El establecimiento de embriones de ratón con células madre neurales Cultura mediante el ensayo de neuroesfera

El objetivo de este protocolo en video es aislar y expandir células madre neurales del cerebro de ratón embrionario utilizando el ensayo de neuroesferas. El procedimiento incluye la obtención de embriones de ratón E14, seguido de la microdisección cerebral para extraer las eminencias ganglionares, la disociación del tejido recolectado para obtener una suspensión de células individuales y, finalmente, el cultivo de las células en forma de neuroesferas. Hola, soy Hassan Ali del laboratorio del Dr. Brent Frennels en el Instituto del Cerebro Mite de la Universidad de Florida.

Hoy voy a mostrarles cómo establecer un cultivo de neuroesferas a partir del cerebro de ratón embrionario utilizando el ensayo de neuroesferas. Utilizamos habitualmente este ensayo en nuestro laboratorio para aislar y expandir células madre neurales. Bien, comencemos.

Anestesiar un ratón hembra preñado en el momento adecuado. En el día 14 de gestación, realizar una dislocación cervical y lavar el abdomen con etanol al 70 %. Agarrar la piel de la zona abdominal con pinzas grandes y luego cortar la piel y la fascia subyacente con tijeras grandes.

Para exponer la cavidad abdominal y los cuernos uterinos, retire los cuernos uterinos que contienen los embriones y transfiéralos a un tubo cónico de 50 ml que contenga him frío. Después de transferir los tejidos uterinos a la cabina de flujo laminar clase II, retire el him del tubo de 50 ml y enjuague los tejidos con un volumen suficiente de him frío fresco para eliminar contaminantes como sangre y pelo; realice de dos a tres lavados de esta manera. Transfiera los tejidos uterinos a una placa de Petri de 10 centímetros que contenga him frío.

Abrir los cuernos uterinos con pinzas curvas pequeñas y tijeras, y transferir los embriones a un nuevo recipiente que contenga hem frío. Repetir este procedimiento hasta que se hayan recolectado todos los embriones. A continuación, colocar los embriones bajo el microscopio estereoscópico.

Separar las cabezas de los embriones a nivel de la médula espinal cervical y transferirlas a otra placa de Petri que contenga hem frío. Sostener la cabeza con pinzas curvas finas utilizando tijeras microquirúrgicas. Primero, realizar un corte horizontal por encima de la nariz y luego continuar cortando en la línea media desde la frente hacia la parte posterior de la cabeza.

Asegúrese de cortar a través de la piel y el cráneo sin dañar el cerebro subyacente. Retire el cerebro del cráneo empujando los bordes de la sección cortada en movimiento hacia atrás utilizando la pinza curva. Continúe este procedimiento hasta que todos los cerebros hayan sido extraídos de los cráneos.

Sujete el cerebro firmemente utilizando la pinza curva de manera que el lado dorsal quede orientado hacia arriba, y luego, con tijeras microquirúrgicas, corte a través de la corteza de cada hemisferio desde los bulbos olfatorios hasta la parte posterior del hemisferio. Para exponer las eminencias ganglionares, manteniendo el cerebro en su lugar, disecte toda la eminencia ganglionar con pinzas en ángulo de 45 grados y transfiérala a otra placa de Petri. La eminencia ganglionar se muestra claramente aquí con sus partes medial y lateral.

Alternativamente, puede diseccionar las eminencias ganglionares eliminando los tejidos circundantes utilizando fórceps finos. También puede cortar toda la eminencia en una mitad medial y otra lateral, si está interesado en cultivar células de cualquiera de estas regiones.

Repita este procedimiento hasta que todos los cerebros hayan sido microdiseccionados. Utilice un mililitro de medio de células madre neural para recoger los fragmentos de tejido y transfiéralos a un tubo cónico de 15 mililitros. Deje que los agregados de tejido sedimenten en el tubo de 15 mililitros para no dejar ningún tejido atrás.

Retire algo del medio sobrenadante y lave la base de la placa de Petri para transferir cualquier tejido adicional al tubo de 15 ml. Coloque la punta de la pipeta contra el fondo del tubo. Pipetee la suspensión hacia arriba y hacia abajo de tres a cuatro veces para desagregar el tejido y obtener una suspensión de células individuales.

