Organotípicos culturas rebanada hipocampo
3 de febrero de 2011
Se describe un método para preparar organotípicos rodajas de hipocampo que se pueden adaptar fácilmente a otras regiones del cerebro. Cortes de cerebro se ponen en membranas porosas y medios de cultivo se le permite formar una interfase. Este método conserva la arquitectura bruto del hipocampo durante un máximo de 2 semanas en la cultura.
El objetivo general de este procedimiento es cultivar cortes organotípicos del hipocampo. Esto se logra primero mediante la disección del hipocampo. El segundo paso del procedimiento consiste en seccionar el hipocampo.
El tercer paso del procedimiento consiste en separar y clasificar las secciones del hipocampo. El paso final del procedimiento es cultivar las secciones del hipocampo. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran secciones orgánicas sanas del hipocampo mediante la visualización con un microscopio de disección o un microscopio.
Hola, mi nombre es Jimena Opitz y soy científica investigadora en el laboratorio del Dr. Andres bar en la Universidad de Washington. En Seattle, demostraré el procedimiento para el cultivo de cortes organotípicos del hipocampo, LICs. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la necesidad de diseccionar y cortar rápidamente los hipocampos y de prevenir la contaminación, la solución de disección estéril y el cultivo de cortes.
El medio puede prepararse hasta tres semanas de antemano y almacenarse a cuatro grados Celsius como se describe en el protocolo escrito. Antes del corte del hipocampo, pueden prepararse los cultivos. Es necesario esterilizar adecuadamente tanto la cabina de cultivo como el equipo que se utilizará en la disección.
Primero, limpie la superficie interna de la cabina de cultivo celular con etanol al 70 %. Luego coloque el microscopio estereoscópico y todos los instrumentos de disección dentro de la cabina. Prepare el cortador de tejidos colocando una pieza limpia de lámina de politetrafluoroetileno (PTFE) sobre la platina y montando una cuchilla nueva.
Coloque el cortador de tejidos dentro de la campana de cultivo celular utilizando una luz UV y esterilice todas las superficies y equipos durante 15 minutos. Apague la luz una vez finalizado el proceso de esterilización con UV. Trabaje dentro de la campana de cultivo celular.
Primero, prepare las placas de cultivo de tejidos de seis pocillos que se utilizarán para el cultivo de los fragmentos de hipocampo. Pipetee 750 microlitros de SEM en cada pocillo de la placa de seis pocillos. Luego, utilizando fórceps estériles, coloque un inserto para cultivo celular en cada pocillo de la placa de cultivo de tejidos.
Teniendo cuidado de no atrapar burbujas de aire debajo del inserto. Es importante que la membrana de cada inserto de cultivo celular esté humedecida con medio de cultivo de secciones. Si la membrana está seca, verifique que no haya burbujas de aire presentes.
Si la membrana se encuentra por encima del menisco del medio SCM, se puede añadir más medio al pocillo. Coloque las placas de cultivo preparadas en un incubador de cultivo de tejidos. Ajuste a 35 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono hasta que sean necesarias.
Finalmente, llene un cubo de hielo con una mezcla de hielo y sal y colóquelo junto al área de decapitación, trabajando dentro de la campana. Llene un vaso de precipitados de 100 mililitros con solución de disección. Introduzca el vaso en la mezcla de hielo y sal y burbujee la solución con 5%carbon dioxide y 95%oxygen durante 10 a 20 minutos hasta que el color cambie de rosa a naranja.
Y la solución de disección forma una mezcla pastosa de solución congelada y líquida. Ahora, el entorno de disección y las placas de cultivo de tejidos están listos para la disección. Envoltura P tres a P siete.
Se utilizan crías para este procedimiento. Los cultivos pueden prepararse a partir de hasta tres crías por vez. Este procedimiento se ilustrará utilizando una sola cría.
Extraiga rápidamente el cerebro del cachorro decapitado y colóquelo en el vaso de precipitados de 100 mililitros que contiene la solución de disección Slurry Chill durante un minuto. Durante este tiempo, prepare un recipiente para disección añadiendo aproximadamente 10 mililitros de solución de disección fría con hielo al fondo de una placa de cultivo de tejidos de 60 milímetros. Con una cuchara redondeada o una espátula microscópica, transfiera el cerebro del vaso de precipitados de 100 mililitros al recipiente de 60 milímetros lleno con medio de disección frío. Asegúrese de que el cerebro esté completamente cubierto por la solución de disección.
