Name: La cuantificación de ADN de doble cadena con el Hitachi F-7000 espectrofotómetro de fluorescencia y Dye PicoGreen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Aprende a cuantificar ADN de doble cadena con el espectrofotómetro de fluorescencia Hitachi F-7000 y el tinte PicoGreen. Este método establece una curva de calibración lineal con alta sensibilidad para muestras biológicas.

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1. Instrumento de configuración <ol><li> Encienda el espectrofluorómetro y permitir que se caliente por 1 hora. </li><li> Uso de Excel crea un archivo con las normas y los datos de la muestra, como se muestra en la Figura 1 y guardarlo en valores separados por comas formato "CSV". <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1. Las normas y los datos de las muestras. </li><li> Establecer fluorómetro de la siguiente manera: <ol><li> Haga clic en el <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon1.jpg" alt="Icon 1"> botón, se abrirá la ventana Método de Análisis, que se muestra en la Fig. 2. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig2.jpg" alt="Figura 2"> Figura 2. Análisis ventana del método de la ficha General. Realice las selecciones siguientes: <ul><li> En la "medición", seleccione Fotometría del menú desplegable. </li><li> En el "operador", escriba el nombre del operador que sean procedentes. </li><li> No hay necesidad de introducir información en el "instrumento" de campo. Este es seleccionado automáticamente por el software. </li><li> El "muestreo" de campo está inactivo cuando se utiliza el lector de microplacas. </li><li> Introduzca los comentarios que es posible que desee incluir en el informe en el campo "Comentarios". </li><li> En el "accesorio", introduzca la información relacionada con los accesorios utilizados para esta prueba. </li><li> Nota de los botones en la parte derecha de la ventana. </li><li> El botón "Load" permite cargar previamente guardado métodos de análisis. </li><li> El botón "Guardar" permite la actualización de un conjunto de parámetros de prueba o de un método de análisis previamente guardado y cargado, utilizando el mismo nombre. </li><li> La opción "Guardar Como" botón permite guardar un nuevo conjunto de parámetros de prueba o de un método de análisis bajo el nombre que desee. </li></ul> Ahora haga clic en la "cuantificación" ficha, ver Figura 3 y realice las selecciones siguientes. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig3.jpg" alt="Figura 3"> Figura 3. Análisis de ventana Método, ficha cuantificación. <ul><li> En el "tipo de cuantificación", seleccione la longitud de onda. Esto indica que la lectura de fluorescencia se realizará mediante la longitud de onda seleccionada. </li><li> En el "tipo de calibración", seleccione una orden de st. </li><li> En el "número de longitudes de onda", seleccione 1. </li><li> En la "unidad de concentración", introduzca ng / mL. </li><li> Deje sin seleccionar las casillas de "Calibración manual" y "Fuerza a través de la curva de cero". </li><li> En el "dígito después del punto decimal", seleccione 2. </li><li> En el "límite inferior de concentración", introduzca 0. </li><li> En el campo "Límite superior de concentración, entre 10.000. </li></ul> Ahora haga clic en el "Instrumento" y realice los siguientes selecciones. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig4.jpg" alt="Figura 4"> Figura 4. Método de análisis ventana, pestaña Instrumento <ul><li> En el "modo de datos:", seleccione fluorescencia. </li><li> La "velocidad de cortar" el campo está inactivo en este momento, sólo se utiliza para las mediciones de la fosforescencia. </li><li> En el "modo de longitud de onda", seleccione fijos WL. </li><li> En el "EX / WL1" escriba 480nm. </li><li> En el "EM / WL1" escriba 520 nm. </li><li> Todos los demás campos de acuerdo con el antiguo y EM están inactivos en este momento. </li><li> En el "corte EX" de