La cuantificación de ADN de doble cadena con el Hitachi F-7000 espectrofotómetro de fluorescencia y Dye PicoGreen
5 de noviembre de 2010
Demostración de la cuantificación de ADN de doble cadena utilizando sondas moleculares PicoGreen tinte y Hitachi F-7000 Espectrofotómetro de fluorescencia equipado con un accesorio lector de microplacas.
El objetivo general de este procedimiento es demostrar la capacidad del espectrofotómetro fluorescente F 7, 000 con lector de microplacas para realizar la cuantificación de ADN bicatenario utilizando colorante verde Pico. Esto se logra preparando primero las muestras y los reactivos. El segundo paso del procedimiento es configurar el instrumento.
El tercer paso del procedimiento es cargar las muestras en el lector de microplacas. El paso final del procedimiento es realizar la medición de patrones y muestras. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran una curva de calibración lineal, que podría utilizarse para la cuantificación de ADN bicatenario de muestras desconocidas.
Encienda el fluorímetro Hitachi F 7, 000 Spectra para permitir que la lámpara de xenón se caliente durante una hora en Excel. Cree un archivo con los estándares y los datos de muestra y guárdelo en valores separados por comas o en formato CSV. Para configurar el fluorímetro primero, haga clic en el botón de método que abre la ventana del método de análisis.
En el campo de medición, seleccione fotometría en el menú desplegable. Ahora haga clic en la pestaña de cuantificación. En el campo de tipo de cuantificación, seleccione la longitud de onda para indicar que la lectura de fluorescencia se realizará utilizando una longitud de onda especificada.
Para el tipo de calibración, seleccione primer pedido, y para el número de longitudes de onda, seleccione una. Introduzca nanogramos por mililitro para la unidad de concentración. Asegúrese de que la calibración manual y la curva de fuerza a través de las casillas cero no estén marcadas para el dígito Después del punto decimal, seleccione dos, ingrese cero para el límite de concentración inferior y 10, 000 para el campo de límite de concentración superior.
A continuación, haga clic en la pestaña del instrumento y en el campo de modo de datos seleccione fluorescencia. Verifique que el campo de velocidad de corte esté inactivo, ya que solo se utiliza para mediciones de fosforescencia. En el campo de modo de longitud de onda, seleccione ambos WL fijos en el campo ex WL uno, ingrese 480 nanómetros en el campo EM WL uno.
Ingresa 520 nanómetros. Deje todos los demás campos de EX y EM como inactivos. Establezca la ranura ex y la ranura EM en 5,0 nanómetros.
Usando los menús desplegables, deje la caja frente al campo de voltaje PMT de uno a 1000 voltios sin seleccionar. Para el voltaje PMT, seleccione 700 voltios en el menú desplegable. Además, seleccione dos para el cálculo de estadísticas automáticas, número uno para réplicas, 0,1 segundos para el tiempo de integración y cero para el retraso.
Ahora abra la pestaña monitor y establezca por qué el campo máximo del eje en 10, 000 y por qué el eje mínimo en cero. A continuación, seleccione la casilla situada a la izquierda del procesamiento de datos abiertos después de la adquisición de datos y, si es necesario, la casilla situada a la izquierda del informe de impresión después de la adquisición de datos para un informe que se imprimirá automáticamente al finalizar las lecturas. Finalmente, para guardar todos los parámetros seleccionados en las diferentes pestañas de la ventana del método de análisis, haga clic en la pestaña general y guarde con un nuevo nombre de archivo en una ubicación específica.
Haga clic en el botón Aceptar para cerrar esta ventana. Esto completa la configuración de los parámetros de prueba del instrumento. Para configurar el lector de microplacas, haga clic en el botón MPR para abrir la ventana de configuración de MPR al frente.
Primero seleccione los pozos para los estándares. Por ejemplo, haga clic en la posición A uno y arrastre el ratón hasta E uno. A continuación, haga clic en el botón de configuración estándar.
Esto seleccionará las posiciones que se utilizarán para los estándares resaltados en color verde. A continuación, seleccione las posiciones de las muestras. Del mismo modo, haga clic y arrastre el mouse sobre las posiciones correspondientes en la placa y luego haga clic en el botón del conjunto de muestras, que resaltará automáticamente las posiciones seleccionadas en amarillo.
Continúe repitiendo la misma operación para las posiciones de las mediciones de muestra deseadas. Para cargar los estándares y la información de muestra en el archivo de variables separadas por comas preparado anteriormente. Haga clic en la pestaña de información del pozo de la ventana de configuración de MPR.
