Name: Entrega directa de Morpholinos FOMIN Hacia el otocyst pez cebra por inyección y electroporación afecta el desarrollo del oído interno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-07T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Aprende a entregar morfolinos al otoquiste de pez cebra mediante microinyección y electroporación para estudiar el desarrollo del oído interno. Este método permite analizar efectos específicos sobre las células ciliadas sensoriales.

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Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación de Investigación de la Sordera Yc S y la NSF (IOS 0930096) con el KFB. KFB: NIH / 2 NINDCD RO1 DC04184, <a href="https://commons.era.nih.gov/commons/genericStatus.do?actionRole=nonPI&amp;applID=7854446&amp;uhf-token=Ugf7JvudZTCbTUW9jSAR1snMUgg%3D">3R01DC004184-08W1</a> , NSF DBI 0832862, NSF IOS 0930096

1. Electrodos para la toma de electroporación <ol><li> Cortar 75 m de diámetro de alambre de tungsteno (AM Systems, Inc. Carlsborg, WA) de longitud adecuada (alrededor de 5.3 cm) </li><li> Poner alambre de tungsteno a través de cable conector molex (latón estampado pin) </li><li> Envuelva los cables de tungsteno y el conector del cable molex con tubo retráctil (SPC Technology, Chicago, IL) y aplicar calor con quemador Bunsen o una pistola de calor para sellar el tubo de la reducción al cable </li><li> Para afilar la punta del alambre de tungsteno, sumergir el alambre en hidróxido de sodio 1,0 N (Conrad et al. 1993) y, con un clip en el otro electrodo, electrolizar el alambre con un Electroporador onda cuadrada. Las condiciones que utilizamos son 5 de 50 voltios con una duración de impulsos de 100 ms con 50 ms entre pulsos. Los electrodos deben ser afilados con un diámetro de 15-20 micras </li><li> Mantenga los cables en una bandeja en las ranuras presionado en arcilla antes de su uso en la electroporación </li></ol> 2. Configurar la estación de electroporación <ol><li> Cinta afilada 75μm electrodos de tungsteno para micromanipulador (instrumentos de precisión Mundial). </li><li> Micromanipuladores lugar a ambos lados de la platina del microscopio de disección (Leica). </li><li> Conectar los electrodos a una Proteger CUY-21 Electroporador Edición de onda cuadrada (Figura 1). </li><li> Encienda el electroporador y establecer parámetros para la electroporación, como el voltaje, la duración del pulso, y el número de pulsos. Los parámetros más eficaces para este experimento se encontró que tres de 13 voltios de pulsos que se prolongó durante cada 5.0ms, con 100 ms entre cada pulso. Si electroporación crea burbujas de aire en el embrión, reducir la duración del pulso. </li></ol> 3. Microinyección de Morpholinos Dentro vesícula ótica pez cebra <ol><li> Embriones de pez cebra de la cosecha de un estanque de cría. Incubar los embriones en el embrión de conciencia medio con 0,3 ppm de azul de metileno (Westerfield, 2005) a 28,5 ° C durante la noche. </li><li> Tire las agujas de cristal con un extractor de Sutter P-97 electrodos </li><li> Calentar una base de gel de agarosa (agarosa al 1% en los peces de agua en un 10 mm placa de Petri) a 37 ° C en un baño de agua </li><li> Calentar 1% de agarosa de bajo punto de fusión (LMPA) en peces de agua hasta que se derrita y mantenerlo caliente en el baño de agua a 37 ° C. </li><li> Llene una aguja de vidrio con una solución de morfolino (GeneTools, Corvallis, Oregón) y cortar la punta de diámetro apropiado. Monte la aguja de inyección en un micromanipulador (Kuhn). </li><li> Cortar punta de la aguja de aproximadamente 10 micras y se inyecta en aceite mineral para asegurarse de que la punta permite la entrega suficiente de solución de morfolino. </li><li> Dechorinate embriones a las 24 horas postfertilización (HPF) y anestesia con MS222 (tricaína, Sigma) en agua 0,3 PPM pescado azul de metileno. </li><li> Alinear 3 a 5 embriones anestesiado en la base de gel de agarosa con el lado derecho para el análisis uniforme conveniente </li><li> Ponga 1 a 2 gotas de 1% sobre LMPA cada embrión y dejar solidificar a fijar el embrión en su lugar </li><li> Gire la placa de Petri para que la vesícula ótica se encuentra en el lado derecho </li><li> Coloque la aguja en el lumen de la vesícula ótica e inyectar la solución morfolino con un neumático PicoPump PV820 (Instrumentos del Mundo de Precisión) con un tanque de nitrógeno unido (Figura 2) </li></ol> 