selección de campos 5.0nm del menú desplegable. </li><li> En el "EM raja" de selección de campos 5.0nm del menú desplegable. </li><li> Deje sin seleccionar la casilla delante de la "tensión PMT 1-1000V" sobre el terreno. </li><li> En el "voltaje PMT", seleccione 700V desde el menú desplegable. </li><li> En el "Auto Calc estadística. Número" de selección de campos 2. </li><li> En la "Replica" de selección de campos 1. </li><li> En el "Tiempo de integración" de selección de campos 0.1s. &lt;/ Li&gt; </li><li> En el "retardo" escriba o seleccione 0. </li></ul> Haga clic en la ficha "Monitor". <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig5.jpg" alt="Figura 5"> Figura 5. Método de análisis ventana, en la ficha Monitor. <ul><li> En el "eje Y", "Max:", seleccione 10000 </li><li> En el "eje Y", "Min:", seleccione 0. </li><li> Seleccione la casilla a la izquierda de los "datos abiertos de procesamiento después de la adquisición de datos". </li><li> Deje sin seleccionar la casilla a la izquierda del "Informe de impresión después de la adquisición de datos", a menos que desee un informe que se imprime automáticamente después de las lecturas se han completado. </li></ul> Haga clic en el "Informe" ficha, vea la Figura 6. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig6.jpg" alt="Figura 6"> Figura 6. Ventana de análisis de métodos, informes de tablas. <ul><li> En la "Salida", seleccione Imprimir informe del menú desplegable. También puede seleccionar "Usar Microsoft Excel" si desea que los datos exportados a Excel, o "Imprimir Hoja de uso del generador" si se utiliza el complemento opcional en el programa generador de informes que permitan la generación de informes personalizados de hecho. </li><li> Haga clic en las casillas de los elementos que desea incluir en el informe. </li><li> Para guardar todos los parámetros seleccionados en las diferentes pestañas de la "Método de Análisis", haga clic de nuevo en la pestaña "General" y guardarlas en un nombre de archivo y en un lugar donde se puede encontrar para su uso futuro, y haga clic en el " Aceptar "para cerrar esta ventana. </li><li> Esto completa el ajuste de los parámetros de prueba del instrumento. </li><li> Ahora vamos a configurar el lector de microplacas. </li><li> Haga clic en el <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon2.jpg" alt="Icon 2"> botón, lo que traerá la ventana de Configuración de TPM en la parte superior. </li></ul> Seleccione los pozos de las normas y las muestras en la configuración del MPR ventana / pestaña Plate, como se muestra en la Figura 7. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig7.jpg" alt="Figura 7"> Figura 7. MPR ventana de Configuración, la ficha de la Plata. <ul><li> Haga clic en la posición A1 y arrastre el ratón para E1, a continuación, haga clic en el <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon3.jpg" alt="Icon 3"> botón. Se seleccionará las posiciones que se utilizarán para las normas. Esas posiciones se resaltan en color verde. </li><li> Ahora tenemos que seleccionar F1 posiciones de H3 para las muestras. Haga clic y arrastre el ratón a partir de la posición de F1, a la posición de H3 y luego haga clic en el <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon4.jpg" alt="Icon 4"> botón, se destacan las posiciones en color amarillo. </li><li> A continuación, repita la misma operación para las posiciones de A2 para el E3, para seleccionar las posiciones para las mediciones de la muestra. </li><li> Ahora, vamos a cargar el archivo separado por comas variable (csv) preparado de antemano con las normas y la información de la muestra. </li></ul> Haga clic en la "información bien" ficha de la "Ventana de Configuración de TPM", como se muestra en la Figura 8. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig8.jpg" alt="Figura 8"> Figura 8. MPR ventana de Configuración, pestaña Información del Pozo. <ul><li> A continuación, haga clic en el <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon5.jpg" alt="Icono de 5"> botón. Una ventana del explorador de Windows se abrirá el cual, como se muestra en la Figura 9, que permitirá localizar el "Bien information.csv" archivo y lo carga. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig9.jpg" alt="Figura 9"> Figura 9. Cargando información de la muestra así. Después de cargar el "Bien de información" del archivo, la "información bien" se verá como se muestra en la Figura 10 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig10.jpg" alt="Figura 10"> Figura 10. Cargado de información muestra. </li></ul></li></ol></li></ol> 2. Ensayo Picogreen Preparación de la muestra <ol><li> Preparar 1X buffer TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) mediante la adición de 1 ml de tampón 20 X TEa 19 ml dl H 2 O. </li><li> Prepare la solución de Reactivo PicoGreen añadiendo 50 L 200 X reactivo PicoGreen a 9,95 ml de tampón 1 x TE. </li><li> Elaborar normas (Lambda dsDNA) al hacer diluciones seriadas de ADN de doble cadena de valores (100 mg / mL). En primer lugar se prepara una solución de 50 mg / ml dsDNA por la adición de 25 l de ADN de doble cadena de valores (100 mg / mL) y 25 l 1 x tampón TE. A continuación, preparar las soluciones estándar mediante la adición de los volúmenes indicados de ADN de doble cadena y el tampón que se enumeran en la siguiente tabla: <table border="1"><tbody><tr><td> Concentración de ADN de doble cadena </td><td> Volumen de ADN de doble cadena </td><td> Volumen de Buffer </td></tr><tr><td> 1 mg / ml </td><td> L 20 de 50 ug / ml dsDNA </td><td> 980 l 1 x tampón TE </td></tr><tr><td> 0,1 mg / ml </td><td> 100 L de 1 mg / ml de ADN de doble cadena </td><td> 900 l 1 x tampón TE </td></tr><tr><td> 0,01 mg / ml </td><td> 100 L de 0,1 mg / ml de ADN de doble cadena </td><td> 900 l 1 x tampón TE </td></tr><tr><td> 0,001 mg / ml </td><td> 100 L de 0,01 mg / ml dsDNA </td><td> 900 l 1 x tampón TE </td></tr></tbody></table></li></ol> 3. Medición de Estándares y de fluorescencia de muestras <ol><li> Pipetear 150 L de cada patrón en los pozos A1-E1 de una placa y 96, por la figura 7, y de acuerdo con la siguiente tabla: <table border="1"><tbody><tr><td> Bien </td><td> Estándar </td></tr><tr><td> A1 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> B1 </td><td> 0,1 mg / ml </td></tr><tr><td> C1 </td><td> 0,01 mg / ml </td></tr><tr><td> D1 </td><td> 0,001 mg / ml </td></tr><tr><td> E1 </td><td> 1 x tampón TE </td></tr></tbody></table></li><li> Pipeta de 150 muestras l desconocido en los pozos de F1 a H3, que se muestra en la Figura 7 </li><li> Vierta la solución PicoGreen preparado en el paso 1.2 en un canal diseñado para su uso pipeta multicanal. Utilice una pipeta multicanal para entregar 150 l solución PicoGreen a los pozos A1-H3. Mezcle la solución y las normas suavemente con una pipeta. </li><li> Coloque la placa en un lugar oscuro y esperar 2-5 minutos para la reacción a desarrollar. </li></ol> 4. Resultados representante Una buena curva de calibración se evalúa con los diferentes parámetros proporcionados por el software F-7000 en la medición de las normas y el cálculo de la curva de calibración por software. El coeficiente de determinación indica la bondad del ajuste de los estándares de medida y la curva de calibración calculado. Cuanto más cerca de este valor es "1", el mejor es el ajuste de los valores medidos y la curva de calibración. Si el valor está lejos de ser "1", las normas deben medirse de nuevo, preparado de nuevo, o cambiar la aptitud de la curva de calibración. La figura 11 muestra un ejemplo de una curva de calibración con un coeficiente de determinación calculado = 0,99993, que se obtiene para la cuantificación de ADN de doble cadena utilizando PicoGreen tinte. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig11.jpg" alt="Figura 11"> Figura 11. Ejemplo de curva de calibración de ADN de doble cadena.