Seleccione el botón de carga de información del pozo y se abrirá una ventana del Explorador de Windows para identificar el archivo punto csv de información del pozo. Después de cargar la información, la ventana debería mostrarse como una tabla. Para preparar una solución de trabajo del reactivo Pico green, agregue 50 microlitros de reactivo 200 X pico green a 9,95 mililitros de tampón TE.
Para la curva estándar, prepare diluciones en serie de ADN bicatenario Lambda en tampón TE para concentraciones finales, que van de uno a 100 nanogramos por mililitro, pipetea 150 microlitros de cada patrón en pocillos designados de una placa de 96 pocillos. A continuación, pipetee 150 microlitros de cada muestra de prueba en los pocillos designados correspondientes de la placa. Ahora, usando una pipeta múltiple, agregue 150 microlitros de solución verde Pico a cada pocillo y mezcle la solución y las muestras de ADN.
Incube suavemente la placa en un área oscura durante dos a cinco minutos para que se desarrolle la reacción. Haga clic en el botón de la pantalla de visualización MPR para colocar la ventana de configuración de MPR en la parte superior de la pantalla y haga clic en el botón de posición de intercambio. La plataforma de retención de microplacas se moverá hacia la parte delantera del instrumento, abrirá la puerta del lector de microplacas y colocará la placa de 96 pocillos en la plataforma de retención con el pozo A hacia el frente y cerrará la puerta del lector de microplacas.
Haga clic en el botón de posición inicial para colocar la posición A de la microplaca en la posición de medición. Haga clic en el botón de visualización del monitor para colocar la ventana de medición en la parte superior de la pantalla. Haga clic en el botón de medición para comenzar a medir los patrones y muestras desconocidas.
Una buena curva de calibración se evalúa utilizando los diferentes parámetros proporcionados por el software F 7, 000. Por ejemplo, esta curva de calibración ideal obtenida para la cuantificación de ADN bicatenario utilizando el colorante verde Pico ha calculado un coeficiente de determinación de 0,99993. El sistema de alto rendimiento descrito es un ensamblaje en serie de tecnologías que incluyen Pico Green Dye, un espectrofotómetro fluorescente Hitachi F 7,000, equipado con un lector de microplacas y un programa de software para automatizar la recopilación de datos, el almacenamiento, los análisis y la presentación.
La combinación de tecnologías potentes puede abordar la creciente necesidad de analizar con precisión pequeñas cantidades de bicatenario. ADN.
Descripción general
Este artículo demuestra la cuantificación de ADN de doble cadena (dsDNA) utilizando el colorante PicoGreen y el espectrofotómetro de fluorescencia Hitachi F-7000 con lector de microplacas. El procedimiento describe la preparación de muestras, el ajuste del instrumento y los procesos de medición para obtener una curva de calibración lineal para la cuantificación de dsDNA.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Espectroscopía de fluorescencia
- Cuantificación de ADN
- Tecnología de lectores de microplacas
Antecedentes
- El colorante PicoGreen es un colorante fluorescente sensible utilizado para cuantificar ADN bicatenario.
- El Hitachi F-7000 es un espectrofotómetro de fluorescencia versátil.
- La cuantificación precisa del ADN es esencial para diversos experimentos biológicos.
- Los sistemas de alto rendimiento facilitan el análisis de múltiples muestras simultáneamente.
Objetivo del estudio
- Demostrar la capacidad del espectrofotómetro F-7000 para la cuantificación de ADN bicatenario.
- Establecer un método confiable para medir muestras desconocidas de ADN.
- Crear una curva de calibración lineal para una cuantificación precisa.
Métodos Utilizados
- Preparación del reactivo PicoGreen y de los patrones de ADN.
- Configuración de los parámetros del espectrofotómetro Hitachi F-7000.
- Carga de las muestras en el lector de microplacas.
- Medición de la fluorescencia para generar una curva de calibración.
Resultados principales
- Se estableció una curva de calibración lineal para la cuantificación de ADN bicatenario.
- El método demostró alta sensibilidad y precisión.
- Los resultados mostraron un coeficiente de determinación de 0.99993.
- El sistema analizó eficazmente pequeñas cantidades de ADN bicatenario.
Conclusiones
- La combinación del colorante PicoGreen y el espectrofotómetro F-7000 proporciona un método robusto para la cuantificación de ADN.
- Este enfoque de alto rendimiento satisface las exigencias de análisis precisos en la investigación biológica.