Coloque el recipiente que contiene el cerebro bajo el microscopio de disección. Observe a través del microscopio de disección y localice el cerebro. Utilice pinzas de disección estériles para mover el cerebro al centro del campo de visión.
Sujete el cerebro en la línea media con la pinza de disección presionada contra el fondo del recipiente. Utilizando la herramienta de disección del hipocampo, desprenda suavemente los hemisferios corticales del mesencéfalo dejando este último en su lugar, y, idealmente, sin separar los hemisferios corticales del resto del cerebro; de este modo, el hipocampo queda expuesto. Tome la herramienta de disección del hipocampo y extraiga el hipocampo de un hemisferio.
Luego, use la aguja de disección para eliminar la mayor cantidad posible de tejido no hipocampal. Una vez aislado y limpio el primer hipocampo, repita este proceso para el segundo hipocampo proveniente del otro hemisferio. A continuación, use tijeras estériles para cortar la punta de una punta de pipeta filtrante P 1000.
Coloque la punta de la pipeta en una pipeta estéril P 1000. Aspire suavemente un hipocampo y dispóngalo sobre la lámina de teflón en el cortador de tejidos. Luego, de manera similar, coloque el segundo hipocampo en el cortador.
Coloque las mitades del hipocampo sobre sus lados cóncavos y alínelas perpendicularmente a la cuchilla; aspire el exceso de líquido de la hoja de teflón. Coloque el micrómetro en la posición cero. Corte los hipocampos en secciones de 400 micrómetros.
Prepare otra punta filtrante cortada de P 1000 y colóquela en una pipeta estéril P 1000. Vierta aproximadamente 10 mililitros de SCM frío en una placa estéril de cultivo celular de 60 milímetros. Utilizando la pipeta, agregue algo de medio y transfiera las secciones del hipocampo desde el cortador a la placa.
Evite formar burbujas; después de repetir el proceso de transferencia para todos los cortes, coloque el recipiente bajo el microscopio estereoscópico. Finalmente, utilizando una espátula de iris y una espátula recta, separe suavemente los cortes unos de otros.
Separar los trozos bien definidos y sin daños de los trozos dañados. Los trozos de hipocampo bien definidos ya están listos para ser cultivados. Retirar las placas de cultivo de tejidos de seis pocillos que contienen SCM e insertos para cultivo celular, previamente preparadas, del incubador utilizando una pipeta P1000 con una punta ancha cortada y transferir cuatro o cinco trozos individuales por membrana.
Cuando sea necesario, utilice la espátula de iris para separar las secciones. Tenga cuidado de no colocar las secciones demasiado cerca de la pared del inserto ni muy próximas entre sí. Teniendo cuidado de no tocar las secciones, aspire cualquier medio en exceso de la superficie superior del cultivo celular.
Inserte la membrana. Finalmente, devuelva la placa, que ahora contiene los cultivos de tejido de hipocampo, al incubador de cultivo celular. Ajuste a 35 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.
Después de 48 horas, retire la placa del incubador trabajando dentro de la campana de cultivo celular. Aspire el medio con una pipeta posterior. Añada 750 microlitros de SCM fresco precalentado por placa.
Bien nuevamente, asegúrese de que no se formen burbujas debajo de la membrana del inserto para cultivo celular. Este es un ejemplo de un trozo de hipocampo sano listo para ser cultivado. El CA1, el CA3 y el giro dentado, regiones del hipocampo, son claramente visibles y están intactos.
Se muestra aquí una sección dañada del hipocampo que no se utilizó para el cultivo. Finalmente, este es un ejemplo de una sección saludable del hipocampo después de cuatro días en cultivo. Observe que la sección se ve blanca bajo el microscopio estereoscópico y que la superficie de la sección está limpia.
Las regiones del hipocampo, CA uno, CA tres y giro dentado, son claramente visibles y están intactas. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente una hora si se lleva a cabo correctamente.
Al intentar este procedimiento, es muy importante recordar utilizar técnicas adecuadas con esteroides y ser suave con el tejido. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar órganos tipificados. Lisado de hipocampo.
Gracias y buena suerte con sus experimentos.
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Descripción general
Este artículo describe un método para cultivar rebanadas organotípicas del hipocampo, que puede adaptarse para otras regiones cerebrales. La técnica preserva la arquitectura del hipocampo hasta por dos semanas en cultivo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Cultivo celular
- Investigación del hipocampo
Antecedentes
- Los cultivos organotípicos son esenciales para el estudio de la fisiología cerebral.