<ol><li>Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+PicoGreen+reagent+and+development+of+a+fluorescence-based+solution+assay+for+double-stranded+DNA+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.</a> Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).</li>
</ol>

Luis A. Moreno y Kendra L. Cox son empleados de Hitachi Tecnologías de la América del Alto que produce el instrumento utilizado en este artículo.

Pipeteo cuidado durante la preparación de muestras, así como el uso de un espectrofotómetro de fluorescencia estable y sensible es esencial para obtener buenos resultados y reproducible. En el caso del espectrofotómetro de fluorescencia utilizado para esta prueba, se sugiere con 300 l de volumen final de la muestra en el lector de microplacas. Un menor volumen disminuye la sensibilidad, y un mayor volumen puede causar la contaminación cruzada entre los pozos.

<table><tbody><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O destilada</td><td>Reactivo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo Quant-iT Picogreen para ADN bicatenario de Invitrogen</td><td>Reactivo</td><td></td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Placas microfluorométricas Nalge Nunc n.º de pieza 237108</td><td>Material</td><td></td><td>237108</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal Eppendorf de 12 canales</td><td>Material</td><td></td><td>3516677</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Eppendorf de 1000 &amp;mu;L</td><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Eppendorf de 200 &amp;mu;L</td><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica de 10 mL</td><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foil de aluminio</td><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta</td><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro de fluorescencia Hitachi F-7000 con FL Solutions 2.1</td><td>Equipo</td><td></td><td>5J1-0003</td><td></td></tr><tr><td>Accesorio para lector de microplacas para F-7000</td><td>Equipo</td><td></td><td>5J0-0139</td><td></td></tr></tbody></table>

la cuantificación de adn de doble cadena con el hitachi f-7000 espectrofotómetro de fluorescencia y dye picogreen

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

La cuantificación de ADN, especialmente en pequeñas concentraciones, es una tarea importante con una amplia gama de aplicaciones biológicas incluyendo ensayos estándar de biología molecular como la síntesis y purificación del ADN, las aplicaciones de diagnóstico, tales como la cuantificación de los productos de amplificación de ADN, y la detección de moléculas de ADN en las drogas preparativos. En este video vamos a demostrar la capacidad del espectrofotómetro Hitachi F-7000 de fluorescencia equipado con un accesorio lector de placas Micro para llevar a cabo la cuantificación dsDNA utilizando sondas moleculares Quant-que PicoGreen kit de reactivos de tinte. El espectrofotómetro de fluorescencia F-7000 ofrece una alta sensibilidad y mediciones de alta velocidad. Es un sistema altamente flexible, capaz de medir la fluorescencia, luminiscencia y fosforescencia. Varios modos de medición están disponibles, incluyendo la longitud de onda de escaneo, el tiempo de exploración, la fotogrametría y la 3-D de medición de análisis. El espectrofotómetro tiene una sensibilidad en el rango de 50 picomoles de fluoresceína cuando se utiliza un volumen de muestra de 300 l en el micro, y es capaz de medir velocidades de escaneo de 60.000 nm / minuto. También cuenta con un amplio rango dinámico de hasta 5 órdenes de magnitud que permite el uso de curvas de calibración en un amplio rango de concentraciones. El sistema óptico utiliza toda la óptica reflectante para la máxima energía y sensibilidad. El rango de longitud de onda estándar es de 200 a 750 nm, y se puede ampliar a 900 nm cuando se utiliza uno de los fotomultiplicadores opcional infrarrojo cercano. El sistema permite el control de temperatura opcional para el lector de placas de 5 a 60 grados Celsius, usando un control de temperatura opcional externa recirculación de líquidos. El lector de microplacas permite el uso de 96 microplacas bien, y la medición de la velocidad de 96 pozos es menos de 60 segundos cuando se utiliza el modo de cinética. Controles de software para el F-7000 y lector de microplacas son también muy flexible. Las muestras se pueden configurar en cualquiera de los formatos de columna o fila, y cualquier combinación de los pozos pueden ser elegidos para las mediciones de la muestra. Esto permite una utilización óptima de la microplaca. Además, el software permite importar configuraciones de muestra micro placa creada en Excel y se guarda en valores separados por comas, o en formato &quot;csv&quot;. Configuraciones de microplacas de medición se pueden guardar y recordar por el software para mayor comodidad y mayor productividad. Resultados de los datos se pueden enviar a un informe estándar, de Excel, o un programa Report Generator opcional.