4. Electroporación procedimiento <ol><li> Mueva los embriones montado en la estación de electroporación inmediatamente después de la inyección </li><li> Coloque el electrodo positivo en el tejido que está por detrás de la vesícula ótica, pero no penetran, insertar el electrodo negativo en el cerebro, justo por delante de la vesícula ótica </li><li> Aplicar actual mediante un pedal o pulsar un interruptor. </li><li> Vierta el agua los peces de agarosa y eliminar los embriones de agarosa con remolinos y una pipeta de vidrio. Tenga cuidado de no dañar los embriones. Para los embriones que son difíciles de eliminar, el uso de una aguja para romper con suavidad a la basura cualquier LMPA que rodea al embrión. </li><li> Embriones a cabo en un plato con pescado de agua azul de metileno y elevar los embriones a los escenarios deseados para el análisis (morfológico, inmunohistoquímico, en anlaysis hibridación in situ, etc y microscópicas). </li></ol> 5. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Estación de electroporación. Los electrodos se realiza mediante cables de tungsteno afilada 75μm y conectados por cables a una Proteger CUY-21 Electroporador onda Editar Square. Estos electrodos fueron grabadas a micromanipulador. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Estación de inyección. Todos los embriones fueron inyectados en el oído derecho, para fines de normalización. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Faloidina tinción de los filamentos de actina con 3 embriones fdd. (A) El embrión 3 fdd injected con el control de MO tiene una fuerte tinción de phalloidin en la mácula posterior (pm). (B) El embrión que fue inyectado con el control de MO y luego electroporated tenían niveles similares de tinción phalloidin en la tarde en los embriones de inyección única. (C) Inyección de la OM del FOMIN en la vesícula ótica por sí sola no causa la reducción de la tinción phalloidin, mientras que la inyección de MOs FOMIN junto con la electroporación causado una drástica reducción de la tinción phalloidin en la tarde (D). am, mácula anterior. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Manchas faloidina de filamentos de actina con larvas DPF 5. No hubo diferencias entre la inyección única (A) y la inyección con la electroporación, cuando la norma morfolino de control se utilizó (B). Sin embargo, las larvas DPF 5 que fueron inyectados con mif morfolinos y electroporated demostraron una reducción de tinción phalloidin en la mácula posterior (pm) (D), aunque menos pronunciado que tres fdd, cuando se compara con el embrión que fue inyectado con mif morfolinos sólo (C ). am, mácula anterior. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Tinción tubulina acetilada de los embriones a los 3 fdd. El embrión en (A) no recibió ninguna inyección o electroporación. El embrión en (B) se electroporated pero no recibió ninguna inyección. Los embriones que reciben tanto de la inyección y la electroporación (C, D) con mif morfolinos había disminuido visiblemente manchas tubulina en comparación con los controles. (Por la tarde, la mácula posterior). <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Tinción tubulina acetilada de los embriones a los 3 fdd con el control de morfolino. (A) de embriones sin ningún tipo de tratamiento mostraron una fuerte tinción tubulina acetilada en la mácula posterior (pm) y la inervación extensa. (B) de embriones inyectados con el control de morfolino. (C) de embriones tratados con la electroporación solamente. (D) de embriones de control con el control de morfolino inyectado y electroporated tiene niveles similares de tubulina acetilada en la mácula y la inervación posterior comparación con el control sin tratamiento.

<ol><li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).</li>
<li>Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+essential+for+axis+formation+and+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development.</a> J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).</li>
<li>Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+placode+to+polarization%3A+new+tunes+in+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">From placode to polarization: new tunes in inner ear development.</a> Development. 131, 4119-4135 (2004).</li>
</ol>

La producción de este artículo fue patrocinado por Gene Herramientas, LLC, que producen los reactivos mencionados en el video y el texto.

