Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 2:59 min. • March 31st, 2026
Comienza con pozos de microplacas que contienen biopelículas de una bacteria patógena, divididos en cuatro grupos experimentales.
Aspira suavemente el medio y enjuaga con un tampón para eliminar las células no adherentes.
Añadir un búfer que contenga un precursor fotosensibilizador a dos grupos, mientras que los dos restantes reciben solo el búfer.
Incubar todos los grupos en la oscuridad para permitir que el precursor se difunda a través de la biopelícula, entre en las células bacterianas y se metabolice en un fotosensibilizador que se acumula dentro del citoplasma y las membranas.
Tras la incubación, expone un grupo tratado con precursor y otro solo con tampón a la irradiación luminosa.
En el grupo tratado con precursores, la luz excita el fotosensibilizador, que transfiere energía al ogénito molecular y genera especies reactivas de oxígeno (ROS).
Los ROS alteran las membranas, degradan proteínas y fragmentan el ADN, lo que provoca la muerte celular bacteriana.
Las otras tres condiciones no producen ROS, ya que el precursor o la luz están ausentes, dejando la biopelícula intacta.
Para generar un biofilm en una placa de 96 pozos, primero se inoculó uno menos 80 grados Celsius en una descongelación de Staphylococcus aureus USA trescientos en tres biofilms, formando cultivos clínicos de cepa en tubos individuales de fondo redondo de 14 mililitros que contenían cinco mililitros de caldo de soja triptón, o medio TSB, en una incubadora a 37 grados Celsius con agitación durante la noche. Cuando los cultivos han alcanzado la fase estacionaria, centrifugar las células bacterianas y volver a suspender los pellets y PBS a 2 por 10 a la novena colonia, formando la unidad por concentración de mililitros. Diluir estas suspensiones bacterianas en una proporción de 1 a 200 y un medio TSB suplementado con glucosa cero coma cinco por ciento y sembrar 200 microlitros de células bacterianas por pozo en tres pozos por cepa por grupo experimental en una microplaca de 96 pozos tratada con cultivo de poliestireno para una incubación de 24 horas a 37 grados Celsius, con oxígeno, sin temblar.
Al día siguiente, lava suavemente los pozos tres veces con PBS sin alterar las biopelículas. A continuación, añade 200 microlitros de ALA recién preparado a los pozos experimentales correspondientes y coloca la placa a 25 grados Celsius durante una hora protegida de la luz. Luego irradia la placa con un diodo emisor de luz a una intensidad de luz de 100 milivatios por centímetro cuadrado durante una hora.