Demostración de la cuantificación de ADN de doble cadena utilizando sondas moleculares PicoGreen tinte y Hitachi F-7000 Espectrofotómetro de fluorescencia equipado con un accesorio lector de microplacas.

La cuantificación de ADN de doble cadena con el Hitachi F-7000 espectrofotómetro de fluorescencia y Dye PicoGreen

La cuantificación del ADN, especialmente en concentraciones bajas, es una tarea importante con una amplia gama de aplicaciones biológicas que incluyen la biología molecular estándar...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la capacidad del espectrofotómetro fluorescente F 7,000 con lector de microplacas para realizar la cuantificación de ADN de doble cadena utilizando el colorante Pico green. Esto se logra primero preparando las muestras y los reactivos. El segundo paso del procedimiento consiste en configurar el instrumento.El tercer paso del procedimiento consiste en cargar las muestras en el lector de microplacas. El paso final del procedimiento es realizar la medición de los patrones y las muestras. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran una curva de calibración lineal, que podría utilizarse para la cuantificación de ADN bicatenario en muestras desconocidas.Encienda el espectrofluorímetro Hitachi F 7,000 para permitir que la lámpara de xenón se caliente durante una hora en Excel. Cree un archivo con los datos de los patrones y de las muestras y guárdelo en formato de valores separados por comas o formato CSV. Para configurar el espectrofluorímetro primero, haga clic en el botón de método que abre la ventana de método de análisis.En el campo de medición, seleccione fotometría en el menú desplegable. Ahora haga clic en la pestaña de cuantificación. En el campo de tipo de cuantificación, seleccione longitud de onda para indicar que la lectura de fluorescencia se realizará utilizando una longitud de onda especificada.Para el tipo de calibración, seleccione primer orden y, para el número de longitudes de onda, seleccione uno. Ingrese nanogramos por mililitro como unidad de concentración. Asegúrese de que no estén marcadas las casillas de calibración manual y forzar la curva a través de cero. Después del punto decimal, seleccione dos, ingrese cero para el límite de concentración inferior y 10 000 para el campo de límite de concentración superior.A continuación, haga clic en la pestaña del instrumento y en el campo de modo de datos, seleccione fluorescencia. Verifique que el campo de velocidad de corte esté inactivo, ya que solo se utiliza para mediciones de fosforescencia. En el campo de modo de longitud de onda, seleccione ambas WL fijas en el campo de WL de ex, ingrese 480 nanómetros en el campo de WL de EM.Introduzca 520 nanómetros. Deje todos los demás campos bajo EX y EM inactivos. Ajuste la rendija de EX y la rendija de EM a 5,0 nanómetros.Utilizando los menús desplegables, deje sin seleccionar la casilla del campo de voltaje del PMT de uno a 1000 voltios. Para el voltaje del PMT, seleccione 700 voltios en el menú desplegable. Además, seleccione dos para el número de cálculo de estadísticas automáticas, uno para réplicas, 0,1 segundos para el tiempo de integración y cero para el retraso.Ahora abra la pestaña de monitor y configure el campo máximo del eje y en 10.000 y el mínimo del eje y en cero. Luego, seleccione la casilla a la izquierda de procesar datos abiertos tras la adquisición de datos y, si es necesario, la casilla a la izquierda de imprimir informe tras la adquisición de datos para que un informe se imprima automáticamente al finalizar las lecturas. Finalmente, para guardar todos los parámetros seleccionados en las distintas pestañas de la ventana del método de análisis, haga clic en la pestaña general y guarde con un nuevo nombre de archivo en una ubicación