Hemos introducido con éxito MOs oligonucleótidos antisentido en el oído del embrión de pez cebra 24 HPF. Los embriones que se plantearon después de la inyección y la electroporación fueron viables. Si los embriones sobrevivieron a la electroporación, que creció a un ritmo normal, comparado con los embriones que no habían recibido tratamiento, así como los embriones que sólo había sido inyectado y embriones que habían sido sólo electroporación. Hemos observado los efectos de la MIF y MIF-OM como el oído después de la inyección y la electroporación mediante el etiquetado con phalloidin y tubulina acetilada. Tinción phalloidin de filamentos de actina en las células ciliadas de la mácula posterior indica que la electroporación de MIF y MIF-MO como en la etapa 24 HPF causado cambios en la célula de pelo y / o números de estereocilios en comparación con los embriones que fueron inyectados sólo con el OM (Figura 3). Esta disminución en el número de células de cabello es consistente con los hallazgos de Shen et al. (Presentado) que MOs para MIF y MIF-como causa una reducción en el número de células ciliadas de la mácula sacular. La disminución del número de células de cabello en los embriones que fueron inyectados con OM y electroporated demostrar que la electroporación puede ayudar a mover el OM a través de la membrana celular, lo que aumenta el alcance de los efectos morfológicos en comparación con los embriones en los que se inyectó la vesícula ótica solamente. Los cambios en la morfología del ganglio statoacoustic se observaron mediante la tinción tubulina acetilada. El grado de inervación por el ganglio statoacoustic se vio afectada, ya que los embriones que fueron inyectados y electroporated muestran una disminución en la ramificación de las neuritas (Figura 5). También puede haber disminución de la condensación de las células ganglionares y / o disminución del número de células ganglionares, ya que la tinción tubulina acetilada se redujo significativamente en los embriones que fueron inyectados y electroporación. Debido a que el FOMIN ha demostrado ser fundamental para el desarrollo del sistema nervioso (Suzuki et al., 2004), los cambios observados después de la electroporación puede ser el resultado de la transfección aumento de la MIF y MIF-MO como solución a las células neuroblast. Electroporación de antisentido oligo morfolinos directamente en un tejido en desarrollo es una herramienta útil para controlar la expresión de un gen durante el desarrollo de ese tejido, tanto espacial como temporalmente, en el embrión. Electroporación de MIF y MIF-como Mos en los tejidos del oído interno como resultado de la morfología anormal de la mácula tanto posterior y el ganglio statoacoustic. Hubo una reducción en el número de células ciliadas de la mácula posterior de los embriones que habían sido inyectados y electroporación en comparación con los embriones que habían recibido ningún tratamiento o con los embriones que habían sido inyectados o sólo electroporated solamente. También hubo una disminución en el grado de inervación de la revisión posterior por el ganglio sensorial statoacoustic y el tamaño de la SAG. La electroporación es un método valioso para la transfección de las macromoléculas en tejidos específicos, con la ventaja de observar los efectos primarios de ese particular de ADN, el ARN, o MO en el tejido deseado y la discriminación de estos efectos secundarios en otros tejidos, incluyendo el cerebro, la cresta neural y mesénquima periotic en el desarrollo del oído interno (Barald y Kelley, 2004).

<ol><li> OM: 0,3 mM de una combinación de la MIF, FOMIN-como MO1, y el FOMIN-como MO2 se utilizó. Mif MO es gratuito para el codón de inicio de pez cebra de mRNA del FOMIN: 5&#39;-acatcggcatgactgcgacagagat-3 &#39;. Dos MOs fueron utilizados para el FOMIN como mif-como MO1 es gratuito en el sitio de inicio de traducción:. 5&#39;-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3 &#39;, mientras que el FOMIN como MO2 derivado de que la secuencia en la intron1/exon dos límites: 5&#39;-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC -3 &#39;. Control de MO fue la secuencia de nucleótidos de Herramientas revueltos Gene: 5&#39;-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3 &#39;. </li><li> azul de metileno (0,3 ppm) en los peces de agua </li><li> MS222 (tricaína, Sigma; 0,64 mm en los peces de agua) </li><li> Bajo punto de fusión de agarosa (LMPA; Roche) </li><li> rojo fenol (Sigma) </li><li> Anti-tubulina acetilada (Sigma) </li><li> Alexa Fluor ® 488 cabra anti-ratón segundo anticuerpo (sondas moleculares) </li><li> Texas rojo-phalloidin (sondas moleculares) </li></ol>

entrega directa de morpholinos fomin hacia el otocyst pez cebra por inyección y electroporación afecta el desarrollo del oído interno

