La cuantificación de ADN de doble cadena con el Hitachi F-7000 espectrofotómetro de fluorescencia y Dye PicoGreen
5 de noviembre de 2010
Demostración de la cuantificación de ADN de doble cadena utilizando sondas moleculares PicoGreen tinte y Hitachi F-7000 Espectrofotómetro de fluorescencia equipado con un accesorio lector de microplacas.
El objetivo general de este procedimiento es demostrar la capacidad del espectrofotómetro fluorescente F 7, 000 con lector de microplacas para realizar la cuantificación de ADN bicatenario utilizando colorante verde Pico. Esto se logra preparando primero las muestras y los reactivos. El segundo paso del procedimiento es configurar el instrumento.
El tercer paso del procedimiento es cargar las muestras en el lector de microplacas. El paso final del procedimiento es realizar la medición de patrones y muestras. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran una curva de calibración lineal, que podría utilizarse para la cuantificación de ADN bicatenario de muestras desconocidas.
Encienda el fluorímetro Hitachi F 7, 000 Spectra para permitir que la lámpara de xenón se caliente durante una hora en Excel. Cree un archivo con los estándares y los datos de muestra y guárdelo en valores separados por comas o en formato CSV. Para configurar el fluorímetro primero, haga clic en el botón de método que abre la ventana del método de análisis.
En el campo de medición, seleccione fotometría en el menú desplegable. Ahora haga clic en la pestaña de cuantificación. En el campo de tipo de cuantificación, seleccione la longitud de onda para indicar que la lectura de fluorescencia se realizará utilizando una longitud de onda especificada.
Para el tipo de calibración, seleccione primer pedido, y para el número de longitudes de onda, seleccione una. Introduzca nanogramos por mililitro para la unidad de concentración. Asegúrese de que la calibración manual y la curva de fuerza a través de las casillas cero no estén marcadas para el dígito Después del punto decimal, seleccione dos, ingrese cero para el límite de concentración inferior y 10, 000 para el campo de límite de concentración superior.
A continuación, haga clic en la pestaña del instrumento y en el campo de modo de datos seleccione fluorescencia. Verifique que el campo de velocidad de corte esté inactivo, ya que solo se utiliza para mediciones de fosforescencia. En el campo de modo de longitud de onda, seleccione ambos WL fijos en el campo ex WL uno, ingrese 480 nanómetros en el campo EM WL uno.
Ingresa 520 nanómetros. Deje todos los demás campos de EX y EM como inactivos. Establezca la ranura ex y la ranura EM en 5,0 nanómetros.
Usando los menús desplegables, deje la caja frente al campo de voltaje PMT de uno a 1000 voltios sin seleccionar. Para el voltaje PMT, seleccione 700 voltios en el menú desplegable. Además, seleccione dos para el cálculo de estadísticas automáticas, número uno para réplicas, 0,1 segundos para el tiempo de integración y cero para el retraso.
Ahora abra la pestaña monitor y establezca por qué el campo máximo del eje en 10, 000 y por qué el eje mínimo en cero. A continuación, seleccione la casilla situada a la izquierda del procesamiento de datos abiertos después de la adquisición de datos y, si es necesario, la casilla situada a la izquierda del informe de impresión después de la adquisición de datos para un informe que se imprimirá automáticamente al finalizar las lecturas. Finalmente, para guardar todos los parámetros seleccionados en las diferentes pestañas de la ventana del método de análisis, haga clic en la pestaña general y guarde con un nuevo nombre de archivo en una ubicación específica.
Haga clic en el botón Aceptar para cerrar esta ventana. Esto completa la configuración de los parámetros de prueba del instrumento. Para configurar el lector de microplacas, haga clic en el botón MPR para abrir la ventana de configuración de MPR al frente.
Primero seleccione los pozos para los estándares. Por ejemplo, haga clic en la posición A uno y arrastre el ratón hasta E uno. A continuación, haga clic en el botón de configuración estándar.