especificada.Haga clic en el botón de aceptar para cerrar esta ventana. Esto finaliza la configuración de los parámetros de prueba del instrumento. Para configurar el lector de microplacas, haga clic en el botón MPR para traer la ventana de configuración del MPR al frente.Primero seleccione los pocillos para los patrones. Por ejemplo, haga clic en la posición A1 y arrastre el ratón hasta E1. Luego haga clic en el botón de conjunto de patrones.Esto seleccionará las posiciones que se utilizarán para los patrones, resaltadas en color verde. A continuación, seleccione las posiciones para las muestras. De forma similar, haga clic y arrastre el ratón sobre las posiciones correspondientes en la placa y luego haga clic en el botón de conjunto de muestras, lo que automáticamente resaltará las posiciones seleccionadas en amarillo.Continúe repitiendo la misma operación para las posiciones de las mediciones de muestra deseadas. Para cargar la información de los patrones y de las muestras en el archivo de variables separadas por comas preparado anteriormente, haga clic en la pestaña de información de pocillos de la ventana de configuración de MPR.Seleccione el botón de información del pocillo de carga y se abrirá una ventana de Windows Explorer para identificar el archivo csv de información de los pocillos. Después de cargar la información, la ventana debería mostrarla como una tabla. Para preparar una solución de trabajo del reactivo Pico Green, agregue 50 microlitros del reactivo Pico Green 200 X a 9,95 mililitros de tampón TE.Para la curva estándar, prepare diluciones seriadas de ADN bicatenario Lambda en tampón TE para concentraciones finales que varían de uno a 100 nanogramos por mililitro; pipete 150 microlitros de cada estándar en los pozos designados de una placa de 96 pozos. A continuación, pipete 150 microlitros de cada muestra de prueba en los pozos correspondientes designados de la placa. Ahora, utilizando una pipeta multicanal, agregue 150 microlitros de solución Pico Green a cada pozo y mezcle la solución con las muestras de ADN.Incube suavemente la placa en un área oscura durante dos a cinco minutos para que se desarrolle la reacción. Haga clic en el botón de la pantalla del MPR para traer la ventana de configuración del MPR al frente de la pantalla y haga clic en el botón de intercambio de posición. La plataforma portaplacas se moverá hacia la parte frontal del instrumento, abrirá la puerta del lector de microplacas y colocará la placa de 96 pocillos sobre la plataforma portadora con el pocillo A1 orientado hacia el frente, luego cerrará la puerta del lector de microplacas.Haga clic en el botón de posición inicial para colocar la posición A de una de las microplacas en la posición de medición. Haga clic en el botón de visualización del monitor para traer la ventana de medición al frente de la pantalla. Haga clic en el botón de medición para comenzar a medir los patrones y las muestras desconocidas.Una curva de calibración adecuada se evalúa utilizando los diferentes parámetros proporcionados por el software F 7,000. Por ejemplo, esta curva de calibración ideal obtenida para la cuantificación de ADN de doble cadena utilizando el colorante Pico Green tiene un coeficiente de determinación calculado de 0,99993. El sistema de alto rendimiento descrito es un ensamblaje en serie de tecnologías que incluye el colorante Pico Green, un espectrofotómetro de fluorescencia Hitachi F 7,000 equipado con lector de microplacas y un programa informático para automatizar la recopilación, el almacenamiento, los análisis y la presentación de datos.La combinación de tecnologías potentes puede abordar la creciente necesidad de analizar con precisión pequeñas cantidades de ADN bicatenario.

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