- El método puede aplicarse a diversos estudios que requieran mediciones precisas de ADN.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación precisa de ADN bicatenario es un requisito fundamental para la validación de objetivos, el desarrollo de ensayos y la generación de modelos preclínicos en la I+D de biofármacos. El espectrofotómetro de fluorescencia Hitachi F-7000 con el colorante PicoGreen permite la medición de ADN bicatenario con alta sensibilidad y alto rendimiento, facilitando la generación confiable de curvas patrón para aplicaciones posteriores. Este método proporciona confianza predictiva en la cuantificación de ácidos nucleicos, reduce la variabilidad en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano y posibilita la generación de datos escalables y reproducibles en estudios de cribado de compuestos y biomarcadores.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la medición precisa de concentraciones de ADN bicatenario para ensayos de clonación, transfección y validación de dianas basados en PCR.
- Valor operativo: Facilita la preparación y cuantificación reproducible de muestras, reduciendo la variabilidad técnica en experimentos basados en hipótesis.
- Valor predictivo: Genera curvas de calibración lineales con altos coeficientes de determinación (R² > 0,999), asegurando una cuantificación precisa de muestras desconocidas en estudios de interacción con la diana.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Proporciona lecturas cuantitativas de fluorescencia compatibles con formatos de 96 pocillos para la estandarización de ensayos y la titulación de reactivos.
- Valor operativo: Permite la medición rápida de 96 pocillos en menos de 60 segundos utilizando el modo cinético, facilitando la preparación para cribado de alto rendimiento.
- Escalabilidad: El software permite guardar y recuperar configuraciones de microplacas, facilitando un montaje de ensayos consistente entre equipos y proyectos.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Proporciona una cuantificación fiable de ADN bicatenario para el análisis de biomarcadores, validación de PCR y producción de vectores en modelos preclínicos.
- Reducción de Riesgos: La alta sensibilidad (50 picomoles de equivalente de fluoresceína) y el amplio rango dinámico (5 órdenes de magnitud) permiten una cuantificación precisa a través de series de dilución, reduciendo los falsos negativos en dianas de baja abundancia.
- Integración del Flujo de Trabajo: Genera datos en formatos de Excel o informes, facilitando la transferencia directa a tuberías bioinformáticas y analíticas.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la validación inicial del blanco hasta la identificación de compuestos activos y el desarrollo preclínico, donde la cuantificación precisa de ácidos nucleicos es esencial para la reproducibilidad experimental y la integridad de los datos.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis mediante la medición precisa de ADN bicatenario para evaluar la eficiencia de clonación, el análisis de expresión génica y estudios de mutagénesis.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos de fluorescencia reproducibles que respaldan la robustez del ensayo y la normalización de bibliotecas de compuestos.
- Análisis: Genera curvas de calibración lineales y coeficientes de determinación (R²) que permiten la comparación entre experimentos y el control de calidad.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante la cuantificación confiable de ADN en formulaciones farmacéuticas, vectores virales y ensayos de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Un software configurable y protocolos estandarizados permiten la reutilización entre departamentos, reduciendo el redesarrollo de métodos y aumentando la eficiencia operativa.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: La alta sensibilidad y especificidad para el ADN bicatenario reducen las señales falsas y mejoran la confianza en los datos en los ensayos moleculares.
- Valor operativo: La recopilación, almacenamiento y presentación automatizadas de datos mediante software minimizan el manejo manual y los errores de transcripción.
- Valor estratégico: La cuantificación confiable respalda las decisiones de continuar o descartar compuestos en la optimización de fármacos al garantizar una dosificación y normalización precisas en los ensayos funcionales.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo al proporcionar datos fiables sobre ácidos nucleicos para la selección de candidatos y estudios de formulación.
Consideraciones de Implementación
- Requiere conocimientos previos sobre espectroscopía de fluorescencia y manejo de lectores de microplacas.
- Exige acceso a un espectrofotómetro Hitachi F-7000 con accesorio para lector de microplacas y software compatible.
- Requiere preparación estandarizada de reactivos (dilución de PicoGreen en tampón TE) y manejo cuidadoso de las muestras para evitar el apagado de la fluorescencia.
- Implica la optimización del tiempo de incubación (2–5 minutos en oscuridad) y de los parámetros de longitud de onda (Excitación a 480 nm, Emisión a 520 nm) para garantizar consistencia en la señal.
- Incluye limitaciones prácticas, como la necesidad de incubación en oscuridad y la posible interferencia debida a contaminantes o disolventes orgánicos.