- Los cortes del hipocampo mantienen las conexiones sinápticas y la arquitectura celular.
- Los métodos existentes pueden no preservar la integridad del tejido durante períodos prolongados de cultivo.
- Este método tiene como objetivo mejorar la viabilidad y utilidad de los cortes cerebrales en la investigación.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para el cultivo de secciones del hipocampo.
- Permitir el estudio de la función del hipocampo en un entorno controlado.
- Proporcionar un protocolo que pueda adaptarse a otras regiones cerebrales.
Métodos Utilizados
- Diseción del hipocampo a partir del tejido cerebral.
- Corte del hipocampo en secciones delgadas.
- Clasificación y separación de las secciones hipocampales.
- Cultivo de las secciones sobre membranas porosas con interfase de medio.
Resultados principales
- Preservación exitosa de la arquitectura del hipocampo durante dos semanas.
- Fragmentos organotípicos sanos visualizados mediante microscopios de disección o microscopios ópticos.
- Se demostró la adaptabilidad del método a otras regiones cerebrales.
- Potencial para estudios posteriores sobre la función y la patología del hipocampo.
Conclusiones
- El método proporciona un enfoque robusto para el cultivo de secciones del hipocampo.
- Permite períodos de estudio prolongados manteniendo la integridad del tejido.
- Las aplicaciones futuras podrían mejorar la comprensión de la función cerebral y las enfermedades.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los cultivos de cortes hipocampales organotípicos proporcionan un sistema ex vivo fisiológicamente relevante para investigar los mecanismos sinápticos, permitiendo manipulaciones genéticas y farmacológicas precisas mientras se conserva la arquitectura nativa del tejido. Esta plataforma apoya la validación temprana de objetivos terapéuticos y la reducción del riesgo mecanicista en el descubrimiento de fármacos en neurociencia, cerrando la brecha entre los ensayos in vitro y los modelos in vivo. Su adaptabilidad y reproducibilidad la convierten en un recurso valioso para la selección de carteras y la continuidad de la investigación traslacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación funcional de proteínas sinápticas en un contexto de circuito neuronal preservado.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al mantener la conectividad y arquitectura hipocampales nativas.
- Facilita la manipulación genética y la aclaración de vías mediante enfoques virales o biobalísticos.
- Proporciona un sistema robusto para evaluar la interacción con el blanco y la relevancia biológica.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Prepara sistemas de tejido neural validados y reproducibles para ensayos posteriores de cribado de compuestos.
- Permite imágenes cuantitativas y lecturas electrofisiológicas para la estandarización de ensayos.
- Posibilita la preparación escalable de cortes para pruebas farmacológicas paralelas.
- Permite evaluar de forma confiable los efectos de los compuestos sobre la función y plasticidad sinápticas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con la circuitría neural relevante para la enfermedad, facilitando la exploración de biomarcadores traslacionales.
- Mantiene la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al preservar la complejidad del tejido.
- Reduce el riesgo traslacional al proporcionar datos predictivos sobre la modulación sináptica.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en las respuestas funcionales del tejido.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Los cultivos organotípicos de cortes de hipocampo se integran en el continuo de descubrimiento desde la validación inicial del blanco hasta la identificación de fármacos líderes y la investigación preclínica, apoyando la prueba iterativa de hipótesis y la evaluación mecanicista.
- Biología del Descubrimiento: Permite pruebas basadas en hipótesis de la función sináptica y la modulación de vías en un entorno similar al nativo.
- Cribado Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles para la evaluación de compuestos y el desarrollo de ensayos.
- Análisis: Permite imágenes, electrofisiología y ensayos bioquímicos para análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación traslacional Conecta estudios in vitro e in vivo mediante la preservación de la arquitectura neural relevante para la enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma estandarizada y adaptable para uso repetido en la investigación de neurociencia&D programas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Proporciona preparaciones de tejidos estandarizadas, reproducibles y escalables para equipos multifuncionales.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al proporcionar datos preclínicos robustos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de los activos en neurociencia.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en disección estéril, manipulación de tejidos y técnicas de cultivo de secciones.
- Necesita acceso a campanas de cultivo celular, microscopios y equipo especializado para seccionado.
- Exige una estandarización rigurosa entre equipos para garantizar la reproducibilidad y la comparabilidad de los datos.
- Adaptable a otras regiones cerebrales mediante modificaciones del protocolo, según lo permita el método.
- Depende de una manipulación cuidadosa para mantener la viabilidad de las secciones y minimizar la contaminación.