Luego, deje reposar la suspensión durante un minuto para que los agregados no asociados sedimenten; transfiera casi toda la suspensión celular a otro tubo de 15 ml. A continuación, agregue un mililitro de medio de células madre neurales a los agregados restantes y disocie estos hasta obtener células individuales. Aspire el contenido de los tubos.

Luego, centrifugue la suspensión a 700 RPM o 110 G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y resuspenda las células en un mililitro de medio completo para células madre neurales. Tome 10 microlitros de la suspensión celular y mezcle bien con 90 microlitros de azul de trian.

Luego, tome 10 microlitros de esta suspensión y transfiéralos a un hemocitómetro. Realice un recuento celular. Transfiera un total de 20 ml de medio completo para células madre neurales a un tubo cónico de 50 ml para sembrar un frasco T 80.

Luego, mezcle la suspensión celular y agregue una cantidad adecuada de células para obtener una densidad total de 200.000 células por mililitro o 4 millones de células por matraz T 80. Añada EGF a una concentración final de 20 nanogramos por mililitro. Mezcle las células que están en medio completo para células madre neurales con el factor de crecimiento y transfiera la suspensión celular a matraces T 80.

Etiquete el matraz y observe las células al microscopio para asegurarse de que tiene una suspensión de células individuales sin agregados de tejido. Transfiera el matraz a un incubador a 37 grados Celsius con 5 %CO₂ durante cinco a siete días. Después de cinco a siete días, evalúe el matraz al microscopio.

Para este momento, ya se habrán formado neuroesferas y deberían tener entre 150 y 200 micrones de diámetro, por lo que están listas para ser subcultivadas. Recolecte el contenido del frasco en un tubo estéril de cultivo de tejidos de tamaño adecuado, centrifugue el tubo y deseche el sobrenadante. Resuspenda las esferas en un mililitro medio de tripsina precalentada y coloque el tubo en un baño de agua a 37 grados durante dos minutos.

Luego, agregue un volumen igual de inhibidor de tripsina y mezcle bien pero suavemente para detener la actividad de la tripsina. Vuelva a centrifugar y retire el sobrenadante. A continuación, re suspenda las células en un mililitro de medio completo para células madre neurales y realice un conteo celular como se mencionó anteriormente. Con el fin de sembrar un frasco T175, transfiera un total de 40 ml de medio completo para células madre neurales a un tubo cónico de 50 ml.

Luego, mezcle las células y agregue una cantidad adecuada de células para obtener una densidad total de 50.000 células por M o 2 millones de células por matraz T175. A continuación, agregue EGF a una concentración final de 20 nanogramos por mililitro. Mezcle las células que se encuentran en medio completo para células madre neurales con el factor de crecimiento y transfiera la suspensión celular a un matraz T175.

Etiquete el matraz y transfiéralo a un incubador durante cinco a siete días. Este es un ejemplo de cultivo primario de células madre neurales E 14. Tres días después de la siembra, las flechas muestran agrupaciones de células madre neurales en proliferación.

También puede observar células que están adheridas al sustrato y que se han diferenciado. Este es un ejemplo de un cultivo primario de células madre neurales E 14 siete días después del sembrado. Como puede ver, hay esferas de diversos tamaños.

También hay células que están diferenciadas. La cantidad de restos celulares es mucho menor que en los cultivos de neuroesferas primarias de adultos. Además, las esferas no están compactas y presentan microespículas en la periferia, lo que indica que las esferas son saludables y viables.

La esfera no debe permitirse que crezca demasiado, ya que podría oscurecerse debido a la muerte celular en el centro. Las esferas grandes podrían también adherirse al sustrato y diferenciarse. Este es un ejemplo de neuroesferas del paso uno de E 14, cinco días después del siembra.

Aquí nuevamente, puede observar las microespículas en la periferia de las esferas. Acabamos de mostrarle cómo cultivar neuroesferas a partir de eminencias ganglionares de ratón E14 siguiendo los mismos procedimientos descritos aquí. También puede cultivar neuroesferas a partir de otras regiones del cerebro, como la corteza y el mesencéfalo.

Gracias por ver el video y mucha suerte con sus cultivos de neuroesferas.