Esto seleccionará las posiciones que se utilizarán para los estándares resaltados en color verde. A continuación, seleccione las posiciones de las muestras. Del mismo modo, haga clic y arrastre el mouse sobre las posiciones correspondientes en la placa y luego haga clic en el botón del conjunto de muestras, que resaltará automáticamente las posiciones seleccionadas en amarillo.
Continúe repitiendo la misma operación para las posiciones de las mediciones de muestra deseadas. Para cargar los estándares y la información de muestra en el archivo de variables separadas por comas preparado anteriormente. Haga clic en la pestaña de información del pozo de la ventana de configuración de MPR.
Seleccione el botón de carga de información del pozo y se abrirá una ventana del Explorador de Windows para identificar el archivo punto csv de información del pozo. Después de cargar la información, la ventana debería mostrarse como una tabla. Para preparar una solución de trabajo del reactivo Pico green, agregue 50 microlitros de reactivo 200 X pico green a 9,95 mililitros de tampón TE.
Para la curva estándar, prepare diluciones en serie de ADN bicatenario Lambda en tampón TE para concentraciones finales, que van de uno a 100 nanogramos por mililitro, pipetea 150 microlitros de cada patrón en pocillos designados de una placa de 96 pocillos. A continuación, pipetee 150 microlitros de cada muestra de prueba en los pocillos designados correspondientes de la placa. Ahora, usando una pipeta múltiple, agregue 150 microlitros de solución verde Pico a cada pocillo y mezcle la solución y las muestras de ADN.
Incube suavemente la placa en un área oscura durante dos a cinco minutos para que se desarrolle la reacción. Haga clic en el botón de la pantalla de visualización MPR para colocar la ventana de configuración de MPR en la parte superior de la pantalla y haga clic en el botón de posición de intercambio. La plataforma de retención de microplacas se moverá hacia la parte delantera del instrumento, abrirá la puerta del lector de microplacas y colocará la placa de 96 pocillos en la plataforma de retención con el pozo A hacia el frente y cerrará la puerta del lector de microplacas.
Haga clic en el botón de posición inicial para colocar la posición A de la microplaca en la posición de medición. Haga clic en el botón de visualización del monitor para colocar la ventana de medición en la parte superior de la pantalla. Haga clic en el botón de medición para comenzar a medir los patrones y muestras desconocidas.
Una buena curva de calibración se evalúa utilizando los diferentes parámetros proporcionados por el software F 7, 000. Por ejemplo, esta curva de calibración ideal obtenida para la cuantificación de ADN bicatenario utilizando el colorante verde Pico ha calculado un coeficiente de determinación de 0,99993. El sistema de alto rendimiento descrito es un ensamblaje en serie de tecnologías que incluyen Pico Green Dye, un espectrofotómetro fluorescente Hitachi F 7,000, equipado con un lector de microplacas y un programa de software para automatizar la recopilación de datos, el almacenamiento, los análisis y la presentación.
La combinación de tecnologías potentes puede abordar la creciente necesidad de analizar con precisión pequeñas cantidades de bicatenario. ADN.
Visión general
Este artículo demuestra la cuantificación del ADN bicatenario (adnbi) utilizando el tinte PicoGreen y el espectrofotometro de fluorescencia Hitachi F-7000 con un lector de microplacas. El procedimiento describe la preparación de muestras, la configuración del instrumento y los procesos de medición para obtener una curva de calibración lineal para la cuantificación del adnbi.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Espectroscopía de fluorescencia
- Cuantificación de ADN
- Tecnología de lector de microplacas
Antecedentes
- El tinte PicoGreen es un tinte fluorescente sensible utilizado para cuantificar adnbi.
- El Hitachi F-7000 es un espectrofotómetro de fluorescencia versátil.
- La cuantificación precisa de ADN es esencial para varios experimentos biológicos.
- Los sistemas de alto rendimiento facilitan el análisis de múltiples muestras simultáneamente.
Propósito del estudio
- Demostrar la capacidad del espectrofotómetro F-7000 para la cuantificación de adnbi.