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

En los últimos años, la electroporación se ha convertido en una técnica popular para la transfección in vivo del ADN, el ARN y morfolinos en varios tejidos, incluyendo el ojo, el cerebro y somitas de pez cebra. La ventaja de la electroporación sobre otros métodos de manipulación genética es que los tejidos específicos puede ser objetivo, tanto espacial como temporalmente, para la introducción de las macromoléculas de la aplicación de corriente eléctrica. A continuación se describe el uso de la electroporación para transfectar mif y morfolinos mif-como en los tejidos del oído interno en desarrollo del pez cebra. En estudios anteriores, el FOMIN morfolino se inyectan en embriones en el 1 - al estadio de 8 células resultado en general los cambios morfológicos en el sistema nervioso y los ojos, así como el oído. Al dirigirse a los tejidos del oído interno en las etapas posteriores del desarrollo, podemos determinar los efectos primarios del FOMIN en el oído interno en desarrollo, en comparación con los efectos secundarios que pueden resultar de la influencia de otros tejidos. Mediante el uso de tubulina acetilada y phalloidin tinción para estudiar la morfología de las neuronas, los procesos neuronales y las células del cabello asociada con la mácula posterior, hemos sido capaces de evaluar la eficacia de electroporación como método de transfección dirigida en el oído interno del pez cebra. Las vesículas óticas de los embriones fueron inyectados con 24hpf morfolinos y electroporación y fueron comparados con los embriones que habían recibido ningún tratamiento o sólo se había inyectado o electroporación. Los embriones que fueron inyectados y electroporación mostró una disminución en el número de células de cabello, disminución de la inervación del ganglio statoacoustic (SAG) y menos neuronas SAG en comparación con los grupos control. Nuestros resultados mostraron que la entrega directa de morfolinos en otocysts en etapas posteriores se evita el sistema nervioso no específica y los efectos de la cresta neural de morfolinos en las fases celulares 1-8. También permite el examen de los efectos que se dirigen hacia el oído interno y no los efectos secundarios en el oído de los principales efectos en el cerebro, mesénquima de la cresta neural o periotic.

Un método para entregar morfolinos directamente en el pez cebra en otocyst 24hpf se ha desarrollado. Con microinyección de morfolinos en el lumen de la vesícula ótica y la electroporación para llevar a cabo la penetración, hemos sido capaces de evitar el efecto de morfolinos en el cerebro y obtener efectos específicos en el oído interno.

Entrega directa de Morpholinos FOMIN Hacia el otocyst pez cebra por inyección y electroporación afecta el desarrollo del oído interno

