificación, diálisis y activación de His-tag se emplean para aumentar los rendimientos de la expresión de proteínas del dominio catalítico soluble y activo metaloproteinasa-3 en bacterias. Las fracciones de proteínas se analizan a través de geles SDS-PAGE.

Expresión bacteriana y purificación de la metaloproteinasa-3 de matriz humana mediante cromatografía de afinidad

Las proteinasas son vitales para la patogénesis bacteriana, lo que permite la invasión y la evasión inmune. La extracción en un solo paso de proteínas citoplasmáticas y de membrana de bacterias en su forma activa es desgarradora. Este artículo en video demuestra la extracción de proteínas celulares completas de Leptospira para el análisis de zimografía para detectar y caracterizar gelatinasas.

Extracción y análisis zimográfico de gelatinasas bacterianas en un solo paso

Aprende a detectar metaloproteinasas de matriz funcionales mediante zimografía en geles de gelatina. Este protocolo permite cuantificar la actividad enzimática en sobrenadantes celulares y fluidos biológicos para estudios de remodelación tisular.

La detección de metaloproteinasas de la matriz funcional por Zymography

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