- Establecer un método confiable para medir muestras de ADN desconocidas.
- Crear una curva de calibración lineal para una cuantificación precisa.
Métodos utilizados
- Preparación del reactivo PicoGreen y estándares de ADN.
- Configuración de los parámetros del espectrofotómetro Hitachi F-7000.
- Carga de muestras en el lector de microplacas.
- Medición de fluorescencia para generar una curva de calibración.
Principales resultados
- Se estableció una curva de calibración lineal para la cuantificación de adnbi.
- El método demostró alta sensibilidad y precisión.
- Los resultados mostraron un coeficiente de determinación de 0,99993.
- El sistema analizó eficazmente pequeñas cantidades de adnbi.
Conclusiones
- La combinación del tinte PicoGreen y el espectrofotómetro F-7000 proporciona un método robusto para la cuantificación de ADN.
- Este enfoque de alto rendimiento satisface las demandas de análisis preciso en la investigación biológica.
- El método se puede aplicar a varios estudios que requieren mediciones precisas de ADN.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of double-stranded DNA is a foundational requirement for target validation, assay development, and preclinical model generation in biopharma R&D. The Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer with PicoGreen dye enables high-sensitivity, high-throughput measurement of dsDNA, supporting reliable standard curve generation for downstream applications. This method provides predictive confidence in nucleic acid quantification, reducing variability in early discovery workflows and enabling scalable, reproducible data generation across compound screening and biomarker studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise measurement of dsDNA concentrations for cloning, transfection, and PCR-based target validation assays.
- Operational Value: Supports reproducible sample preparation and quantification, reducing technical variability in hypothesis-driven experiments.
- Predictive Value: Generates linear calibration curves with high determination coefficients (R² > 0.999), ensuring accurate quantification of unknown samples in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative fluorescence readouts compatible with 96-well formats for assay standardization and reagent titration.
- Operational Value: Enables rapid measurement of 96 wells in under 60 seconds using kinetics mode, supporting high-throughput screening readiness.
- Scalability: Software allows saving and recalling microplate configurations, facilitating consistent assay setup across teams and projects.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Delivers reliable dsDNA quantification for biomarker analysis, PCR validation, and vector production in preclinical models.
- Risk Mitigation: High sensitivity (50 picomoles fluorescein equivalent) and wide dynamic range (5 orders of magnitude) allow accurate quantification across dilution series, reducing false negatives in low-abundance targets.
- Workflow Integration: Outputs data to Excel or report formats, enabling seamless transfer to bioinformatics and analytical pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical development, where accurate nucleic acid quantification is essential for experimental reproducibility and data integrity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling precise dsDNA measurement for cloning efficiency, gene expression analysis, and mutagenesis studies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence outputs that support assay robustness and compound library normalization.
- Analytics: Generates linear calibration curves and determination coefficients (R²) that allow inter-experiment comparison and quality control.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through reliable quantification of DNA in drug formulations, viral vectors, and biomarker assays.
- Enterprise Reuse: Configurable software and standardized protocols allow reuse across departments, reducing method redevelopment and increasing operational efficiency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High sensitivity and specificity for dsDNA reduce false signals and improve data confidence in molecular assays.
- Operational Value: Automated data collection, storage, and presentation via software minimize manual handling and transcription errors.
- Strategic Value: Reliable quantification supports go/no-go decisions in lead optimization by ensuring accurate dosing and normalization in functional assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by providing trustworthy nucleic acid data for candidate selection and formulation studies.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with fluorescence spectroscopy and microplate reader operation.
- Necessitates access to Hitachi F-7000 spectrophotometer with microplate reader accessory and compatible software.
- Demands standardized reagent preparation (PicoGreen dilution in TE buffer) and sample handling to avoid fluorescence quenching.
- Involves optimization of incubation time (2–5 minutes in dark) and wavelength settings (Ex 480 nm, Em 520 nm) for signal consistency.
- Includes practical limitations such as the need for dark incubation and potential interference from contaminants or organic solvents.