En años recientes, la electroporación se ha convertido en una técnica popular para la transfección in vivo de ADN, ARN y morfolinos en diversos tejidos, incluyendo el ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en administrar directamente en el oto del pez cebra, en la etapa de un día o 24 horas posteriores a la fertilización, moléculas antisentido, oligonucleótidos, morfolinos u otras que alteren el desarrollo. En este ejemplo, utilizamos morfolinos contra el neurotrófico más temprano responsable del desarrollo del ganglio acústico estático, una citocina del sistema inmunitario denominada factor inhibidor de la migración de macrófagos, o MIF, para determinar si los morfolinos dirigidos contra esta molécula afectan el desarrollo del oído interno o la neurogénesis. Esto se logra introduciendo primero los morfolinos en la luz de la vesícula ótica mediante microinyección, y luego se realiza una electroforesis que facilita la penetración de los morfolinos desde la luz hacia las células del oto.A continuación, los embriones se cultivan a 28,5 grados Celsius para observar los efectos de los morfolinos en el desarrollo del oído interno y en la neurogénesis. En los días siguientes, se obtienen resultados que muestran una disminución en las células ciliadas sensoriales del oído interno, así como una reducción en la inervación por el ganglio estatoacústico, según muestran la inmunohistoquímica y las tinciones con foid y coloración, que marcan la tubulina acetilada en las cinocilias y la actina en las estereocilias de la superficie de las células ciliadas, respectivamente. Originalmente desarrollamos este método de inyección y electro poración de morfolinos en el embrión de pollo junto con una estudiante universitaria muy talentosa del laboratorio.Katie Holmes logró reducirlo con éxito a las dimensiones del pez cebra. El equipo de investigación actual, que incluye a Yuchi, ella como posdoctoranda, y a Matt Wyatt, un estudiante de posgrado, y una ex posdoctoranda del laboratorio, Deb Thompson, refinó esta técnica para el pez cebra. Se espera que este método pueda responder preguntas clave en los campos de la biología del desarrollo y la investigación auditiva, incluyendo si es posible distinguir efectos morfológicos específicos sobre un sistema orgánico como el oído de los efectos generales del desarrollo que afectan a múltiples sistemas orgánicos y que son secundarios en el oído, por ejemplo, efectos sobre el cerebro que afectan secundariamente al oído.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como las microinyecciones en estadios de una a cuatro células es que este método introduce directamente los morfolinos en el oído en estadios posteriores. Así, los efectos directos de los morfolinos sobre la línea lateral, así como los efectos secundarios en el oído interno, pueden evitarse. Para fabricar los electrodos, comience cortando un alambre de tungsteno de 75 micrómetros de diámetro en trozos de aproximadamente tres a cinco centímetros de longitud. Pase el alambre de tungsteno a través de un conector de cable Molex.A continuación, envuelva los alambres de tungsteno y el conector del cable Molex con tubo termorretráctil y aplique calor con un mechero Bunsen o una pistola de calor para sellar el tubo termorretráctil al alambre. Luego, para afilar la punta del alambre de tungsteno, sumerja el alambre en hidróxido de sodio uno normal y, utilizando un clip de papel como el otro electrodo, electrólisis el alambre con un pulso cuadrado. Las condiciones que utilizamos son cinco pulsos de 50 voltios, cada uno de 100 milisegundos de duración, con intervalos de 50 milisegundos entre pulsos.Realice tres repeticiones con la punta del electrodo sumergida en la solución normal de hidróxido de sodio. Introduzca ligeramente más el electrodo en el hidróxido de sodio y realice una repetición adicional. Introduzca el electrodo aún más, avanzando aproximadamente la misma distancia en ambas ocasiones, y realice una última repetición.Este afilado graduado produce una punta muy fina en el electrodo, lo que permite una inserción de los electrodos en el embrión de pez cebra en desarrollo más precisa y con menos daño. Mantenga los alambres presionados en arcilla de modelar dentro de una bandeja antes de su uso para la electroforesis, para microinyectar morfos en las vesículas óticas del pez cebra. Primero prepare los tanques de apareamiento con un divisor de plástico para separar a los machos de las hembras por la tarde.Coloque cuatro machos y cuatro hembras en el tanque y deje el tanque en una sala de incubación con un ciclo de luz-oscuridad de 14 a 10 durante la noche. A la mañana siguiente, después de encender las luces, retire el divisor y deje a los peces sin perturbar durante aproximadamente 20 a 30 minutos. Separe los machos de las hembras y retire los reproductores del tanque de apareamiento.Póngalos en tanques que contengan agua fresca para peces. Recoge los embriones del tanque de reproducción vertiendo el agua que contiene los huevos a través de un colador. Enjuague los huevos en el colador varias veces con agua fresca para huevos antes de verterlos en una placa de Petri.Retire cualquier huevo no fertilizado u opaco e incube los embriones en medio de cultivo con azul de metileno al 0,3 PPm a 28,5 grados Celsius durante la noche mientras los embriones se incuban. Prepare agujas de vidrio con un extractor de electrodos Sutter P 97 justo antes de la inyección. Caliente una base de gel AROS compuesta de 1 % de agros en agua para peces en una placa de Petri de 10 milímetros hasta 37 grados Celsius en un baño de agua, 1 % de AGROS de punto de fusión bajo o LMPA en agua para peces hasta que se derrita y manténgala tibia en el baño de agua a 37 grados Celsius.Llene una aguja de vidrio con una solución de morfo y corte la punta hasta el diámetro adecuado. Aproximadamente entre 10 y 15 micrones. Monte la aguja de inyección en un micromanipulador que esté conectado a una bomba neumática Pico Pump PV820 con tanque de nitrógeno. Decote los embriones a las 24 horas posteriores a la fertilización y anestésielos con trica en agua para peces con azul de metileno al 0,3 PPM.A continuación, alinee tres a cinco embriones anestesiados sobre la base de gel AROS con el lado derecho hacia arriba para facilitar un análisis uniforme, coloque una o dos gotas de LMPA al 1 % sobre cada embrión y deje que solidifique para fijar el embrión en su lugar. Gire el plato de Petri de modo que la vesícula ótica quede en el lado derecho. Luego, introduzca la aguja en la luz de la vesícula ótica e inyecte la solución morfo utilizando el pedal del pie.Inmediatamente después de la microinyección, traslade los embriones montados a la estación de electroforesis para prepararla. Primero sujete con cinta las electrodos de tungsteno afilados de 75 micrómetros a los micromanipuladores. Luego coloque los micromanipuladores a ambos lados del platino del microscopio estereoscópico.Encienda el electro y configure los parámetros para la electrotransferencia. Los parámetros más eficaces para este experimento resultaron ser tres pulsos de 13 voltios de duración de dos milisegundos cada uno, con intervalos de 100 milisegundos entre pulso y pulso.Inserte los electrodos de manera que la vesícula ótica quede equidistante, con un electrodo superficial respecto a la vesícula ótica y el otro profundo respecto a ella. A continuación, aplique una corriente utilizando un pedal de pie o pulsando un interruptor cuando finalice la electroporación. Vierta agua para peces sobre los aros y retire los embriones utilizando una pipeta de vidrio y moviendo suavemente la placa en círculos.Tenga cuidado de no dañar los embriones que son difíciles de extraer. Utilice una aguja para romper suavemente cualquier APAML que los rodee. Transfiera los embriones a una placa con agua de pez azul de metileno y desarrolle los embriones hasta las etapas deseadas para la inmunohistoquímica morfológica.En la hibridación y análisis microscópico en C, se muestran aquí resultados representativos de la inyección y electroforesis de morfos en el oído. La mácula posterior o auditiva, etiquetada como PM, es uno de los órganos auditivos en el pez cuando se marca con Phin rojo. En esta fotografía, los haces de actina en las estereocilias de las células pilosas sensoriales aparecen como puntos rojos sobre la pelota de ping pong.La mácula con forma de pala observada mediante etiquetado fluorescente con Phin en un embrión de tres días post-fecundación inyectado con morfos de MIF muestra únicamente un mayor número de filamentos de actina dentro de las estereocilias de las células pilosas en comparación con embriones de la misma edad que fueron electro porados e inyectados. Sin embargo, la inyección y electro poración con el morfo control estándar no provocaron una reducción en la tinción de F ni en la señal fluorescente en comparación con la inyección del morfo únicamente. Los resultados son similares en la mácula posterior, aunque menos dramáticos tras cinco días en larvas que fueron inyectadas y electro poradas en comparación con el embrión inyectado únicamente con morfos de MIF.No hubo diferencia entre la inyección sola y la inyección con electroforesis cuando se utilizó la morfolina de control estándar. Este embrión, que fue teñido con un anticuerpo contra tubulina acetilada, no recibió ninguna inyección ni electroforesis de MIF Morfolinas. Este embrión fue electroforizado pero no recibió inyección alguna.Ambos embriones muestran tinción normal de tubulina acetilada. Ambos embriones fueron inyectados y electroporados. Presentaron una tinción de tubulina visiblemente reducida en comparación con los controles, así como muchos menos procesos neuronales asociados con el oído y los ganglios circundantes.Cuando se utilizó el morfolino de control para la inyección y la electroforesis, no observamos una reducción en la extensión de la tinción de tubulina acetilada, ni una disminución en la inervación por el ganglio acústico en comparación con la inyección del morfolino solo Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente dos horas si se lleva a cabo correctamente. La parte más difícil de dominar es la electroforesis; debe tenerse especial cuidado para no dañar el cerebro, aunque el uso de electrodos afilados ayudará a aliviar este problema.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Microinyección es un método bien establecido y eficaz para la introducción de sustancias extrañas en embriones de pez cebra fecundado. Este sentido, demuestran una sólida técnica de microinyección para la realización de la sobreexpresión de ARNm, y morpholino oligonucleótidos estudios caída de genes en el pez cebra.

Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

Este vídeo muestra cómo morfolino o ARNm puede ser inyectado en embriones de pez cebra en el estadio de una célula para aumentar o disminuir el nivel de productos específicos de genes durante el desarrollo posterior.

Microinyección de embriones de pez cebra para analizar la función génica

Un método para derribar condicionalmente la expresión de una proteína de destino en la retina del pez cebra adulto se describe, lo que implica la inyección intravítrea morfolinos antisentido y electroporating ellos en la retina. La proteína resultante es derribado por varios días, lo que permite realizar pruebas de función de la proteína en la regeneración o la retina intacta.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la retina de pez cebra adultos

Se describe un método para derribar condicionalmente la expresión de una proteína diana durante la regeneración de la aleta del pez cebra adulto. Esta técnica implica la inyección de micro y electroporación morfolinos antisentido de oligonucleótidos en el tejido de la aleta, que permite probar el papel de la proteína en varias etapas de regeneración de la aleta, incluyendo la curación de heridas, la formación blastema, y ​​consecuencia regenerativa.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la regeneración de adultos de pez cebra Aleta de cola

La oreja de ratón interno es un órgano sensorial placoda derivada del desarrollo cuyo programa se elaboró ​​durante la gestación. Se define...

Transferencia de genes a la oreja del ratón en desarrollo por el interior<em&gt; En Vivo</em&gt; La electroporación

El protocolo describe la eliminación dirigida de la expresión génica en el pez cebra mediante la inyección de morfolino en la cola.

Inyección de morfolino: un método para eliminar la expresión génica objetivo para estudiar la función en el pez cebra

En este artículo se demuestra un método para la manipulación de la expresión génica en las células ventriculares del telencéfalo adultos de pez cebra utilizando oligonucleótidos antisentido morpholino. Se presenta este método como un protocolo eficiente y rápida que puede ser utilizado para los estudios funcionales en el cerebro de los vertebrados adultos.

Micromanipulación de la expresión génica en el cerebro de pez cebra adulto Uso Microinyección cerebroventricular de oligonucleótidos Morpholino

Un método de genética inversa adaptable para el pez cebra para evaluar la función de genes durante las etapas posteriores del desarrollo y la homeostasis fisiológica, tales como la regeneración de tejidos usando inyecciones intraventriculares de morfolinos de genes específicos.

Invierta genética Enfoque Morpholino Usando ventricular cardíaca inyección para transfectar múltiples tejidos difíciles de conectar por objetivo en el pez cebra Larva

Usando electroporación in ovo , ideamos un método para transfectar selectivamente el oído interno auditivo y el núcleo coclear en embriones de pollo para lograr una eliminación específica del grupo celular de la proteína de retraso mental X frágil durante períodos discretos de ensamblaje del circuito.

Disección de la función autónoma celular de la proteína de retraso mental X frágil en un circuito auditivo mediante electroporación in ovo

En la inyección intraventricular Utero y electroporación de embriones de rata E16

Aprende a entregar morfolinos al otoquiste de pez cebra mediante microinyección y electroporación para estudiar el desarrollo del oído interno. Este método permite analizar efectos específicos sobre las células ciliadas sensoriales.

Entrega directa de Morpholinos FOMIN Hacia el otocyst pez cebra por inyección y electroporación afecta el desarrollo del oído interno (Video) | JoVE Journal

Entrega directa de Morpholinos FOMIN Hacia el otocyst pez cebra por inyección y electroporación afecta el desarrollo del oído interno

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